高效液相色譜法測(cè)定動(dòng)物性食品中馬波沙星殘留量的研究

賈國賓，蘇然平，劉欣，魏麗娟*，瞿紅穎，宋婷婷，耿智霞，賈興，魏占勇，黃顯會(huì)

(1.河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司，石家莊050041；2.河北省獸藥工程技術(shù)研究中心，石家莊050041；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州510642)

高效液相色譜法測(cè)定動(dòng)物性食品中馬波沙星殘留量的研究

賈國賓1,2，蘇然平1,2，劉欣1,2，魏麗娟1,2*，瞿紅穎1,2，宋婷婷1,2，耿智霞1,2，賈興1,2，魏占勇1,2，黃顯會(huì)3

(1.河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司，石家莊050041；2.河北省獸藥工程技術(shù)研究中心，石家莊050041；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州510642)

建立了高效液相色譜法測(cè)定豬肝臟、肌肉、腎臟、脂肪等組織中馬波沙星殘留量的方法。以氧氟沙星為內(nèi)標(biāo)物，將經(jīng)過前處理的樣品用高效液相色譜儀測(cè)定。經(jīng)驗(yàn)證，馬波沙星在肝臟、肌肉等組織中的濃度在0.02～10 μg/g范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r≥0.999；方法檢出限為0.01 μg/g，最低定量限為0.02 μg/g；在動(dòng)物組織中以不同水平添加馬波沙星，其回收率均在70%～120%之間，批內(nèi)變異系數(shù)≤10%，批間變異系數(shù)≤15%。該殘留檢測(cè)方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確度及精密度高等優(yōu)點(diǎn)，滿足動(dòng)物性食品安全檢測(cè)的要求。

高效液相色譜法；動(dòng)物性食品；馬波沙星；殘留量

馬波沙星(Marbofloxacin)是一種動(dòng)物專用的新型氟喹諾酮類抗菌藥，由瑞士羅氏公司研制。該藥在1995年首次在英國上市，先后被英國、法國、美國和歐洲批準(zhǔn)用于牛呼吸道感染和大腸桿菌引起的急性乳房炎、豬的無乳綜合癥，以及犬、貓的胃腸道感染、呼吸道感染和泌尿道感染，具有抗菌譜廣，抗菌活性強(qiáng)的特征[1-3]。馬波沙星在動(dòng)物體內(nèi)分布廣泛，耐受性良好，與其他抗菌藥物無交叉耐藥性等特征，且其生物利用度高，毒性低，被列為動(dòng)物專用藥[4-6]。

近年來，隨著氟喹諾酮類藥物的普遍使用，其殘留檢測(cè)技術(shù)已被國內(nèi)外廣泛研究，目前的檢測(cè)方法主要包括高效液相色譜法、液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳法、酶聯(lián)免疫法等[7-8]，還有許多中外文獻(xiàn)報(bào)道了同時(shí)測(cè)定多種氟喹諾酮類藥物殘留的研究[9-11]。但具體針對(duì)馬波沙星在動(dòng)物性食品中的殘留檢測(cè)技術(shù)研究較少。馬波沙星注射液作為一種新獸藥，其研制用于治療母豬乳腺炎-子宮炎-無乳綜合癥，為了客觀、科學(xué)地評(píng)價(jià)馬波沙星注射液在豬體內(nèi)的殘留消除規(guī)律，制定合理的臨床給藥方案，并且為了保證動(dòng)物性食品的質(zhì)量安全性，建立了馬波沙星在豬組織中殘留檢測(cè)的HPLC方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)備 高效液相色譜儀(DIONEX Ultimate 3000，戴安)；分析天平(AE160，Mettler)；離心機(jī)(Mach 1.6R，Thermo)；旋渦混合儀(MSI，IKA)；多功能振蕩器(HS250 Basic，IKA)；氮?dú)鉂饪s儀(TurboVap LV，Zymark)；可調(diào)微量移液器(Eppendorf Research，EPPENDORF)。

1.2 試劑 馬波沙星對(duì)照品(批號(hào)為Y0000819，購自歐洲藥典委員會(huì))；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司)；水(符合GB/T 6682規(guī)定的二級(jí)水)；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 試液的配制

1.3.1 馬波沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液 精密稱取適量的馬波沙星對(duì)照品，用適量乙酸溶解，甲醇稀釋，制成1000 μg/mL的馬波沙星標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液；再分別量取適量的馬波沙星標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，用50%甲醇水溶液稀釋制成濃度系列為0.20、0.50、1.00、3.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100 μg/mL的馬波沙星標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(4℃保存)。1.3.2 氧氟沙星(內(nèi)標(biāo))標(biāo)準(zhǔn)溶液 精密稱取適量氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并稀釋制成500 μg/mL氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液；準(zhǔn)確量取適量的氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，用50%甲醇水溶液稀釋制成濃度10 μg/mL氧氟沙星(內(nèi)標(biāo))標(biāo)準(zhǔn)工作液(4℃保存)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：CNWsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈∶2%甲酸∶1%三乙胺∶水=18∶38∶38∶6(V/V/V/V)；流速：1 mL/min；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長：295 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。1.4.2 樣品處理 肌肉、腎臟、心臟、肺臟、注射部位、皮脂的提取方法：稱取1 g(±0.01 g)試樣(冷凍試樣應(yīng)解凍至室溫)，置于50 mL離心管中。加入100 μL內(nèi)標(biāo)(氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液，10 μg/mL)，靜置3 min，加入5 mL三氯甲烷，旋渦1 min，置搖床上300 r/min振蕩10 min后在4 ℃下離心。上清轉(zhuǎn)移至15 mL試管內(nèi)。重復(fù)一次，合并上清液。上清液在45 ℃下N2吹干，用1 mL流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋，轉(zhuǎn)移上清液，正己烷除脂，離心后取適量溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾至樣品瓶中，供HPLC測(cè)定[12]。

肝臟的提取方法：稱取(1±0.01) g試樣(冷凍試樣應(yīng)解凍至室溫)，同上述方法加入內(nèi)標(biāo)，靜置3 min，加入5 mL磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)，旋渦1 min，振蕩10 min，在4℃下10000 r/min離心10 min。上清轉(zhuǎn)移至50 mL離心管內(nèi)。重復(fù)一次，合并上清液。加入適量氯化鈉，搖勻，再加入5 mL三氯甲烷，渦旋、振蕩、離心，轉(zhuǎn)移有機(jī)相至15 mL試管內(nèi)，重復(fù)一次，合并有機(jī)相，45 ℃下N2吹干，用1 mL流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋，轉(zhuǎn)移上清液，正己烷除脂，離心后取適量溶液過濾，供HPLC測(cè)定。

1.4.3 測(cè)定法 根據(jù)試樣溶液中馬波沙星殘留量情況，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線或單點(diǎn)校準(zhǔn)。

1.4.4 空白試驗(yàn) 除不加試驗(yàn)藥品外，采用相同的方法進(jìn)行平行操作。1.4.5 靈敏度 方法的靈敏度以檢測(cè)限和定量限表示。檢測(cè)限和定量限的測(cè)定方法為在空白組織中添加馬波沙星系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，制成含馬波沙星藥物濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.05、0.10 μg/g的加標(biāo)試樣進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算信噪比的平均值。以信噪比S/N=3時(shí)定為最低檢測(cè)限LOD，S/N=10時(shí)定為最低定量限LOQ(n=5)。

1.4.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 在50 mL的離心管中分別稱取1 g空白組織，依次加入一系列己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，制成含馬波沙星濃度分別為0.02、0.05、0.15、0.3、0.5、1、2、5、10 μg/g、含氧氟沙星(內(nèi)標(biāo))濃度為1 μg/g的組織樣品。按照組織樣品處理方法處理后，進(jìn)樣分析。以測(cè)得的馬波沙星的峰面積與氧氟沙星(內(nèi)標(biāo))的峰面積之比(S)與藥物濃度(C)作線性回歸，求標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)。

1.4.7 回收率和變異系數(shù)測(cè)定 在1 g空白組織中加入馬波沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液，制成含馬波沙星濃度為0.02、0.15、3.00 μg/g的肝臟、腎臟、肌肉組織樣品，添加濃度為0.02、0.15、1.00 μg/g的脂肪組織樣品。按照樣品處理方法處理后，進(jìn)樣分析。每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定5次，以樣品中藥物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比，求得低、中、高3種濃度的回收率，計(jì)算各組變異系數(shù)(CV%)，驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度與精密度。

2 結(jié)果

2.1 靈敏度 經(jīng)過試驗(yàn)測(cè)定，本方法最低定量限為0.02 μg/g，最低檢測(cè)限為0.01 μg/g，表明方法的靈敏度良好，滿足殘留檢測(cè)的要求。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 試驗(yàn)測(cè)得結(jié)果如表1中所示，在肝臟、肌肉、腎臟和脂肪組織中，馬波沙星濃度在0.02～10 μg/g范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好，各相關(guān)系數(shù)r≥0.999。

表1 組織樣品中添加馬波沙星的線性關(guān)系

2.3 回收率和變異系數(shù)測(cè)定 對(duì)添加不同濃度馬波沙星的組織樣品重復(fù)測(cè)定5次，其測(cè)定結(jié)果及計(jì)算所得的回收率與變異系數(shù)如表2至表5所示。由表中數(shù)據(jù)可知：在豬的肝臟、肌肉、腎臟組織樣品中，馬波沙星在0.02、0.15、3.00 μg/g三個(gè)添加水平上的回收率在70%～120%，批內(nèi)變異系數(shù)CV≤10%，批間變異系數(shù)CV≤15%；在豬的脂肪組織樣品中，馬波沙星在0.02、0.15、1.00 μg/g三個(gè)添加水平上的回收率分別在70%～120%，批內(nèi)、批間變異系數(shù)CV≤10%。證明方法的準(zhǔn)確度與精密度良好。

表2 肝臟組織中馬波沙星的回收率和變異系數(shù)

表3 肌肉組織中馬波沙星的回收率和變異系數(shù)

表4 腎臟組織中馬波沙星的回收率和變異系數(shù)

表5 脂肪組織中馬波沙星的回收率和變異系數(shù)

3 討論

3.1 樣品前處理方法的優(yōu)化 動(dòng)物源食品中基質(zhì)干擾復(fù)雜，富含脂肪和蛋白質(zhì)等多種物質(zhì)，選擇并優(yōu)化樣品的前處理方法對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性尤為重要。本研究參考文獻(xiàn)[12]中的方法進(jìn)行，對(duì)肌肉、腎臟、脂肪等組織樣品進(jìn)行處理，但在提取肝臟樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)提取出的樣品經(jīng)過高效液相色譜檢測(cè)雜質(zhì)較多，所以采用磷酸鹽緩沖液提取并離心取上清液的方法處理，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)提取液磷酸鹽緩沖液的pH值對(duì)肝臟中馬波沙星藥物殘留檢測(cè)結(jié)果影響較大，未經(jīng)pH調(diào)節(jié)時(shí)，肝臟中殘留檢測(cè)回收率不穩(wěn)定，當(dāng)提取液的pH值到7.4時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果較好。所以先用pH 7.4的磷酸鹽提取，離心取上清液，再以三氯甲烷萃取，可減少肝臟樣品中其他成分對(duì)檢測(cè)的干擾，并且經(jīng)過檢測(cè)，此方法測(cè)得的樣品中馬波沙星藥物的回收率準(zhǔn)確且穩(wěn)定。

3.2 色譜條件的選擇與優(yōu)化 馬波沙星為氟喹諾酮類藥物，結(jié)構(gòu)式中含有羧基和哌嗪基，屬于酸堿兩性化合物，反相液相色譜分析時(shí)，色譜峰容易拖尾，通常選擇酸性溶液作為流動(dòng)相的組成部分，同時(shí)還加入四丁基溴化銨或三乙胺等掃尾劑以獲得好的峰形。本試驗(yàn)嘗試了乙腈、乙酸、甲酸、H3PO4、四丁基溴化銨、三乙胺、KH2PO4之間多種配比的流動(dòng)相條件，經(jīng)多次比較優(yōu)化，綜合考慮色譜峰的峰值響應(yīng)、保留時(shí)間以及與雜質(zhì)峰的分離情況，選擇乙腈、甲酸與三乙胺的配比作為流動(dòng)相，選擇的比例為乙腈∶2%甲酸∶1%三乙胺∶水=18∶38∶38∶6，此時(shí)色譜圖基線平穩(wěn)、峰型良好，內(nèi)標(biāo)與馬波沙星的保留時(shí)間適宜，彼此能夠很好的分離且與基質(zhì)中的雜質(zhì)峰也能夠達(dá)到分離要求。

4 結(jié)論

本研究針對(duì)新獸藥馬波沙星注射液應(yīng)用后在動(dòng)物性食品中的殘量檢測(cè)，建立了高效液相色譜法。該研究具體針對(duì)馬波沙星注射液使用后，在豬的各組織中的殘留檢測(cè)建立了高效液相色譜方法。建立的方法為內(nèi)標(biāo)法，氧氟沙星作為內(nèi)標(biāo)物，其加入校準(zhǔn)和消除了出于操作條件的波動(dòng)對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，提高了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度。該方法可用于檢測(cè)豬肌肉、肝臟、腎臟及脂肪等多種組織中馬波沙星藥物的殘留，并且經(jīng)試驗(yàn)研究驗(yàn)證，方法的靈敏度、準(zhǔn)確度與精密度均良好，可用于動(dòng)物性食品中馬波沙星殘留量的檢測(cè)。

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(編輯：陳希)

Determination of Marbofloxacin Residues in Animal Derived Food by HPLC

JIA Guo-bin1,2, SU Ran-ping1,2, LIU Xin1,2, WEI Li-juan1,2*, QU Hong-ying1,2, SONG Ting-ting1,2,GENG Zhi-xia1,2, JIA Xing1,2, WEI Zhan-yong1,2, HUANG Xian-hui3

(1.HebeiYuanzhengPharmaceuticalCo.,Ltd.,Shijiazhuang050041,China; 2.HebeiEngineeringResearchCenterofVeterinaryDrugs,Shijiazhuang050041,China; 3.SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China)

A method based on high performance liquid chromatography (HPLC) has been developed for the determination of marbofloxacin in pig liver, muscle, kidney, fat and other tissues. After pretreatment, the tissue samples were analyzed by high performance liquid chromatograph with ofloxacin as an internal standard. The verified results were that: a good linear relationship was obtained for concentration range of 0.02～10 μg/g in the liver, muscle and other tissues (r≥0.999); the detection limit of the method was 0.01 μg/g and the lowest limit of quantification was 0.02 μg/g; in animal tissues, marbofloxacin was added at different levels and the recoveries were at the range of 70%～120%, the intra-assay coefficient of variation was ≤10% and the inter-assay coefficient of variation was ≤15%. The residue detection method had the advantage of high sensitivity, accuracy and precision and it could meet the safety test requirements of animal derived food.

high performance liquid chromatography; animal derived food; marbofloxacin; residues

賈國賓，高級(jí)工程師，從事藥物制劑方面的研究。

魏麗娟。E-mail：yuanchengcheng@sina.com

2016-01-25

A

1002-1280 (2016) 08-0039-05

S859.84