黑素瘤患者組織中PKM2和HIF-1α的表達(dá)及其臨床意義

沈慶華　沈險華

[摘要]目的：探究黑素瘤患者組織中絡(luò)氨酸激酶M2（PKM2）以及低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）表達(dá)水平變化及其臨床意義。方法：對2018年1月-2019年1月92例在筆者醫(yī)院接受治療的黑素瘤患者相關(guān)資料進(jìn)行回顧性分析，患者均為手術(shù)治療，分別測定患者手術(shù)獲取黑素瘤組織以及黑素瘤旁正常組織中PKM2、HIF-1α表達(dá)水平。不同組織PKM2、HIF-1α病理染色結(jié)果分析，比較不同組織PKM2、HIF-1α表達(dá)水平差異，不同臨床特征患者PKM2、HIF-1α表達(dá)水平差異，比較不同預(yù)后患者PKM2、HIF-1α表達(dá)。結(jié)果：PKM2和HIF-1α分別在細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞核表達(dá)，陽性表達(dá)主要顯示為棕黃色以及黃色粒狀物質(zhì)，而陰性則顯示為藍(lán)色粒狀物質(zhì)。黑素瘤組織PKM2、HIF-1α表達(dá)陽性率高于黑素瘤旁正常組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與分化程度不同患者黑素瘤組織中PKM2表達(dá)陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、分化程度、腫瘤分期不同患者黑素瘤組織中HIF-1α表達(dá)陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。92例患者中位隨訪時間為10.34個月，隨訪期內(nèi)失訪3例，剩余89例患者中預(yù)后不良患者13例;預(yù)后良好組患者黑素瘤組織PKM2、HIF-1α表達(dá)均明顯低于預(yù)后不良組患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：黑素瘤患者組織中PKM2、HIF-1α高表達(dá)，其表達(dá)水平與患者病情進(jìn)展以及預(yù)后情況關(guān)系密切，可用于評估患者病情并預(yù)測患者預(yù)后。

[關(guān)鍵詞]黑素瘤;PKM2表達(dá);HIF-1α表達(dá);臨床意義

[中圖分類號]R739.5? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2020）08-0034-04

Expression of PKM2 and HIF-1α in Melanoma Tissues and its Clinical Significance

SHEN Qing-hua1，SHEN Xian-hua2

（1.Surgical Clinic，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，Hubei，China;2.Reproductive Center of Wuhan Kangjian Maternal and Child Hospital，Wuhan 430000，Hubei，China）

Abstract： Objective? To investigate the changes in expression levels of pyruvate kinase M2 （PKM2） and Hypoxia inducible factor-1α （HIF-1α） in tissues of patients with melanoma and their clinical significance. Methods? The relevant data of 92 patients with melanoma treated in the hospital between January 2018 and January 2019 were analyzed retrospectively. All patients were treated with surgery. The expression levels of PKM2 and HIF-1α in melanoma tissues and normal tissues adjacent to melanoma were determined. Pathological staining results of PKM2 and HIF-1α in different tissues were analyzed. The expression levels of PKM2 and HIF-1α in different tissues， in patients with different clinical features and different prognosis were compared. Results? PKM2 and HIF-1α were expressed in the cytoplasm and the cell nucleus， respectively. The positive expression mainly showed brownish yellow and yellow granular substances， while the negative expression showed blue granular substances. The positive expression rates of PKM2 and HIF-1α in melanoma tissues were higher than those in normal tissues adjacent to melanoma （P<0.05）. There were significant differences in the expression of PKM2 in melanoma tissues of patients with different conditions of lymph node metastasis and different differentiation degrees （P<0.05）. There were significant differences in the positive expression rate of HIF-1α in melanoma tissues of patients with different conditions of lymph node metastasis， different differentiation degrees and different tumor stages （P<0.05）. The median follow-up time of 92 patients was 10.34 months， and 3 patients were lost to follow-up. Among the remaining 89 patients， 13 patients had poor prognosis. The expression of PKM2 and HIF-1α in melanoma tissues of patients with good prognosis was significantly lower than that in patients with poor prognosis （P<0.05）. Conclusion? PKM2 and HIF-1α are highly expressed in patients with melanoma. The expression levels are closely related to the patient's disease progression and prognosis. They can be used to evaluate the patient's condition and predict the prognosis.

Key words： melanoma; expression of PKM2; expression of HIF-1α; clinical significance

黑素瘤為身體器官與皮膚黑素細(xì)胞惡性增殖所致腫瘤，所有腫瘤患者中有1%～3%即為黑素瘤，但是患病后惡性程度嚴(yán)重[1]。該病多見于皮膚和黏膜，其致病原因多與環(huán)境影響以及基因變異有關(guān)，其中最重要環(huán)境影響因素為長期紫外線照射。目前臨床上對其治療主要采取放化療、液氮冷凍、病灶手術(shù)切除以及生物治療等方式，但是患者治療效果不佳。既往研究[2]指出，黑素瘤病情進(jìn)程與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄因子以及抑癌基因等眾多蛋白表達(dá)水平有關(guān)，對患者病情相關(guān)蛋白表達(dá)水平與臨床意義研究有利于黑素瘤患者病情評估、治療方式選擇以及預(yù)后預(yù)測。大部分細(xì)胞在氧氣正常存在時通過有氧氧化作用將葡萄糖分解達(dá)到獲得代謝所需能量目的，腫瘤細(xì)胞中糖酵解代謝作用較正常細(xì)胞更活躍，因此細(xì)胞內(nèi)部葡萄糖含量減少，乳酸大量積聚，研究者們將這種作用稱為Warburg效應(yīng)[3]。絡(luò)氨酸激酶（M2 type pyruvate kinase，PKM2）以及低氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）共同參與糖酵解作用，兩者水平變化與腫瘤病情發(fā)展關(guān)系密切[4]。目前PKM2、HIF-1α表達(dá)水平變化多見于其他類型腫瘤如胃癌、喉鱗狀細(xì)胞癌等[5-6]。本研究為了解黑素瘤患者組織中PKM2、HIF-1α表達(dá)及臨床意義，對筆者醫(yī)院近年內(nèi)收治黑素瘤患者相關(guān)資料予以分析，現(xiàn)報道如下。

1? 資料和方法

1.1 一般資料：對2018年1月-2019年1月在筆者醫(yī)院進(jìn)行治療的92例黑素瘤患者相關(guān)資料進(jìn)行回顧性分析。納入標(biāo)準(zhǔn)：①確診為黑素瘤;②采用手術(shù)進(jìn)行治療患者;③一般資料、各項(xiàng)蛋白檢測資料以及隨訪資料完整患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)其他腫瘤;②采用非手術(shù)方式進(jìn)行治療;③存在手術(shù)治療禁忌證;④相關(guān)資料不完整。92例患者中男48例，女44例;年齡20～78歲，平均（59.32±4.23）歲;皮膚黑素瘤80例，其他種類黑素瘤12例;病程1～12年，平均（8.15±1.37）年;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與不轉(zhuǎn)移患者分別33例和59例;腫瘤分期：Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期分別75例和17例;分化程度：低分化、中分化以及高分化分別20例、32例以及40例。

1.2 方法

1.2.1 蛋白水平測定：所有患者經(jīng)由手術(shù)切除黑素瘤組織以及黑素瘤旁正常組織立即采用4%多聚甲醛予以固定，應(yīng)用石蠟予以包埋后進(jìn)行切片，切片后經(jīng)常規(guī)處理后滴加山羊血清于37℃環(huán)境進(jìn)行封閉處理，30min后將液體棄去，添加合適濃度一抗在4℃環(huán)境下予以過夜，第2天將液體棄去后采用PBS緩沖液進(jìn)行沖洗，隨后滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔二抗在37℃濕盒環(huán)境下進(jìn)行30min孵育。孵育完成后應(yīng)用PBS進(jìn)行清洗，添加辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液相同濕盒環(huán)境孵育相同時間后再次應(yīng)用PBS清洗，隨后添加顯色液予以顯色，顯色標(biāo)準(zhǔn)為特異性顯色與背景分別顯色最強(qiáng)與不顯色。自來水沖洗后進(jìn)行復(fù)染、鹽酸乙醇分化、反藍(lán)、脫水、透明封片等處理。陰性對照使用PBS一抗替代，隨后在顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照。

1.2.2 蛋白表達(dá)水平結(jié)果判斷：蛋白表達(dá)分析結(jié)果應(yīng)用400倍顯微鏡下分析5張隨機(jī)不同視野圖片，依據(jù)陽性細(xì)胞率以及染色程度進(jìn)行判定[7]，將陽性細(xì)胞率<1%、≥1%且<25%、≥25%且<50%、≥50%且<75%、≥75%依次賦分0分、1分、2分、3分、4分;按照染色強(qiáng)弱程度將棕褐色記為3分、棕黃色記為2分、黃色記為1分、無色記為0分。最終結(jié)果為陽性率評分與染色強(qiáng)弱程度之積，低于4分為陰性，反之則為陽性。整個結(jié)果均由2名醫(yī)師進(jìn)行閱片以及評分，最終按照評分平均值進(jìn)行評定。

1.2.3 預(yù)后情況：患者術(shù)后接受隨訪，隨訪終末時間為2019年8月31日，依據(jù)隨訪資料判斷患者預(yù)后情況，包括病情復(fù)發(fā)、存活以及死亡等，其中預(yù)后不佳為患者病情復(fù)發(fā)或者死亡，反之則為預(yù)后良好。

1.3 觀察指標(biāo)：比較不同組織PKM2、HIF-1α表達(dá)水平差異，不同臨床特征患者PKM2、HIF-1α表達(dá)水平差異，分析黑素瘤患者組織中PKM2、HIF-1α表達(dá)之間相關(guān)性，比較不同預(yù)后患者PKM2、HIF-1α表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析：本研究所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行處理，計量資料與計數(shù)資料分別采用t檢驗(yàn)與χ2檢驗(yàn)進(jìn)行差異比較，依次表示為（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）與例（%），相關(guān)性分析應(yīng)用Spearson相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 不同組織PKM2、HIF-1α病理染色結(jié)果分析：PKM2主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，陽性表達(dá)主要顯示為棕黃色以及黃色粒狀物質(zhì)，而陰性則顯示為藍(lán)色粒狀物質(zhì);HIF-1α主要在細(xì)胞核表達(dá)，陽性表達(dá)主要顯示為棕黃色以及黃色粒狀物質(zhì)，而陰性則顯示為藍(lán)色粒狀物質(zhì)。

2.2 不同組織PKM2、HIF-1α表達(dá)比較：黑素瘤組織PKM2、HIF-1α表達(dá)陽性率高于黑素瘤旁正常組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.3 不同臨床特征患者PKM2、HIF-1α表達(dá)水平比較：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與分化程度不同患者黑素瘤組織中PKM2表達(dá)陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;不同性別、年齡、黑素瘤種類、腫瘤分期不同患者黑素瘤組織中PKM2表達(dá)陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、分化程度、腫瘤分期不同患者黑素瘤組織中HIF-1α表達(dá)陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;不同性別、年齡、黑素瘤種類不同患者黑素瘤組織中HIF-1α表達(dá)陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.4 不同預(yù)后患者黑素瘤組織PKM2、HIF-1α表達(dá)比較：92例患者隨訪時間為2～16個月，中位隨訪時間為10.34個月，隨訪期內(nèi)失訪3例（包括1例PKM2、HIF-1α均陽性，1例HIF-1α陽性及1例PKM2、HIF-1α均陰性），剩余89例患者中預(yù)后不良患者13例，其中死亡1例，復(fù)發(fā)12例。預(yù)后良好組患者黑素瘤組織PKM2、HIF-1α表達(dá)均明顯低于預(yù)后不良組患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

3? 討論

黑素瘤為黑素細(xì)胞發(fā)生惡性增殖所致腫瘤，較常發(fā)生于皮膚，且皮膚黑素瘤疾病程度較其他類型黑素瘤嚴(yán)重，患者預(yù)后較差[8]。相關(guān)調(diào)查顯示黑素瘤早期患者采用手術(shù)方式治療5年生存率為95%，但是中晚期黑素瘤患者預(yù)后較差且尚無有效方式改善患者預(yù)后[9]。臨床上常采用放化療、手術(shù)、靶向治療、物理治療以及免疫治療等中超過兩種方式聯(lián)用治療，雖然治療效果改善，但因此所致副作用也會增加，所以需要深入了解黑素瘤發(fā)生以及進(jìn)展機(jī)制，以明確其抗腫瘤方式。

研究發(fā)現(xiàn)，丙酮酸激酶（PK）作為限速酶可在糖酵解過程中發(fā)揮將磷酸烯醇丙酮酸羧激酶催化成丙酮酸作用，此過程伴隨有能量生成[10]。PKM2為PK四種同工酶之一，其主要分布于核酸合成頻繁且不停增殖細(xì)胞與胚胎組織中，特別是惡性腫瘤細(xì)胞。本研究中黑素瘤組織PKM2表達(dá)陽性率顯著高于黑素瘤旁正常組織，與馬素珍等[11]研究結(jié)論一致，黑素瘤組織細(xì)胞增殖較正常組織更頻繁，需要更多能量，糖酵解代謝作用較強(qiáng)，PKM2表達(dá)水平越高。另有研究顯示[12]通過shRNA介導(dǎo)PKM2基因表達(dá)沉默促進(jìn)了大腸癌細(xì)胞凋亡，抑制了細(xì)胞有氧糖酵解、增殖、遷移和侵襲，進(jìn)一步顯示出PKM2主要通過介導(dǎo)機(jī)體糖酵解過程促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)程。此外，通過對不同臨床特征患者黑素瘤組織PKM2表達(dá)陽性率分析發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及分化程度越低患者瘤組織中PKM2顯示為高表達(dá)狀態(tài)，腫瘤組織分化程度低，顯示細(xì)胞增殖快速，所需能量多，所以該部位糖酵解反應(yīng)更劇烈，出現(xiàn)轉(zhuǎn)移可能性更大，可見黑素瘤組織中PKM2高表達(dá)能夠顯示出患者腫瘤細(xì)胞增殖速度快、侵襲性強(qiáng)、轉(zhuǎn)移率高，處于這種狀態(tài)患者病情相對較為嚴(yán)重，預(yù)后較差。本研究隨訪結(jié)果分析同樣證實(shí)黑素瘤組織中PKM2高表達(dá)患者預(yù)后較差，與患者病情狀態(tài)情況相符。

低氧時，HIF-1組成成分之一氧反應(yīng)基（HIF-1α）分解作用減少，其水平在細(xì)胞中增加，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞能量循環(huán)以及生理過程，誘使腫瘤細(xì)胞得以在氧氣供應(yīng)不足狀態(tài)生長[13-14]。研究顯示，眾多人類腫瘤中如食管鱗癌、三陰性乳腺癌患者中HIF-1α均處于過表達(dá)狀態(tài)[15-16]。本研究中黑素瘤組織HIF-1α表達(dá)陽性率顯著高于黑素瘤旁正常組織，同時淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度低以及腫瘤分期高患者黑素瘤組織中HIF-1α顯示出高表達(dá)趨勢，提示HIF-1α不僅能有誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞增殖，同時還在病灶轉(zhuǎn)移與侵襲過程中發(fā)揮重要作用。腫瘤細(xì)胞增殖過快導(dǎo)致需要大量氧氣以及能量，血管血氧供應(yīng)速度不及腫瘤細(xì)胞增殖速度，所以機(jī)體出現(xiàn)缺氧情況，而HIF-1α在氧氣缺乏時大量增加，有效與HIF-1β結(jié)合形成HIF-1，而HIF-1可以調(diào)節(jié)機(jī)體多種細(xì)胞因子如血管內(nèi)皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子或糖酵解酶如PKM2、乳酸脫氫酶水平，上述因子介導(dǎo)了黑素瘤細(xì)胞整個能量生成、細(xì)胞增殖以及生長等過程，誘使黑素瘤細(xì)胞可以適應(yīng)于缺氧環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞存活。本研究隨訪結(jié)果顯示，預(yù)后良好組患者黑素瘤組織HIF-1α表達(dá)均明顯低于預(yù)后不良組患者，表明HIF-1α不僅可以用于評估患者病情情況，還可以用于預(yù)測患者預(yù)后情況。.

黑素瘤患者組織中PKM2、HIF-1α顯示出高水平表達(dá)，兩者一同介導(dǎo)了黑素瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移以及侵襲，其對患者病情判斷以及預(yù)后評估均具有重要指導(dǎo)意義。

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[收稿日期]2019-12-20

本文引用格式：沈慶華，沈險華.黑素瘤患者組織中PKM2和HIF-1α的表達(dá)及其臨床意義[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2020，29（8）：34-37.