痤瘡合劑對(duì)兔耳痤瘡模型外周血清炎性因子影響的實(shí)驗(yàn)研究

于佳家　張小卿　吳景東　顧煒

[摘要]目的：本研究旨在觀察痤瘡合劑對(duì)兔耳痤瘡模型外周血清炎性因子表達(dá)的影響。方法：Kligman和Fulton法制備兔耳痤瘡模型，于兔耳內(nèi)側(cè)涂抹煤焦油，時(shí)間2周，待造模成功后，痤瘡合劑組灌服痤瘡合劑（17.52g/kg/d）30d;陽性組灌服清熱暗瘡膠囊（0.12g/kg/d）30d;空白組與模型組灌服同等劑量生理鹽水。各組末次給藥后，24h內(nèi)取靜脈血及局部皮膚組織病理活檢。ELISA法檢測(cè)各組家兔外周血清IL-3、IL-4、IL-13、TNF-α、GM-CSF水平，HE染色法觀察兔耳組織病理變化。結(jié)果：痤瘡合劑能有效減輕兔耳表皮層的厚度、膿腫、結(jié)節(jié)和兔耳毛囊開口收縮及擴(kuò)張的程度，抑制毛囊漏斗內(nèi)角質(zhì)化物質(zhì)的大量增殖，降低真皮炎癥細(xì)胞的增生和浸潤(rùn)。除空白組外，各組血清IL-3、IL-4、IL-13、TNF-α和GM-CSF表達(dá)水平在造模后均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;處理后，與模型組相比，痤瘡合劑組和陽性組血清IL-3、IL-4、IL-13、TNF-α和GM-CSF表達(dá)水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論：痤瘡合劑能通過降低外周血清炎性因子濃度，調(diào)節(jié)免疫功能而改善兔耳痤瘡模型的病理表現(xiàn)。

[關(guān)鍵詞]痤瘡合劑;兔耳痤瘡模型;炎性因子;GM-CSF;白介素-3;腫瘤壞死因子α;白介素-13;白介素-4

[中圖分類號(hào)]R758.73+3? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2020）08-0027-04

Experimental Study of Inflammatory Cytokines Effect of Acne Mixture Decoction on Rabbit Ear Acne Models

YU Jia-jia1，ZHANG Xiao-qing1，WU Jing-dong2，GU Wei3

（1.The First Clinical Graduate School， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，Liaoning，China;2.The President's Office， the 2nd Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine Hospital，Shenyang 110036，Liaoning，China;3.Department of Dermatology Clinic， the Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine Hospital，Shenyang 110043，Liaoning，China）

Abstract： Objective? To study the effect of Acne Mixture Decoction on the expression of inflammatory cytokines in peripheral blood of rabbit ear acne model. Methods? Rabbit ear acne model was prepared according to Kligman and Kwong method by applying coal tar to the internal surface of rabbit ears for 2 weeks. After confirming successful modeling， the mixture group was given Acne Mixture Decoction （17.52g/kg/d）， continuous dosing 30d. And the control group was given Clear Heat Acne Capsule （0.12g/kg/d）， continuous dosing 30d. The control group and the model group were given equal doses of saline solution respectively. Partial ear skin samples were biopsied within 24 hours after the last administration， and using ELISA to detect levels of IL-3， IL-4， IL-13， TNF-α and GM-CSF in all groups.? Results? Acne Mixture Decoction can significantly reduce the abscess and nodules， reduce thickness of the rabbit ear epidermal and follicle funnel expansion， inhibit proliferation of keratinized compounds in follicle funnel， and reduce dermal inflammatory cell infiltration. Except the blank group， the expression levels of serum IL-3， IL-4， IL-13， TNF-α and GM-CSF in each group were significantly increased after modeling， and the differences were statistically significant （P<0.01）. Compared with the model group， levels of IL-3， IL-4， IL-13， TNF-α and GM-CSF in the mixture group and the positive control group were significantly decreased （P<0.01）. Conclusion? Acne Mixture decoction can improve the pathological symptoms of rabbit ear acne model by reducing the concentration level of inflammatory cytokines in peripheral blood and regulating immune function.

Key words： acne mixture; rabbit ear acne model; inflammatory cytokine; GM-CSF; IL-3; TNF-α; IL-13; IL-4

痤瘡屬傳統(tǒng)中醫(yī)“粉刺”的治療范疇，青春期發(fā)病率高，患者會(huì)出現(xiàn)不同程度和癥狀的皮損性臨床表現(xiàn)，中國(guó)區(qū)患病率為39.3%[1]，歐洲為57.8%[2]。該病主要發(fā)生在皮脂豐盈的面部、胸背，輕則皮膚膿皰和丘疹，重則凹凸瘢痕，甚至引起面部皮損性毀容，給患者帶來極大的情志壓力負(fù)擔(dān)?，F(xiàn)代西醫(yī)研究認(rèn)為，炎癥反應(yīng)、皮脂腺角質(zhì)化異常、P.Acne（痤瘡丙酸桿菌）定植、皮脂分泌過多和情志心理因素等都是影響本病早期發(fā)病的機(jī)制，其中免疫功能異常是影響本病的重要病理學(xué)因素[3]。因此，本實(shí)驗(yàn)以痤瘡合劑（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑）作為主要研究因素，以解癰散結(jié)，清上焦（肺）、中焦（胃）之濕熱為診治原則，觀察痤瘡合劑對(duì)兔耳痤瘡的病理學(xué)影響，探討該方劑調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)在本病發(fā)病中的免疫級(jí)聯(lián)效應(yīng)的作用。

1? 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雄性新西蘭SPF級(jí)大白兔32只，年齡（11.81±0.7）周，體重（1.94±0.38）kg，沈陽滕華生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：scxk（遼）2018-0002。于室內(nèi)濕度35%～65%，室內(nèi)溫度18℃～22℃的遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（SPF級(jí)）動(dòng)物室飼養(yǎng)，許可證號(hào)：syxk（遼）2013-0009，晝夜交替12h，單籠飼養(yǎng)。本次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物通過了遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)倫理審查，審查編號(hào)2019CS（DW）-004-001。

1.2 藥品及試劑：痤瘡合劑（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑），主要構(gòu)成：夏枯草，防風(fēng)，生地黃，枇杷葉，黃連等;清熱暗瘡膠囊（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20080425），江西普正制藥有限公司生產(chǎn)。煤焦油（批號(hào)：99891）;GM-CSF試劑盒（批號(hào)：F20061），上海西唐生物科技有限公司生產(chǎn);IL-3試劑盒（批號(hào)：10701-H08H/R009），Sino Biological公司生產(chǎn);TNF-α試劑盒（批號(hào)：SEA133Rb），武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司生產(chǎn);IL-13試劑盒（批號(hào)：ab119462），abcam公司生產(chǎn);IL-4試劑盒（批號(hào)：SEA077Rb），武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司生產(chǎn)。

1.3 主要儀器：酶標(biāo)儀（Anthos2010型）;生物顯微鏡（CHA型）;脫水機(jī)（LEICA 300）;石蠟包埋機(jī)（EG1150）;切片機(jī)（LEICA RM2235）;恒溫水浴振蕩器（SHA-B）;離心機(jī)（PB300）;電熱恒溫培養(yǎng)箱（HH·B11·500型）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組：新西蘭大耳兔購(gòu)買后，喂養(yǎng)1周觀察其適應(yīng)性，無死亡。分組方法應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表：①空白組;②模型組;③痤瘡合劑組;④陽性組;每組8只。

1.4.2 痤瘡動(dòng)物模型的建立及干預(yù)方案

1.4.2.1 環(huán)境適應(yīng)期：新西蘭大耳兔適應(yīng)性觀察飼養(yǎng)1周（每籠1只，室內(nèi)控溫20℃～25℃，12h光照，12h黑暗）。以玉米、大豆、麥麩、牧草為主成分的顆粒狀飼料，配飼卷心菜和胡蘿卜喂養(yǎng)，不限飲水量及進(jìn)食量。

1.4.2.2 動(dòng)物造模：根據(jù)1989年美國(guó)皮膚病學(xué)會(huì)正式頒布的Kligman和Fulton造模法[4]制備兔耳模型，兔耳內(nèi)側(cè)位于耳管近端約2cm×2cm位置，用醫(yī)用棉簽沾涂0.4～0.6ml煤焦油，每日1次，持續(xù)2周后，取兔耳組織病變部位，經(jīng)組織學(xué)檢查造模成功后，再實(shí)施后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2.3 干預(yù)方案：痤瘡合劑每日的臨床成人用量為58.48g，均分兩次口服，按人兔等效劑量法換算2.92g/kg/d。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)以往研究結(jié)果，藥物劑量確定為中劑量，按6倍的人兔等效劑量換算17.52g/kg/d，2次/d灌服。清熱暗瘡膠囊的臨床成人用量為2.5g，按人兔等效劑量法換算0.12g/kg/d，去膠囊，藥粉溶于生理鹽水，2次/d灌服，空白組及模型組等劑量灌服生理鹽水，連續(xù)30d。

1.4.2.4 血清采集及組織取材：10%水合氯醛腹腔注射，麻醉后提取腹主動(dòng)脈血，60min靜置，3 000r/m離心10min，提取血清2ml置于-80℃冰箱中凍存，ELISA法檢測(cè)外周血GM-CSF、IL-3、TNF-α、IL-13和IL-4水平。家兔左耳耳管采血后，經(jīng)耳緣靜脈注入20ml空氣栓塞處死，用1cm打孔器分別在家兔右耳耳管開口處取皮樣組織，10%多聚甲醛固定，置以石蠟包埋后制備病理切片。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 兔耳組織病理：取固定的兔耳組織，流動(dòng)水下完全沖洗，常規(guī)方法脫水、浸蠟、包埋，輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)制備4μm超薄兔耳切片，脫蠟后行蘇木素-伊紅（HE）染色，Digital顯微鏡下靜置觀察兔耳組織病理學(xué)改變。

1.5.2 血清炎性因子含量檢測(cè)：采用ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)各組家兔血清IL-4、IL-13、IL-3、GM-CSF及TNF-α水平變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析處理，各組計(jì)量資料采用單因素方差分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 造模情況：空白組家兔耳體薄、質(zhì)地軟、毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)清晰，耳道開口區(qū)毛囊未見角栓并排列有序;模型組造模后14d，涂有煤焦油處的耳部出現(xiàn)不同程度紅腫，毛囊口有鼓起，且伴有多個(gè)增生性粉刺樣結(jié)節(jié)，皮損部位的表皮層較厚，可見大面積黑色粉刺狀角栓;痤瘡合劑組兔耳表皮層薄厚不一，結(jié)節(jié)和毛囊角栓溢出見少，角栓脫落部位留有坑狀的大毛囊，丘疹數(shù)量減少;陽性組表皮損傷修復(fù)程度與痤瘡合劑組療效接近。

2.2 兔耳病理改變：空白組兔耳皮膚各層結(jié)構(gòu)完整，表皮層較薄，表皮與真皮邊界清晰，皮下組織無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和小血管擴(kuò)張等病理結(jié)構(gòu)改變;模型組上皮出現(xiàn)特異性角化且明顯角化不全，顆粒層及棘細(xì)胞層組織增厚，真皮淺層可見小血管擴(kuò)張及腫脹，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，角化物質(zhì)大量聚集毛囊漏斗處形成角化栓;痤瘡合劑組兔耳表皮角化程度明顯緩和，增厚的顆粒層及棘細(xì)胞層顯著變薄，真皮淺層炎癥細(xì)胞減少明顯，部分小血管輕微擴(kuò)張，毛囊漏斗內(nèi)聚集少量的角化物;陽性組毛囊擴(kuò)張不明顯，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)顯著改善。見圖1～4。

2.3 血清炎性因子水平：處理后，空白組外周血清IL-3、IL-4、IL-13、TNF-α、GM-CSF濃度低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;痤瘡合劑組和陽性組外周血清IL-3、IL-4、IL-13、TNF-α、GM-CSF濃度低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見圖5。

3? 討論

痤瘡的病因病機(jī)早在《內(nèi)經(jīng)》中就已形成辨證論治的理論，認(rèn)為痤瘡為上焦（肺經(jīng)）、中焦（胃經(jīng)）、下焦（大腸經(jīng)）郁之熱邪所致。近年來許多中醫(yī)名家提出了濕熱、血瘀痰結(jié)、氣血凝塞等理論，并以燥濕、清熱、活血、散癰、化瘀、解毒為治療原則。筆者醫(yī)院通過觀察中藥治療痤瘡的臨床療效并結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)痤瘡發(fā)病機(jī)制的認(rèn)知，精研出痤瘡合劑，治療以解毒散癰，清瀉上焦和中焦?jié)駸釣樵瓌t，用連翹和金銀花相須使用可清熱解毒、透邪、消癰散結(jié)，適用于肺熱所致肺風(fēng)粉刺癥，黃芩清肺熱，消癰腫瘡毒，黃連瀉胃火治瘡毒，兩藥配伍清熱除濕解毒;枇杷葉苦寒，有清瀉肺胃之熱、利尿、止渴的功效;桑白皮既能助枇杷葉清肺熱，又兼利水，可使熱隨小便而去，與黃芩三藥搭配清泄肺胃積熱、降逆氣，藥理研究證明，黃芩、枇杷葉、桑白皮均有抑炎和抗炎作用[5]。沙參潤(rùn)肺燥、養(yǎng)胃陰，防邪熱過盛而傷陰液;其藥理成分沙參多糖可抑制體液、細(xì)胞免疫，能調(diào)節(jié)和平衡免疫功能[5]。夏枯草散結(jié)泄熱消腫，抗病原微生物。牡蠣軟堅(jiān)散結(jié)，配夏枯草可清火消癰散結(jié)，增強(qiáng)免疫。牛蒡子宣肺透疹，可治斑疹不透或癰腫瘡毒;防風(fēng)升清燥濕，可祛隱疹固表;蟬蛻散肺經(jīng)風(fēng)熱而透疹;葛根發(fā)表透疹，以上四味搭配，上宣下透，外清內(nèi)消，助疹毒于肌表散之，熱邪于腸道瀉之。熱入營(yíng)血而久蘊(yùn)化熱成毒，氣血郁而經(jīng)脈失暢，以地黃配牡丹皮苦寒涼血化瘀;川芎性善行竄，通氣血;香附解郁疏肝止痛，氣行血暢，則熱毒火邪自解。此方臨床療效確切，治則基于“清瀉上中焦積熱，解毒涼血，活血化瘀散癰”的中醫(yī)理論，為進(jìn)一步探討?zhàn)畀徍蟿┑拿庖邔W(xué)機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

痤瘡疾病的具體發(fā)病機(jī)制受多種因素影響，歸納綜合病因有：①皮脂分泌亢進(jìn);②角質(zhì)化異常;③炎癥反應(yīng);④痤瘡丙酸桿菌（P.Acne）定植。Melnik等[6-7]發(fā)現(xiàn)免疫功能異常是本病的另一個(gè)重要致病因素，且不排除多種細(xì)胞類型及介質(zhì)誘導(dǎo)加劇刺激其炎癥反應(yīng)。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，微粉刺是痤瘡發(fā)病的亞臨床表現(xiàn)，在雄激素的病理刺激下，導(dǎo)致皮脂大量分泌，借此P.Acnes在毛囊內(nèi)大量繁殖，進(jìn)一步激發(fā)皮脂分泌和堆積，繼而促進(jìn)毛囊皮脂腺過度角化，周而復(fù)始引起皮脂腺導(dǎo)管栓塞，最終由固有免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[8]。異常的皮脂分泌、腺體角化、毛囊栓塞、P.Acne增殖皆是影響和改變皮脂腺周圍環(huán)境的初始因素。Jeremy等在2003年研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)至始至終貫穿整個(gè)P.Acnes發(fā)病過程，并揭示炎癥就是痤瘡疾病的刺激因素，經(jīng)觀察患者非病變皮膚皮脂腺周圍有明顯的炎癥因子（CD4細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、IL-1α水平均高于空白組），提示炎癥浸潤(rùn)早于增生，炎癥介質(zhì)是誘導(dǎo)P.Acnes發(fā)生發(fā)展的至關(guān)因素。

炎癥的基本特征是促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子之間相互交織的互聯(lián)集落，彼此間的極化博弈決定炎癥反應(yīng)的趨向性。P.Acne通過多種促炎途徑直接啟動(dòng)固有免疫系統(tǒng)，介導(dǎo)表皮主要細(xì)胞（角質(zhì)形成細(xì)胞和皮脂腺細(xì)胞）激活TLR，并誘導(dǎo)TNF-α、GM-CSF和其他促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，或以觸發(fā)炎性小體的激活途徑，導(dǎo)致殺傷細(xì)胞（粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）趨化及聚集，誘導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)[3]。GM-CSF是免疫調(diào)節(jié)因子的一種，可以刺激髓樣單核細(xì)胞（如DCs）的增殖、分化，參與炎癥和慢性炎癥反應(yīng)[9]，且具有促進(jìn)傷口愈合和組織修復(fù)功能[10]。IL-3與GM-CSF同屬β細(xì)胞因子家族，是激活固有免疫的中心介子，在宿主防御和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要功能[11]。IL-4是固有免疫細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，與IL-13共同作用刺激肥大細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，參與皮膚病炎性反應(yīng)[12]。TNF-α被認(rèn)為在各種免疫疾病和皮膚炎癥中啟動(dòng)級(jí)聯(lián)激活，促進(jìn)炎性介質(zhì)釋放，造成免疫炎癥反應(yīng)擴(kuò)大，進(jìn)而引起痤瘡的特異性免疫反應(yīng)[13]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用ELISA檢測(cè)痤瘡模型外周血GM-CSF、IL-3、TNF-α、IL-13及IL-4水平，探討炎性細(xì)胞因子在痤瘡發(fā)生發(fā)展過程中的免疫調(diào)控趨勢(shì)。

炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答是參與和影響?zhàn)畀彶±碜兓拿庖吖δ軝C(jī)制，可導(dǎo)致機(jī)體免疫調(diào)節(jié)機(jī)能的失衡。痤瘡合劑能降低家兔外周血免疫因子GM-CSF、IL-3、TNF-α、IL-13及IL-4表達(dá)，抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，逃避免疫監(jiān)視，從而阻斷炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng);從病理上可改善炎性皮損、結(jié)節(jié)、毛囊角栓及小血管充血，證明痤瘡合劑對(duì)兔耳痤瘡模型有較好的抗炎及抑炎作用。

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[收稿日期]2019-12-12

本文引用格式：于佳家，張小卿，吳景東，等.痤瘡合劑對(duì)兔耳痤瘡模型外周血清炎性因子影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2020，29（8）：27-30.