魔芋葡甘露聚糖對Lewis肺癌小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

潘 磊周 翡陳培豐

·經(jīng)驗交流·

魔芋葡甘露聚糖對Lewis肺癌小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

潘 磊1周 翡2陳培豐1

目的觀察中藥蛇六谷主要成分魔芋葡甘露聚糖（KGM）對肺癌小鼠免疫功能的影響。方法建立小鼠Lewis肺癌模型后，隨機(jī)分成KGM高、中、低劑量組及對照組、環(huán)磷酰胺（CTX）組。建模第2天起，KGM高、中、低劑量按300、200、100mg/（kg·d）連續(xù)灌胃13天，對照組以等劑量生理鹽水灌胃13天，環(huán)磷酰胺組予環(huán)磷酰胺30mg/kg每周2次腹腔注射給藥，共4次。第14天處死小鼠，取瘤體、脾臟稱重并計算抑瘤率和脾臟指數(shù)，MTS法檢測脾臟中T淋巴細(xì)胞增殖活力，ELISA法檢測脾細(xì)胞IL-2的表達(dá)。結(jié)果（1）與對照組比較，CTX組、KGM中、高劑量組瘤重降低明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[（0.69±0.50）g、（1.71±0.95）g、（1.54±0.83）g比（2.51±1.11）g，P＜0.05]；KGM低、中、高劑量組瘤重高于CTX組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[（2.15±0.88）g、（1.71±0.95）g、（1.54±0.83）g比（0.69± 0.50）g，P＜0.05]。（2）與對照組比較，CTX組脾臟指數(shù)降低[（2.73±1.19）mg/g比（4.61±0.69）mg/g，P＜0.01]，KGM各劑量組脾臟指數(shù)升高，其中KGM中、高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義[（5.93±0.88）mg/g、（6.02±1.47）mg/g比（4.61±0.69）mg/g，P＜0.05]。（3）與對照組比較，CTX組T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)能力下降[（0.4055±0.2295）比（0.6125±0.0719），P＜0.05]，KGM各劑量組增強(qiáng)，其中KGM高劑量組最強(qiáng)[（0.8198±0.0251）比（0.6125±0.0719），P＜0.05]；與CTX組比較，KGM各劑量組的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)能力均增強(qiáng)[（0.6338±0.1027）、（0.70±0.0966）、（0.8198±0.0251）比（0.4055±0.2295），P＜0.05]。（4）與對照組比較，CTX組IL-2下降[（434.43±44.64）pg/mL比（552.98±27.99）pg/mL，P＜0.05]，KGM各劑量組上升[（664.69±30.46）pg/mL、（830.83±71.42）pg/mL、（1058.47±70.58）pg/mL比（552.98±27.99）pg/mL，P＜0.05]，且KGM各劑量組兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論KGM通過提高Lewis肺癌小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖，上調(diào)脾細(xì)胞IL-2表達(dá)，提高其免疫功能，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

小鼠；Lewis肺癌；魔芋葡甘露聚糖；T淋巴細(xì)胞；細(xì)胞因子

中藥蛇六谷，又名魔芋，為天南星科魔芋屬（Amorphophallus）多年生草本植物的塊莖，據(jù)《中藥大辭典》中記載：本品性寒味辛，有毒，內(nèi)服有化痰消積、解毒散結(jié)、行瘀止痛的功效[1]，為江浙一帶臨床常用的抗腫瘤中藥[2]。魔芋葡甘露聚糖（konjacmannan，KGM）是蛇六谷主要有效成分，也是其發(fā)揮抗腫瘤作用的主要成分之一[3]。本實驗以Lewis肺癌移植瘤C57BL/6小鼠為模型，觀察魔芋葡甘露聚糖對小鼠免疫功能的影響，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級近交C57BL/6純系小鼠50只，Lewis荷瘤小鼠4只，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量16～20g，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。動物合格證號：SCXK：（滬）2013-0016，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心SPF級動物房。

1.2 藥物與試劑 魔芋葡甘露聚糖：成都市圣特蒙魔芋微粉有限責(zé)任公司，純度＞90%，批號140305。環(huán)磷酰胺（CTX）：山西普德藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：0.2g/瓶，批號04141103。RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清：美國Gibco公司。PBS（磷酸鹽緩沖液）：吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

1.3 造模及分組方法 在無菌條件下，頸椎脫臼法處死4只Lewis肺癌荷瘤小鼠，剖取生長良好的新鮮腫瘤組織，剔除纖維包膜和壞死組織，剪碎，勻漿，過濾制成瘤細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL，接種于50只C57BL/6小鼠右腋窩皮下，每只接種0.2mL（含瘤細(xì)胞數(shù)2×104個），30min內(nèi)完成。隨機(jī)分為KGM高、中、低劑量組、對照組、CTX組，每組10只。

1.4 給藥方法 建模第2天起，KGM高、中、低劑量按300mg/（kg·d）、200mg/（kg·d）、100mg/（kg·d）連續(xù)灌胃13天，對照組以等劑量生理鹽水灌胃13天，環(huán)磷酰胺組按30mg/kg腹腔注射給藥每周2次，共4次。

1.5 取材及標(biāo)本處理 頸椎脫臼處死小鼠，放入75%的酒精中浸泡3min。在超凈工作臺上剝離瘤體，迅速稱重并記錄，使用10%中性甲醛溶液保存。無菌取出脾臟，稱重并記錄脾重。無菌小鑷子撕碎脾組織，過濾，離心后棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液，重懸，室溫破紅5min，離心后棄紅細(xì)胞裂解液，加入PBS重懸，離心洗滌后用含有血清的1640培養(yǎng)基重懸，待計數(shù)，加藥鋪板。計數(shù)每組細(xì)胞，每組分別取1×107個細(xì)胞，以每孔100μL鋪96孔板，每樣4個復(fù)孔。因有灌胃不當(dāng)導(dǎo)致小鼠死亡10只，最后每組取8只小鼠標(biāo)本檢測。

1.6 主要檢測指標(biāo)測定 抑瘤率（%）=（對照組瘤重平均值-用藥組瘤重平均值）/對照組瘤重平均值× 100%；脾臟指數(shù)=脾質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）×10；參照試劑盒，MTS法測定脾臟T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)；參照試劑盒方法，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測脾細(xì)胞中IL-2表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以（±s） 表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 魔芋葡甘露聚糖對Lewis肺癌小鼠腫瘤生長的影響 與對照組比較，各組瘤重均降低，其中CTX組、KGM中劑量組、KGM高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；KGM低、中、高劑量組瘤重高于CTX組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；KGM高、中、低劑量組，抑瘤率逐漸減低，兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組小鼠瘤重和抑瘤率比較（±s）

表1 各組小鼠瘤重和抑瘤率比較（±s）

注：與對照組比較，△P＜0.05；與CTX組比較，▲P＜0.05；KGM：魔芋葡甘露聚糖；CTX：環(huán)磷酰胺

鼠數(shù)組別對照組CTX組KGM低劑量組KGM中劑量組KGM高劑量組8 8 8 8 8瘤重（g）2.51±1.11▲0.69±0.50△2.15±0.88▲1.71±0.95△▲1.54±0.83△▲抑瘤率（%）-72.56 14.27 31.92 38.59

2.2 魔芋葡甘露聚糖對Lewis肺癌小鼠脾臟指數(shù)的影響 與對照組比較，CTX組脾臟指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），KGM低、中、高劑量組脾臟指數(shù)升高，其中KGM中、高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與CTX組比較，中藥各劑量組脾臟指數(shù)均升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠脾臟指數(shù)比較（mg/g，±s）

表2 各組小鼠脾臟指數(shù)比較（mg/g，±s）

注：與對照組比較，△P＜0.05；與CTX組比較，▲P＜0.05；KGM：魔芋葡甘露聚糖；CTX：環(huán)磷酰胺

組別對照組CTX組KGM低劑量組KGM中劑量組KGM高劑量組鼠數(shù)8 8 8 8 8脾臟指數(shù)4.61±0.69▲2.73±1.19△5.52±1.21▲5.93±0.88△▲6.02±1.47△▲

2.3 魔芋葡甘露聚糖對Lewis肺癌小鼠脾臟T細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響 與對照組比較，CTX組T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)能力下降（P＜0.05），KGM低、中、高劑量組T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)能力增強(qiáng)，其中KGM高劑量組最強(qiáng)（P＜0.05）；與CTX組相比，KGM低、中、高劑量組的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)能力均增強(qiáng)（P＜0.05），見表3。

表3 各組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)比較（±s）

表3 各組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)比較（±s）

注：與對照組比較，△P＜0.05；與CTX組比較，▲P＜0.05；KGM：魔芋葡甘露聚糖；CTX：環(huán)磷酰胺

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2.4 魔芋葡甘露聚糖對Lewis肺癌小鼠脾細(xì)胞IL-2反應(yīng)的影響 ELISA結(jié)果顯示，與對照組比較，CTX 組IL-2下降（P＜0.05），中藥各劑量組上升（P＜0.05），且中藥各劑量組兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表4。

表4KGM對Lewis肺癌小鼠脾細(xì)胞IL-2的影響（pg/mL±s）

表4KGM對Lewis肺癌小鼠脾細(xì)胞IL-2的影響（pg/mL±s）

注：與對照組比較，△P＜0.05；與CTX組比較，▲P＜0.05；中藥各劑量組兩兩比較，*P＜0.01；KGM：魔芋葡甘露聚糖；CTX：環(huán)磷酰胺；IL-2：白細(xì)胞介素-2

組別對照組CTX組KGM低劑量組KGM中劑量組KGM高劑量組鼠數(shù)8 8 8 8 8 IL-2 552.98±27.99▲434.43±44.64△664.69±30.46△*▲830.83±71.42△*▲1058.47±70.58△*▲

3 討論

研究[3]顯示，蛇六谷中含50%～60%的魔芋葡甘露聚糖（KGM），KGM是其主要的有效成分，也是發(fā)揮抗腫瘤作用的主要成分之一。自上世紀(jì)八十年代有研究[3]表明KGM具有抑制小鼠自發(fā)性肝腫瘤和大鼠誘發(fā)性結(jié)腸癌作用以來，對于KGM抗腫瘤作用及其機(jī)理研究不斷拓展。Wu等[4]用5%～10%KGM飼料喂飼小鼠25周能使腫瘤發(fā)生率從100.0%下降至50.0%，表明KGM具有顯著的預(yù)防腫瘤作用。王玲等[5]報道魔芋精粉（含KGM88.9%）在二甲肼誘發(fā)大鼠腸癌中對糞中性類固醇排出的影響,在一定程度上證實了高KGM含量的魔芋精粉在攝入后相對稀釋了腸道致癌原，降低大腸中致癌物濃度。

本實驗結(jié)果顯示，KGM各組與對照組比較，瘤重均降低，其中CTX組降低最明顯，說明化療藥物抑制腫瘤的效果突出，KGM中、高劑量組瘤重也有明顯降低（P＜0.05），表明KGM對Lewis肺癌生長起到一定的抑制作用。同時，與對照組相比，CTX組脾臟指數(shù)降低，KGM各組脾臟指數(shù)升高，顯示KGM對Lewis肺癌小鼠免疫器官脾臟有一定的保護(hù)作用。

腫瘤能夠在人體內(nèi)發(fā)生并持續(xù)發(fā)展，是由于腫瘤細(xì)胞在長期的形成過程中，形成了多重免疫逃逸機(jī)制，躲避了免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，機(jī)體的免疫系統(tǒng)出現(xiàn)障礙，因此無法對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行識別和殺傷[6-8]?？鼓[瘤免疫效應(yīng)可分為細(xì)胞免疫和體液免疫，而細(xì)胞免疫占主導(dǎo)地位。細(xì)胞免疫應(yīng)答主要是T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫，已證明T細(xì)胞具有有效的抗腫瘤作用[9]。IL-2是免疫系統(tǒng)的重要因子，是保障機(jī)體正常免疫功能的關(guān)鍵因素。IL-2可激發(fā)免疫效應(yīng)器細(xì)胞，產(chǎn)生各種繼發(fā)的細(xì)胞因子，如γ-干擾素（IFNγ）和腫瘤壞死因子（TNF）等。IL-2是機(jī)體最主要、最強(qiáng)有力的T細(xì)胞生長因子，能刺激T細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞分裂周期，增強(qiáng)T細(xì)胞的殺傷活性，更有效的誘導(dǎo)抗腫瘤免疫[10]。本實驗顯示，KGM各組T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)增強(qiáng)（P＜0.05），提示KGM可促進(jìn)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖，可能增強(qiáng)荷瘤小鼠T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能。T淋巴細(xì)胞按照功能和表面標(biāo)志可以分成很多種類，因?qū)嶒灄l件和標(biāo)本受限，本實驗未進(jìn)一步分離檢測T淋巴細(xì)胞亞群，即CD4+、CD8+、CD25+T細(xì)胞增殖活力情況，因此，KGM調(diào)節(jié)小鼠脾臟T細(xì)胞增殖的機(jī)理值得繼續(xù)研究。與CTX組比較，KGM各劑量組IL-2水平顯著提高，提示KGM治療后小鼠的細(xì)胞免疫功能得到增強(qiáng)（P＜0.05），KGM能上調(diào)IL-2，這可能是其促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖的一個重要機(jī)制之一，同時也可能是其抗腫瘤作用的機(jī)制之一。

本研究僅對KGM抑制腫瘤生長和對免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了初步探討，關(guān)于KGM抗腫瘤的機(jī)制可能還有很多，如誘導(dǎo)細(xì)胞分化、凋亡、抑制腫瘤新生血管形成、抗氧化等，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典［M］.第2版.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：3855.

［2］《浙江藥用植物志》編寫組.浙江藥用植物志（下冊）［M］.杭州：浙江科學(xué)技術(shù)出版社，1980：1475-1479.

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（收稿：2015-12-09 修回：2016-01-22）

Effect of Konjac Glucomannan on Immune Function in Lewis Lung Cancer Cell Transplanted Mice

PAN Lei1,ZHOU Fei2,CHEN Peifeng1. 1 Department of Oncology,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China;2 Department of Oncology,the First People's Hospital of Xiaoshan Distict,Hangzhou(311200),China

ObjectiveTo investigate the effect of the traditional Chinese medicine Rhizoma amorphophalli extract-konjac glucomannan（KGM）on immune function in rats with Lewis lung cancer.Methods Lewis lung cancer transplanted mice were established,then randomly assigned to 5 groups：KGM high-dose group,KGM middle-dose group,KGM low-dose group,control group and cyclophosphamide（CTX）group.From day 2 after modeling,rats in KGM high-,middle-,and low-dose groups were intragastrically treated with 300mg/kg，200 mg/kg,and 100mg/kg of KGM once daily for 13 d.Control group was given equivalent volume of saline for the same period of time. CTX Group was treated with CTX 30mg/kg,intraperitoneally 2 times weekly,in a total of 4 times.The mice were sacrificed on day 14 to weigh the neoplasms and spleen and calculate the inhibition rate of tumor,spleen index. MTS method was used to detect the splenic T lymphocyte proliferation vitality,ELISA method was used to detect the expression of IL-2 in splenic cells.ResultsCompared with control group,the tumor weight in CTX group,KGM middle-and high-dose groups were significantly lower（0.69±0.5g,1.71±0.95g,1.54±0.83g vs 2.51±1.11g,P＜0.05）;but the tumor weight in KGM low-（2.15±0.88g）,middle-,and high-dose groups were higher than that in CTX group（P＜0.05）.Compared with control group,CTX group had decreased spleen index（2.73±1.19mg/g vs 4.61± 0.69mg/g,P＜0.01）,all KGM groups had increased spleen index,but only that in the middle-and high-dose groups with a statistically significant difference（5.93±0.88mg/g,6.02±1.47mg/g vs 4.61±0.69mg/g,P＜0.01）.Compared with control group,the T-lymphocytes proliferation response ability in CTX group was decreased（0.4055±0.2295 vs 0.6125±0.0719,P＜0.05）,that in all KGM groups were enhanced,with the strongest in KGM high-dose group （0.8198±0.0251 vs 0.6125±0.071,P＜0.05）;the T-lymphocytes proliferation response ability in all KGM groups were higher than that in CTX group（0.6338±0.1027,0.7000±0.0966,0.8198±0.0251 vs 0.4055±0.2295,P＜0.05）. Compared with control group,CTX group had reduced IL-2（434.43±44.64pg/mL vs 552.98±27.99pg/mL,P＜0.01）, KGM high-,middle-,and low-dose groups had elevated IL-2（664.69±30.46pg/mL,830.83±71.42pg/mL,1058.47± 70.58pg/mL vs 552.98±27.99pg/mL,P＜0.01);a significant difference was noted between KGM groups（P＜0.01）.ConclusionKGM can inhibit the growth of Lewis lung cancer in mice by improving immune function through enhancing splenic T-lymphocyte proliferation and raising the expression of IL-2.

mice;Lewis lung cancer;konjac glucomannan;T-lymphocyte;cytokine

浙江省自然科學(xué)基金項目（No.LY13H290012）

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科（杭州 310006）；2杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院腫瘤科（杭州 311200）

陳培豐，Tel：0571-87072196；E-mial：CPF12345@163.com