沒食子酸對恩諾沙星在鯉體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)及殘留的影響研究

李改娟,劉艷輝,陳偉強(qiáng),祖岫杰,戴 欣,趙全東,楊炳坤

(1.吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院,吉林長春130033;2.松遼流域水資源保護(hù)局,吉林長春130021)

沒食子酸對恩諾沙星在鯉體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)及殘留的影響研究

李改娟1,劉艷輝1,陳偉強(qiáng)1,祖岫杰1,戴 欣2,趙全東1,楊炳坤1

(1.吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院,吉林長春130033;2.松遼流域水資源保護(hù)局,吉林長春130021)

為研究沒食子酸與恩諾沙星聯(lián)合用藥及單用恩諾沙星在福瑞鯉Cyprinus carpio體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)及其殘留消除規(guī)律,采用平行對照試驗(yàn),將體質(zhì)量為(200±30)g的鯉隨機(jī)分為單用恩諾沙星組(對照)和聯(lián)合用藥組(沒食子酸與恩諾沙星質(zhì)量比為10∶1),試驗(yàn)水溫為26℃,各組均按2 mg/kg(體質(zhì)量)劑量的恩諾沙星單次混飼口灌給藥,于給藥后不同時(shí)間點(diǎn)采集鯉血漿、肌肉、肝胰臟、腎臟組織,采用高效液相色譜法測定各組織中恩諾沙星的濃度,并使用DAS 3.0藥物代謝動(dòng)力學(xué)軟件的非房室模型統(tǒng)計(jì)矩方法分析藥時(shí)數(shù)據(jù)。結(jié)果表明,沒食子酸能顯著增大鯉各組織對恩諾沙星的吸收效率,提高有效藥物濃度20.0％～44.9％,并加快了恩諾沙星的代謝和消除,240 h時(shí)聯(lián)合用藥組鯉血漿、肌肉組織中藥物殘留量比對照組分別降低了44.2％和34.1％。

鯉;恩諾沙星;沒食子酸;聯(lián)合用藥;藥代動(dòng)力學(xué);殘留

水產(chǎn)養(yǎng)殖病害問題一直是制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸,尤其是細(xì)菌性疾病的流行與暴發(fā),給水產(chǎn)養(yǎng)殖者造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。生產(chǎn)過程中對癥下藥固然能起到預(yù)期的效果,但同時(shí)也帶來了諸如藥物殘留影響水產(chǎn)品安全和大量用藥使病原體產(chǎn)生耐藥性等一系列問題。因此,在生產(chǎn)中研制高效安全的抗病藥物是目前亟待解決的難題。中草藥具有抑菌無殘留、無耐藥性、誘食和提高免疫力等作用[1],克服了化學(xué)藥物和抗生素類藥物的缺陷,但中草藥也存在用藥劑量大、療效慢等缺點(diǎn)。中西藥聯(lián)合應(yīng)用彌補(bǔ)了中草藥和抗菌素單味用藥的不足,既可增強(qiáng)治療效果、降低耐藥性的產(chǎn)生,又可保護(hù)環(huán)境、減少藥物殘留[2],具有較好的發(fā)展前景。盧靜等[3]對中藥單體和抗生素聯(lián)合用藥的藥效學(xué)進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)將沒食子酸和恩諾沙星聯(lián)合用藥,克服了上述單一用藥的缺點(diǎn),且該聯(lián)合用藥對嗜水氣單胞菌具有相加抑菌作用,對溫和氣單胞菌具有協(xié)同抑菌作用。在此基礎(chǔ)上,本研究中對沒食子酸和恩諾沙星聯(lián)合用藥與單用恩諾沙星在鯉體內(nèi)吸收、分布和消除情況進(jìn)行了比較,探討了中藥沒食子酸對恩諾沙星藥物代謝及殘留的影響,為制定合理的給藥方案和休藥期提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)魚為長春市九臺水產(chǎn)良種場提供的福瑞鯉Cyprinus carpio,體質(zhì)量為(200±30)g,試驗(yàn)前一周暫養(yǎng)在水族箱內(nèi)。

試驗(yàn)儀器主要有Waters ACQUITY UPLC超高液相色譜儀、XiangYi L-550離心機(jī)和IKA MS3 digital振蕩器。

試驗(yàn)藥品主要有乙腈(色譜純),KH2PO4、NaOH、HCOOH(均為分析純),恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品由中國獸藥監(jiān)察所提供,恩諾沙星原藥粉(含量不少于98.0％)由中國西安瑞特動(dòng)物藥業(yè)有限公司提供,試驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 用流動(dòng)相配制濃度為100μg/mL的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于冰箱中(4℃)避光保存。臨用前,分別用流動(dòng)相稀釋配制成濃度為0.01、0.05、0.10、2.00、20.00、100.00μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 混飼口灌給藥及樣品采集[4-5]試驗(yàn)設(shè)聯(lián)合用藥組和單用恩諾沙星組(對照組),在水溫為26℃條件下,中西藥聯(lián)合用藥組按沒食子酸和恩諾沙星質(zhì)量比為10∶1混合溶解后混入飼料中,加水?dāng)嚢璩珊隣?配制成一定濃度,單次混飼口灌給藥[以恩諾沙星計(jì),劑量為2 mg/kg(體質(zhì)量)];單用恩諾沙星的對照組按2 mg/kg(體質(zhì)量)的劑量單次混飼口灌給藥。灌入試驗(yàn)魚前腸后,無回吐者保留用于試驗(yàn),于給藥后0.17、0.33、0.50、0.75、1、2、4、6、12、16、24、72、144、288、384、480 h分別從每組取6尾魚,自尾靜脈采集血樣,將血樣置于含1％肝素的離心管中混勻、離心,分離上清液血漿,同時(shí)將魚處死,取其肌肉、肝胰臟、腎臟等組織,將所采集的血漿及組織樣品于冰箱(-20℃)中避光保存待測。

1.2.3 樣品前處理

(1)血漿樣品[6]。準(zhǔn)確吸取0.3 mL血漿樣品放入離心管中,依次向離心管中加入0.5 mL甲酸水溶液(0.1％)和甲醇,漩渦震蕩2 min,以8000 r/min離心5 min,上清液過0.22μm濾膜后待測。

(2)肌肉、肝胰臟、腎臟樣品。稱取搗碎的組織樣品(2.0±0.1)g置于50 mL塑料離心管中,加入10 mL酸化乙腈,漩渦震蕩2 min,超聲15 min,以4000 r/min離心10 min,將上清液轉(zhuǎn)移到雞心瓶中,在殘?jiān)屑尤?0mL酸化乙腈重復(fù)提取一次,合并上清液至雞心瓶中,45℃下水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸干,用1 mL流動(dòng)相溶解殘余物,加入1 mL正己烷去除脂肪,水相經(jīng)0.22μm濾膜過濾后待測。

1.2.4 液相色譜測定條件 Waters ACQUITY UPLC液相色譜儀的色譜柱為Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7μm),柱溫為35℃;流動(dòng)相為0.1％甲酸水溶液∶乙腈(體積比為90∶10),流速為0.5 mL/min,進(jìn)樣體積為5μL,熒光檢測器, λex為280 nm,λem為450 nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,采用DAS 3.0軟件進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)及模型擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的可靠性評價(jià)

按“1.2.3”節(jié)中的方法,對血漿、肌肉、肝胰臟和腎臟空白樣品進(jìn)行前處理后,空白樣品在恩諾沙星出峰處無干擾,標(biāo)樣色譜峰尖銳且對稱,檢出限、線性范圍、回收率、精密度均達(dá)到試驗(yàn)要求。

2.1.1 線性范圍、檢出限和定量限 分別取1.0、5.0、10.0、20.0、200.0μL恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)液于容量瓶中,用流動(dòng)相定容至100 mL,并用液相色譜儀進(jìn)行測定,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析,恩諾沙星濃度為0.01～100 μg/mL時(shí)有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2= 0.9999。根據(jù)加標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果,其檢出限(S/N≥3)血漿樣品為0.01μg/mL,肌肉、肝胰臟、腎臟樣品為2μg/kg,其定量限(S/N≥10)血漿樣品為0.03μg/mL,肌肉、肝胰臟、腎臟樣品為5 μg/kg。

2.1.2 準(zhǔn)確度與精密度 對福瑞鯉空白血漿、肌肉、肝胰臟、腎臟分別進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)添加試驗(yàn),添加濃度分別相當(dāng)于其定量檢出限的1、3、10倍。上述樣品經(jīng)“1.2.3”節(jié)前處理后上機(jī)測定,1 d內(nèi)測定6次,連續(xù)測定6 d,分別計(jì)算各批次日內(nèi)和日間的變異系數(shù)和回收率。結(jié)果表明,血漿回收率為90％～110％,其他組織為85％～110％,測定的日內(nèi)和日間變異系數(shù)為2.0％～4.5％。

2.2 恩諾沙星在鯉血漿中的藥代動(dòng)力學(xué)特征

采用DAS 3.0軟件對兩組試驗(yàn)中恩諾沙星在血漿中的濃度進(jìn)行非房室模型統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)分析,得到藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)及血漿中的藥-時(shí)曲線如表1和圖1所示。

表1 恩諾沙星在福瑞鯉血漿中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.1 Pharmacokinetic parameters of enrofloxacin in common carp adm inistered orally under different conditions

2.3 聯(lián)合用藥和單用恩諾沙星在鯉不同組織中的吸收與分布

聯(lián)合用藥和單用恩諾沙星后,可獲得恩諾沙星在鯉肌肉、肝胰臟、腎臟中的藥-時(shí)曲線見圖2。

圖1 恩諾沙星在福瑞鯉血漿中的藥-時(shí)曲線Fig.1 M ean enrofloxacin concentration in plasma of common carp adm inistered orally at a dose of 2 mg/kg(body weight)

圖2 恩諾沙星在福瑞鯉肌肉、肝胰臟、腎臟中的藥-時(shí)曲線Fig.2 M ean enrofloxacin concentration in muscle,hepatopancreas,and kidney of common carp adm inistered orally at a dose of 2 mg/kg(body weight)

2.3.1 肌肉中的藥物含量 從圖2可見:肌肉中兩組均在8 h時(shí)達(dá)到藥物高峰,聯(lián)合用藥組和對照組峰值分別為1.85、1.31 mg/kg;24 h時(shí),藥物含量分別為0.91、0.68 mg/kg;240 h時(shí),藥物含量分別為0.27、0.41 mg/kg?？梢钥闯?聯(lián)合用藥組恩諾沙星濃度比對照組高,提高了有效濃度,72 h后,聯(lián)合用藥組鯉肌肉中的恩諾沙星濃度則低于對照組,這與血漿中恩諾沙星的藥-時(shí)曲線(圖1)消除趨勢相同,表明該組的消除速率高,即沒食子酸加速了恩諾沙星在鯉肌肉中的代謝,降低了殘留。

2.3.2 肝胰臟中的藥物含量 從圖2可見:肝胰臟中聯(lián)合用藥組恩諾沙星的含量在1 h時(shí)達(dá)到藥物高峰(7.94 mg/kg),對照組恩諾沙星含量則在0.75 h時(shí)達(dá)峰(5.48 mg/kg),聯(lián)合用藥組較對照組達(dá)峰時(shí)間稍晚,且峰值較大,為對照組的1.45倍;24 h時(shí),聯(lián)合用藥組和對照組鯉肝胰臟中恩諾沙星的含量分別為1.49、1.43 mg/kg;24 h后,兩組試驗(yàn)中恩諾沙星在肝胰臟內(nèi)的含量相當(dāng)?？梢钥闯?聯(lián)合用藥提高了恩諾沙星在鯉肝胰臟中的消除速率。

2.3.3 腎臟中的藥物含量 從圖2可見,腎臟中聯(lián)合用藥組和對照組恩諾沙星的含量均在2 h時(shí)達(dá)到藥物高峰,峰值分別為6.24、5.20 mg/kg;恩諾沙星含量在達(dá)峰之后,兩組均處于快速消除階段,且直至240 h時(shí)兩組中含量一直相差不大。

3 討論

3.1 檢測方法

本試驗(yàn)中,恩諾沙星的測定方法是根據(jù)農(nóng)業(yè)部783號公告[7]并進(jìn)行了部分變動(dòng),用0.1％甲酸水溶液取代了四丁基溴化銨,提高了靈敏度,同時(shí)避免了鹽類或離子對試劑的使用,因其與乙腈、甲醇混合使用易引起色譜管路堵塞[8]。檢測儀器使用了超高效液相色譜儀,減少了流動(dòng)相的消耗,降低了對環(huán)境的污染。

3.2 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

本試驗(yàn)中,鯉單次混飼口灌聯(lián)合用藥與單用恩諾沙星相比,血漿中恩諾沙星的含量達(dá)峰時(shí)間一樣,均為45 min,但聯(lián)合用藥組峰值為1.97 μg/mL,明顯比對照組(1.38μg/mL)高,導(dǎo)致半衰期有所延長,同時(shí)藥時(shí)曲線下面積也明顯增大,表明沒食子酸增強(qiáng)了鯉對恩諾沙星的吸收效率,使恩諾沙星的有效藥物濃度增大,生物利用度提高。聯(lián)合用藥組的表觀分布容積明顯大于對照組,表明沒食子酸可增大恩諾沙星在鯉體內(nèi)分布,與半衰期的長短相一致。從圖1可知,聯(lián)合用藥組血漿中恩諾沙星含量約24 h時(shí)和對照組中相當(dāng),導(dǎo)致聯(lián)合用藥組的平均駐留時(shí)間明顯減小?？傮w清除率升高,表明沒食子酸的添加使恩諾沙星的消除加快,這一現(xiàn)象也與以上結(jié)果相一致。

聯(lián)合用藥后,一種藥物引起另一種藥物藥動(dòng)學(xué)參數(shù)改變的現(xiàn)象較為常見,中藥對西藥的藥動(dòng)學(xué)會產(chǎn)生一定影響,如銀杏葉提取物能顯著降低苯巴比妥的血藥濃度[9],胡椒堿能顯著增大口服苯妥英鈉的吸收速率常數(shù),并減小其消除速率常數(shù),提高其血藥濃度[10-11]。黃芩苷和甘草酸對恩諾沙星在異育銀鯽體內(nèi)的代謝影響,表現(xiàn)為達(dá)峰濃度和藥時(shí)曲線下面積下降,半衰期減小,總體清除率升高[11]等。

3.3 恩諾沙星在鯉各組織中的分布和消除特征

本試驗(yàn)中,聯(lián)合用藥與單用恩諾沙星相比,各組織中的達(dá)峰時(shí)間均未發(fā)生明顯變化。兩組中達(dá)峰時(shí)間順序均為肝胰臟最先,腎臟其次,肌肉最后。聯(lián)合用藥與單用藥物兩組達(dá)峰藥物濃度均為肝胰臟(7.94、5.48 mg/kg)最高,腎臟(6.24、5.20 mg/kg)次之,肌肉(1.85、1.31 mg/kg)最低。說明藥物主要經(jīng)肝胰臟吸收,達(dá)峰后肝胰臟中的藥物含量反而低于腎臟,說明恩諾沙星主要是經(jīng)腎臟排泄[12];肌肉中的含量仍然最少,這可能是由于肌肉的滲透性差,血管貧乏,而肝胰臟和腎臟滲透性好且血管豐富[13]。雖然兩組在各組織中的藥物達(dá)峰時(shí)間無明顯變化,但聯(lián)合用藥組各組織中的有效藥物濃度比對照組提高了20.0％～44.9％,說明沒食子酸能顯著增大恩諾沙星的吸收效率;24 h時(shí),聯(lián)合用藥組的血漿和肌肉中藥物濃度大于對照組,肝胰臟和腎臟中的藥物濃度基本相當(dāng);240 h時(shí),聯(lián)合用藥組鯉血漿與肌肉中藥物濃度較對照組分別低44.2％和34.1％,說明沒食子酸的添加促進(jìn)了恩諾沙星在鯉體內(nèi)的代謝和消除,降低了恩諾沙星的殘留量。李小彥[14]研究了黃芩苷和諾氟沙星聯(lián)合用藥在對蝦體內(nèi)的殘留消除規(guī)律,結(jié)果表明,黃芩苷加速了諾氟沙星在對蝦體內(nèi)的消除,減少了諾氟沙星的殘留。本研究中鯉血漿和個(gè)別組織的藥時(shí)曲線中出現(xiàn)多峰現(xiàn)象,這與一些研究結(jié)果[15-17]相符,證明恩諾沙星在鯉體內(nèi)可能存在再吸收。

近年來,隨著耐藥性問題的日益突出,中西藥聯(lián)用在水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治中的應(yīng)用日益受到重視,現(xiàn)已逐漸應(yīng)用于魚類細(xì)菌和病毒性疾病防治,如三黃散與恩諾沙星合用防治出血病,黃連和諾氟沙星合用防治細(xì)菌性爛鰓病[11],相對于單用抗生素類藥物,中西藥聯(lián)合應(yīng)用更能夠降低或避免耐藥菌的產(chǎn)生[18]。因此,開展中西藥配伍的聯(lián)合應(yīng)用研究,可為魚病防治和漁藥的合理使用提供科學(xué)依據(jù),提高水產(chǎn)養(yǎng)殖防病效果。

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Effects of gallic acid on metabolism and residues of enrofloxacin in common carpCyprinus carpio

LIGai-juan1,LIU Yan-hui1,CHENWei-qiang1,ZU Xiu-jie1, DAIXin2,ZHAO Quan-dong1,YANG Bing-kun1
(1.Jilin Fisheries Research Institute,Changchun 130033,China;2.Water Resource Protection Bureau of Songliao River Basin,Changchun 130021, China)

The common carpCyprinus carpiowith body weight of(200±30)g were randomly divided into two groups and administered orally with enrofloxacin and combination of enrofloxac in and gallic acid(mass ratio of 10∶1)at a dose of 2 mg/kg(body weight)atwater temperature of26℃to study pharmacokinetics and residues of enrofloxacin in common carp.Then the concentration of enrofloxacin were detected in plasma,muscle,hepatopancreas and kidney sampled in different time by high performance liquid chromatography with fluorescence detection.The non-compartmental analysis by DAS 3.0 pharmacokinetic program software revealed that gallic acid led to increase the absorption efficiency of enrofloxacin significantly,to improve the effective drug concentration from 20.0％to 44.9％,and to facility themetabolism and elimination of the drug,reducing the drug residues by 44.2％ in plasma and by 34.1％in muscle in 240 h exposure.

Cyprinus carpio;enrofloxacin;gallic acid;combination of drug;pharmacokinetics;residue

S965.116

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.06.013

2095-1388(2016)06-0658-05

2016-03-02

吉林省科技引導(dǎo)計(jì)劃項(xiàng)目(20140417021CB);國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-46-29)

李改娟(1982—),女,工程師。E-mail:519101890@qq.com

劉艷輝(1966—),女,研究員。E-mail:Liuyanhui9@163.com