高分辨率顯微內(nèi)鏡成像系統(tǒng)的構(gòu)建與初步應(yīng)用

屈亞威，談 濤，張 宇，舒 娟，劉敏黎，張 玲，劉海峰

武警總醫(yī)院消化科，北京市，100039

高分辨率顯微內(nèi)鏡成像系統(tǒng)的構(gòu)建與初步應(yīng)用

【作 者】屈亞威，談 濤，張 宇，舒 娟，劉敏黎，張 玲，劉海峰

武警總醫(yī)院消化科，北京市，100039

高分辨率顯微內(nèi)鏡（HRME）是基于高分辨率光纖和分子成像技術(shù)研發(fā)的一種新的成像方法，能夠?qū)M織進(jìn)行實(shí)時(shí)成像。該文通過對HRME系統(tǒng)中激發(fā)光傳導(dǎo)部、熒光圖像傳像部、光纖快速交換部和圖像采集部等組成元件和光路的設(shè)計(jì)與優(yōu)化，構(gòu)建了一套HRME成像系統(tǒng)。利用HRME系統(tǒng)對動物胃腸道黏膜進(jìn)行成像觀察，結(jié)果表明HRME實(shí)現(xiàn)組織虛擬病理學(xué)成像具備可行性，為進(jìn)一步臨床研究奠定了基礎(chǔ)。HRME作為一種即時(shí)組織病理學(xué)成像方法，有望成為組織即時(shí)診斷的一種新模式。

高分辨率顯微內(nèi)鏡；系統(tǒng)構(gòu)建；成像；可行性

0 引言

隨著內(nèi)鏡技術(shù)的快速發(fā)展，顯微內(nèi)窺技術(shù)在臨床上具有廣闊的應(yīng)用前景，如共聚焦激光顯微內(nèi)鏡(confocal Laser endomicroscopy, cLe)[1]。cLe是通過放大的方式對黏膜層的細(xì)胞結(jié)構(gòu)實(shí)時(shí)觀察，實(shí)現(xiàn)內(nèi)鏡下的虛擬組織病理成像，展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景[1-2]。但由于cLe是通過對多個(gè)點(diǎn)進(jìn)行二維掃描的方式而獲得圖像，這種逐點(diǎn)掃描的成像方法需要較長的掃描曝光時(shí)間，因此降低了幀頻率并且會出現(xiàn)偽影[1-3]。針對上述問題，新的熒光內(nèi)窺式顯微成像模式為我們提供了新的思路。高分辨率顯微內(nèi)鏡(High Resolution Microendoscopy，HRMe)是一種新的熒光內(nèi)窺式顯微成像模式，有望在實(shí)現(xiàn)即時(shí)顯微成像的同時(shí)獲得高質(zhì)量的成像效果[4-6]。課題組自主研發(fā)了一套HRMe成像系統(tǒng)，本文就HRMe成像原理、HRMe組成元件、光路設(shè)計(jì)及初步應(yīng)用等方面做簡要介紹。

1 HRMe系統(tǒng)成像原理和熒光造影劑

1.1 成像原理

HRMe通過LeD光源發(fā)出的激發(fā)光經(jīng)濾光片過濾，形成455 nm的窄譜段激發(fā)光，激發(fā)光經(jīng)高分辨率光纖傳導(dǎo)至噴灑染色劑的生物組織產(chǎn)生515 nm的熒光。熒光信號再通過高分辨率光纖返回，由物鏡放大后，通過二向色鏡將激發(fā)光和熒光分開，只將熒光信號傳導(dǎo)至ccD芯片上進(jìn)行成像，從而得到被檢測組織的細(xì)胞學(xué)圖像，見圖1。

圖1 HRMe系統(tǒng)結(jié)構(gòu)原理圖Fig.1 Structure diagram of HRMe system

1.2 熒光造影劑

HRMe系統(tǒng)常用的熒光造影劑是原黃素和鹽酸吖啶黃，其對組織有較高的親和力。原黃素已被FDa批準(zhǔn)為實(shí)驗(yàn)試劑，在歐洲、亞洲和澳大利亞等廣泛應(yīng)用，無嚴(yán)重不良反應(yīng)，安全性較高。原黃素激發(fā)光和發(fā)射光波長分別是為445 nm和515 nm，可與細(xì)胞核內(nèi)的DNa、RNa結(jié)合后染色，局部噴灑原黃素后幾秒內(nèi)即可被吸收，使黏膜上皮細(xì)胞核顯影，顯像的細(xì)胞核表現(xiàn)為發(fā)亮的區(qū)域，不顯色的部分為發(fā)暗的區(qū)域。

2 HRMe系統(tǒng)組成

系統(tǒng)的主要組成元件包括一個(gè)440～480 nm的LeD光源、一根長1.8 m(內(nèi)含30 000根單絲)的高分辨率光纖、一根長1.8 m(內(nèi)含10 000根單絲)的高分辨率光纖、10×顯微鏡鏡頭、20×顯微鏡鏡頭、500 nm二向色鏡、濾光片以及一個(gè)科學(xué)級ccD相機(jī)，見圖2和圖3。

圖2 HRMe系統(tǒng)三維模型圖Fig.2 Three dimensional model diagram HRMe system

圖3 HRMe系統(tǒng)實(shí)物圖Fig.3 Physical picture of HRMe system

3 HRMe系統(tǒng)光路設(shè)計(jì)

光路設(shè)計(jì)是HRMe系統(tǒng)的核心部分，其主要包含激發(fā)光傳導(dǎo)部、熒光圖像傳像部、光纖快速交換部和圖像采集部。

3.1 激發(fā)光傳導(dǎo)部

激發(fā)光源為波長440～480 nm的LeD光源，其發(fā)出的全波段激發(fā)光經(jīng)過準(zhǔn)直裝置a和濾光裝置b1過濾后，發(fā)射出波長455 nm的平行激發(fā)光。激發(fā)光入射到透光率為500 nm的二向色鏡的鏡面c上，通過折射將激發(fā)光經(jīng)過光纖快速交換部d出射到高分辨率光纖中，形成滿足原黃素產(chǎn)生激發(fā)熒光的窄譜段激發(fā)光。

3.2 熒光圖像傳像部

熒光造影劑經(jīng)激發(fā)光照射后，產(chǎn)生熒光。熒光信號首先經(jīng)高分辨率光纖束g傳導(dǎo)進(jìn)入主光路，高分辨率光纖束末端通過SMa905接口3與前端套筒2固定，同時(shí)通過旋轉(zhuǎn)前端套筒2進(jìn)行調(diào)焦。熒光信號通過顯微鏡鏡頭后透過500 nm的二向色鏡c，再經(jīng)過濾光片b2過濾掉背景光后投射到ccD相機(jī)靶面上。

3.3 光纖快速交換部

主要包含兩種不同型號的高分辨率光纖束（FIGH-30-650S和FIGH-30-350S），10×顯微鏡鏡頭、20×顯微鏡鏡頭，兩組前端套筒組成。當(dāng)使用FIGH-30-650S型光纖束時(shí)，選取10×顯微鏡鏡頭及對應(yīng)的前端套筒；如果需要更換為FIGH-30-350S型光纖束，只需要將10×顯微鏡鏡頭拆下安裝上20×顯微鏡鏡頭及對應(yīng)前端套筒即可。

3.4 圖像采集部

圖像采集主要由科學(xué)級ccD相機(jī)(f)和計(jì)算機(jī)軟件完成。相機(jī)分辨率為2 456×2 048，成像幀率為17 幀/s，ccD靶面尺寸為2/3 inch (1inch=25.4 mm)。

4 HRMe系統(tǒng)的初步應(yīng)用研究

4.1 研究方法

選擇日本大耳白兔為研究對象。動物經(jīng)麻醉、固定、切開、解剖胃腸道、暴露胃腸道組織和清洗等實(shí)驗(yàn)步驟后，制備胃腸道黏膜標(biāo)本，備用。標(biāo)本局部噴灑0.01%原黃素鹽酸鹽2～3 mL，大約30 s后將光纖頭端以不同角度觀察組織表面，進(jìn)行成像。成像結(jié)束后，組織行病理檢查。

4.2 結(jié)果

HRMe根據(jù)細(xì)胞核大小、密度、分布、腺體結(jié)構(gòu)等指標(biāo)，可以清晰地辨別不同部位的胃腸道黏膜。胃底黏膜：可見大量排列緊密的腺體，胃小凹開口呈類橢圓形或長形分枝狀，周邊裂隙呈線樣，細(xì)胞核排列規(guī)則。胃竇黏膜：胃小凹開口呈不規(guī)則形或管狀，腺腔呈裂隙狀，小凹周圍細(xì)胞排列規(guī)則，細(xì)胞核小且分布密集。小腸黏膜：可見絨毛呈寬大的指狀，立體感明顯，呈簇狀排列，間隙呈裂隙狀。大腸黏膜：可見排列規(guī)則的大量菊花樣圓形隱窩，大小基本一致，隱窩間隙清晰可見，腺體排列規(guī)則。病理結(jié)果與HRMe結(jié)果相一致，見圖4。

圖4 動物胃腸道黏膜HRMe圖片和病理圖片的比較Fig.4 comparation of HRMe images and pathological images for animal gastrointestinal mucosa

5 討論

根據(jù)光的折射和全反射原理，光在光導(dǎo)纖維中傳導(dǎo)損耗低，通過傳像光纖可以實(shí)現(xiàn)異地成像，因而光纖在醫(yī)學(xué)內(nèi)窺成像領(lǐng)域展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。隨著技術(shù)的發(fā)展及光學(xué)分子成像需求的增長，基于光纖的光學(xué)成像設(shè)備得到了快速發(fā)展?，F(xiàn)有光纖熒光成像設(shè)備光路主要為共通道方式，即通過同一根光纖傳導(dǎo)激發(fā)光和熒光，透過二向色鏡將激發(fā)光與熒光分開，從而只將熒光傳導(dǎo)到ccD相機(jī)進(jìn)行成像[7]。Sharon等[8]設(shè)計(jì)了用于檢測小鼠體內(nèi)結(jié)腸腫瘤的多光譜掃描纖維內(nèi)鏡。Pierce等[9]結(jié)合高分辨率光纖的性能和共通道熒光內(nèi)鏡的光路配置，開發(fā)了一種基于高分辨率光纖的共通道內(nèi)窺顯微成像模式，在此基礎(chǔ)上組裝了HRMe，對培養(yǎng)皿中細(xì)胞生長情況進(jìn)行顯微動態(tài)觀察，取得了良好的效果。HRMe作為實(shí)時(shí)組織病理學(xué)成像方法，迅速成為顯微內(nèi)窺鏡領(lǐng)域的熱點(diǎn)[10-13]。

依據(jù)HMRe的成像原理及成像需求，多位學(xué)者研制了多種不同光路設(shè)計(jì)及硬件配置的HRMe設(shè)備。Zhong等[14]采用電子倍增耦合元件、30 000像元的高分辨率光纖、10×顯微物鏡組裝了信號高敏感型HRMe。Shin等[15]采用30 000像元的高分辨率光纖、20×的物鏡、150 mm管狀透鏡、商用數(shù)碼相機(jī)組成便攜式HRMe。Pillai等[16]在光纖的頭端連接GRIN棱鏡，使用光電倍增管（PMT)采集圖像。Muldoon等[17]的設(shè)備采用了10×的物鏡、倍率鏡、30 000像元的高分辨率光纖、工業(yè)級ccD相機(jī)。我們的設(shè)備采用了20×顯微鏡頭、二向色鏡、長1.8 m的30 000像元（或10 000像元）、科學(xué)級ccD相機(jī)等元件，制成一套新的HRMe成像設(shè)備。該設(shè)備具有信號穩(wěn)定、傳輸速度快和運(yùn)動偽影少等特點(diǎn)，具有良好應(yīng)用前景。

我們構(gòu)建的HRMe成像設(shè)備優(yōu)勢在于：(1) 設(shè)計(jì)安裝雙光纖快速交換部，通過該部分可以在主光路不變的條件下快速切換30 000像元與10 000像元兩種光纖束，從而保證不損壞光纖束；由于最后投影到ccD靶面上的圖像大小相同，而30 000像元光纖束的截面積是10 000像元光纖束截面積的3.45倍，所以在同一主光路中使用10 000像元光纖束所得到的圖像放大倍數(shù)為30 000像元光纖束的3.45倍，通過雙光纖快速交換部實(shí)現(xiàn)了放大倍數(shù)的快速切換；(2)全套光路采用一體化設(shè)計(jì)，光路準(zhǔn)直不需要經(jīng)過三維組合平移臺的調(diào)節(jié)；采用SMa905接口固定光纖束，使其連接更加牢固，操作更加簡便；(3)激發(fā)光源部增加了準(zhǔn)直裝置，使單位面積激發(fā)光的能量分布更為平均，從而避免由于激發(fā)光強(qiáng)度不同導(dǎo)致產(chǎn)生假陽性信號；（4）采用科學(xué)級ccD相機(jī)進(jìn)行圖像采集，具有較高的靈敏度和信噪比，同時(shí)可以調(diào)節(jié)曝光時(shí)間和成像幀率。

為了驗(yàn)證HRMe系統(tǒng)的成像效果及對于實(shí)現(xiàn)組織虛擬病理學(xué)成像的可行性，利用HRMe系統(tǒng)對動物胃腸道黏膜進(jìn)行了成像觀察。動物胃腸道黏膜成像結(jié)果表明HRMe能夠?qū)Σ煌课晃改c道黏膜進(jìn)行實(shí)時(shí)病理學(xué)成像，由于胃黏膜胃小凹形態(tài)與小腸、大腸黏膜腺體不相同，所以HRMe的圖像特點(diǎn)各不相同，憑借HRMe圖像可以區(qū)分胃腸道不同部位的黏膜。上述結(jié)果表明HRMe作為一種新型內(nèi)鏡技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)組織的虛擬病理學(xué)成像，展現(xiàn)了HRMe實(shí)現(xiàn)“光學(xué)活檢”的可行性，為進(jìn)一步臨床研究奠定基礎(chǔ)[18-20]。

綜上所述，HRMe作為一種新興的成像工具，能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞水平成像，通過該成像技術(shù)可以對組織進(jìn)行實(shí)時(shí)病理學(xué)成像[21-23]。利用自主研發(fā)的HRMe成像系統(tǒng)進(jìn)行了臨床前的研究，結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了該成像系統(tǒng)對實(shí)現(xiàn)組織虛擬病理學(xué)成像的可行性，展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。光路設(shè)計(jì)的優(yōu)化、硬件設(shè)備和成像軟件的不斷升級，探索與臨床內(nèi)窺鏡結(jié)合的條件將是未來研究的重點(diǎn)。

[1] Kiesslich R, Burg J, Vieth M, et al. confocal laser endoscopy for diagnosing intraepithelial neoplasias and colorectal cancer in vivo[J]. Gastroenterology, 2004, 127(3): 706-713.

[2] Pohl H, Rosch T, Vieth M, et al. Miniprobe confocal laser microscopy for the detection of invisible neoplasia in patients with Barrett’s esophagus[J]. Gut, 2008, 57(12): 1648-1653.

[3] 范曉飛, 戈之錚, 薛寒冰, 等. 共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)后殘留和復(fù)發(fā)病變診斷中的應(yīng)用價(jià)值[J]. 胃腸病學(xué), 2012, 17(8): 462-465.

[4] Louie JS, Richards-Kortum R, anandasabapathy S. applications and advancements in the use of high-resolution microendoscopy for detection of gastrointestinal neoplasia[J]. clin Gastroenterol Hepatol, 2014, 12: 1789-1792.

[5] Pierce Mc, Guan Y, Quinn MK, et al. a pilot study of low-cost, high-resolution microendoscopy as a tool for identifying women with cervical precancer[J]. am assoc cancer, 2012, 5: 1273-1279.

[6] chang SS, Shukla R, Polydorides aD, et al. High resolution microendoscopy for classification of colorectal polyps[J]. endoscopy, 2013, 45: 553-559.

[7] Flusberg Ba, cocker eD. Fiber-optic fuorescence imaging[J]. Nat Meth, 2005, 2(12): 941-950.

[8] Miller SJ, Lee cM, Joshi BP, et al. Targeted detection of murinecolonic dysplasia in vivo with fexible multispectral scanning fber endoscopy[J]. J Biomed optics, 2012, 17(2): 021103.

[9] Fujimoto JG. optical coherence tomography for ultrahigh resolution in vivo imaging[J]. Nat Biotechnol, 2003, 21(11): 1361-1367.

[10] Pierce M，Yu D, Richards-Kortum. High-resolution fber-optical microendoscopy for in situ imaging[J]. J Visual exp, 2011, 11(47): 1-4.

[11] Pierce Mc, Vila PM, Kingsley MJ. accuracy and interrater reliability for the diagnosis of Barrett’s neoplasia among users of a novel, portable high-resolution microendoscope[J]. Diseas esophagus, 2014, 27: 55-62.

[12] Quinn MK, Bubi Tc, Pierce Mc, et al. High-resolution microendoscopy for the detection of cervical neoplasia in lowresource settings[J]. PLoS one, 2012, 7(9): e44924.

[13] Levy LL, Jiang N, Smouha e, et al. optical imaging with a high resolution microendoscope to identify cholesteatoma of the middle ear[J]. Laryngoscope, 2013, 123(4): 1016-1020.

[14] Zhong W, celli JP, Rizvi I, et al. In vivo high-resolution fluorescence microendoscopy for ovarian cancer detection and treatment monitoring[J]. Brit J cancer, 2009, 101(12), 2015-2022.

[15] Shin D, Pierce Mc, Gillenwater aM, et al. a fiber-optic fuorescence microscope using a consumer-grade digital camera for in vivo cellular imaging[J]. PLoS one, 2010, 5(6): e11218.

[16] Pillai S, Lorenser D, Sampson D. Deep-tissue access with confocal fuorescence microendoscopy through hypodermic needles[J]. opt Soc am, 2011, 19(8): 7213-7221.

[17] Muldoon TJ, anandasabapathy S, Maru D, et al. High-resolution imaging in Barrett’s esophagus: a novel, low-cost endoscopic microscope[J]. Gastrointest endosc, 2008, 68(4): 737-744.

[18] Parikh ND, Perl D, Lee MH, et al. In vivo diagnostic accuracy of high-resolution microendoscopy in differentiating neoplastic from non-neoplastic colorectal polyps: a prospective study[J]. am J Gastroenterol, 2014, 109(1): 68-75.

[19] Muldoon TJ, Roblyer D, Williams MD, et al. Noninvasive imaging of oral neoplasia with a high-resolution fiber-optic microendoscope[J]. Head Neck, 2012, 34: 305-312.

[20] Vila PM, Park cW, Pierce Mc, et al. Discrimination of benign and neoplastic mucosa with a high-resolution microendoscope[J]. ann Surg oncol, 2012, 19: 3534-3539.

[21] 王雪珊, 徐為然, 張帆, 等. 新型高清顯微內(nèi)鏡在食管早期腫瘤診斷中的價(jià)值初探[J]. 中華消化內(nèi)鏡雜志, 2012, 29: 24-28.

[22] Regunathan R, Woo J, Pierce Mc, et al. Feasibility and preliminary accuracy of high-resolution imaging of the liver and pancreas using FNa compatible microendoscopy (with video) [J]. Gastrointest endosc, 2012, 76(2): 293-300.

[23] Muldoon TJ, Roblyer D, Williamset MD, et al. Noninvasive imaging of oral neoplasia with a high-resolution fiber-optic microendoscope[J]. Head Neck, 2012, 3: 305-312.

Construction and Preliminary Application of High Resolution Microendoscopy Imaging System

【 Writers 】QU Yawei, TAN Tao, ZHANG Yu, SHU Juan, LIU Minli, ZHANG Ling, LIU Haifeng
Gastroenterology of General Armed Police Hospital, Beijing, 100039

high resolution microendoscopy, system construction, imaging, feasibility

R318.6

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2016.03.002

1671-7104(2016)03-0161-03

2015-12-17

首都臨床特色應(yīng)用研究（Z141107002514099）

屈亞威，e-mail: qyw198553@163.com

劉海峰，e-mail: haifengliu333@163.com

【 Abstract 】High Resolution Microendoscopy (HRME) is a new imaging method which based on high resolution fber and molecular imaging technology and it is possible to organize real-time imaging. After design and optimization of excitation light conduction part, fuorescent image transfer unit, optical fast switching unit and image capture unit, we constructe a HRME imaging system. We make an imaging observation of animal gastrointestinal tract by using HRME system and the results show that the feasibility of virtual pathology of HRME which lay the foundation for further clinical research. As an instant histopathological imaging method, HRME is expected to become a new immediate diagnosis model.