黃顙魚(yú)cGnRH基因的篩選鑒定及生物信息學(xué)分析

王樂(lè)，盧建國(guó)，王平平，欒培賢，王秋實(shí)，孫效文

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱150070）

黃顙魚(yú)cGnRH基因的篩選鑒定及生物信息學(xué)分析

王樂(lè)，盧建國(guó)，王平平，欒培賢，王秋實(shí)，孫效文

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱150070）

本研究在前期已獲得的黃顙魚(yú)Pelteobagrus fulvidraco轉(zhuǎn)錄組基礎(chǔ)上，利用BLAST程序從中篩選獲得黃顙魚(yú)cGnRH基因的候選序列，再通過(guò)氨基酸序列分析從中篩選獲得cGnRH的全長(zhǎng)cDNA為261bp，編碼86個(gè)氨基酸，其核心十肽的序列為QHWSHGWYPG，相對(duì)分子質(zhì)量為9 755.5、理論P(yáng)I值為9.02。序列同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)：黃顙魚(yú)與斑馬魚(yú)Danio rerio、草魚(yú)Ctenopharyngodon idella、鯉Cyprinus carpio中cGnRH氨基酸的相似性分別高達(dá)70.93%、68.60%和67.44%。用MEGA構(gòu)建的黃顙魚(yú)與其他27種硬骨魚(yú)cGnRH的Neighbour-joining進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，黃顙魚(yú)cGnRH先與脂鯉科的墨西哥麗脂鯉Astyanax mexican共聚類，再依次與鯉科的斑馬魚(yú)、草魚(yú)、黑頭呆魚(yú)Pimephales promelas、稀有鮈鯽Gobiocypris rarus等魚(yú)的cGnRH序列聚類。本研究首次篩選獲得黃顙魚(yú)的cGnRH序列，并利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行鑒定分析，為后續(xù)的基因表達(dá)和cGnRH調(diào)節(jié)生長(zhǎng)生殖作用的研究提供序列資源及基礎(chǔ)。

黃顙魚(yú)；促性腺激素釋放激素；序列分析

黃顙魚(yú)Pelteobagrus fulvidraco主要產(chǎn)于長(zhǎng)江支流，廣泛分布于長(zhǎng)江、黑龍江、珠江等內(nèi)陸水域[1]。黃顙魚(yú)肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美，無(wú)肌間刺，富含蛋白質(zhì)，是一種重要的淡水魚(yú)類，深受消費(fèi)者喜愛(ài)的美味，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在日本、韓國(guó)、東南亞等國(guó)家亦有巨大的市場(chǎng)，是出口創(chuàng)匯的優(yōu)良魚(yú)類[2]。但由于其生長(zhǎng)較為緩慢，雌魚(yú)更甚，限制了黃顙魚(yú)的養(yǎng)殖及推廣[3]。

促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）是一個(gè)保守的神經(jīng)家族，具有調(diào)節(jié)生物性腺發(fā)育和誘導(dǎo)性成熟的作用。經(jīng)過(guò)幾十年的研究，已從多種脊椎動(dòng)物和硬骨魚(yú)中獲得GnRH的基因序列[4]。一般在硬骨魚(yú)中有3種類型的GnRH基因：sbGnRH、cGnRH及sGnRH，其中sbGnRH的主要功效為調(diào)節(jié)促性腺激素的合成與釋放；cGnRH作為神經(jīng)遞質(zhì)間接參與魚(yú)類生長(zhǎng)的生殖調(diào)節(jié)；sGnRH的功能與cGnRH相近，但并不存在于所有的硬骨魚(yú)中[5]。cGnRH廣泛存在于各種脊椎動(dòng)物中，處于高度保守的進(jìn)化地位[6]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于黃顙魚(yú)中GnRH基因的研究還處于初級(jí)階段。本研究在前期已獲得的黃顙魚(yú)轉(zhuǎn)錄組基因數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，通過(guò)初步篩選、分析鑒定黃顙魚(yú)的cGnRH基因，為后續(xù)探索GnRH基因在黃顙魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育及生殖代謝中的作用提供基因序列基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 候選基因的篩選與獲得

利用BLAST程序?qū)⒈菊n題組前期已測(cè)序獲得的黃顙魚(yú)轉(zhuǎn)錄組基因數(shù)據(jù)與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索數(shù)據(jù)庫(kù)中已公開(kāi)發(fā)布的硬骨魚(yú)cGnRH基因進(jìn)行比對(duì)，從中選擇相似度高的基因序列作為候選序列待測(cè)。

1.2 候選基因確定

利用DNAMAN 6.0軟件獲取候選基因的開(kāi)放讀碼框序列（ORF）和各基因的氨基酸序列，比對(duì)核心十肽的序列，篩選獲得cGnRH的準(zhǔn)確序列。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用Expasy的Protparam工具分析cGnRH基因所編碼氨基酸序列的基本理化性質(zhì)，如相對(duì)分子質(zhì)量、理論P(yáng)I值、氨基酸組成及不穩(wěn)定系數(shù)等信息；用Expasy的SOPMA功能分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用PredictProtein平臺(tái)進(jìn)行功能預(yù)測(cè)與注釋。

1.4 親緣關(guān)系的分析

選取數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的其他種屬魚(yú)的cGnRH氨基酸序列，用Clustal X軟件比較、整理氨基酸序列的同源性，利用MEGA構(gòu)建cGnRH的Neighbour-joining進(jìn)化樹(shù)，重復(fù)抽樣1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃顙魚(yú)cGnRH的序列分析

黃顙魚(yú)cGnRH的全長(zhǎng)cDNA為261bp，編碼86個(gè)氨基酸（圖1），含有23個(gè)信號(hào)肽，其核心十肽的序列為QHWSHGWYPG。Expasy的Protparam工具分析結(jié)果表明：cGnRH的相對(duì)分子質(zhì)量為9 755.5、理論P(yáng)I值為9.02，亮氨酸Leu（L）的含量最高，為17.4%，且不含有氨基酸Pyl（O）和Sec（U）。帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）為8個(gè)，而帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg+Lys）為12個(gè)；理論計(jì)算得到的分子式為C441H708N120O119S5，總原子數(shù)為1 393個(gè)。除此之外，其不穩(wěn)定系數(shù)為37.28，說(shuō)明該蛋白比較穩(wěn)定。脂肪系數(shù)為106.63，總平均吸水?dāng)?shù)為-0.029。為了更好地理解分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用DNAMAN軟件分析該cGnRH氨基酸序列的親水性（圖2）。

圖1 黃顙魚(yú)cGnRH的全長(zhǎng)cDNA及氨基酸序列Fig.1 The full-length cDNA sequence and amino acid sequence of cGnRH in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco

圖2 cGnRH的氨基酸序列親水性分析Fig.2 Hydrophilic analysis of amino acid sequence of cGnRH in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco

用Expasy的SOPMA功能分析得到cGnRH氨基酸序列的α螺旋、β折疊及其他的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3）。用PredictProtein平臺(tái)分析序列得到氨基酸組成示意圖（圖4），對(duì)序列的多功能區(qū)域進(jìn)行注釋及特征預(yù)測(cè)所得到的結(jié)果如圖5所示。

2.2 cGnRH的比對(duì)分析

將本研究鑒定獲得的黃顙魚(yú)cGnRH氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的斑馬魚(yú)（NP_852104.3）、草魚(yú)（ACH78253.1）及鯉（AAO39753.1）等硬骨魚(yú)的cGnRH氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。Clustal X比對(duì)結(jié)果表明，各硬骨魚(yú)的cGnRH氨基酸序列具有很高的相似性（圖6）。DNAMAN軟件分析的相似度結(jié)果表明，黃顙魚(yú)的cGnRH氨基酸序列與斑馬魚(yú)、草魚(yú)、鯉的相似性分別為70.93%、68.60%及67.44%。它們之間共同的相似性高達(dá)87.79%。這些比對(duì)結(jié)果證明了cGnRH保守性極高的同時(shí)，也進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究所得序列的正確性。

2.3 親緣關(guān)系分析

選取NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已公開(kāi)發(fā)表的其他27個(gè)種屬硬骨魚(yú)的cGnRH氨基酸序列構(gòu)，采用其他種屬硬骨魚(yú)的檢索信息（表1），利用MEGA 4.0構(gòu)建黃顙魚(yú)cGnRH的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖7）。結(jié)果表明：黃顙魚(yú)cGnRH先與脂鯉科的墨西哥麗脂鯉Astyanax mexican共聚類，再依次與鯉科的斑馬魚(yú)、草魚(yú)、黑頭呆魚(yú)Pimephales promelas、稀有鮈鯽Gobiocypris rarus等的cGnRH序列聚類，說(shuō)明黃顙魚(yú)cGnRH序列與淡水魚(yú)，尤其是鯉科魚(yú)類的同源性較高，保守性較好，證明本研究所獲得的黃顙魚(yú)cGnRH序列的正確性。

圖3 黃顙魚(yú)cGnRH的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)圖Fig.3 The secondary structure of cGnRH protein in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco

圖4 cGnRH氨基酸組成示意圖Fig.4 The schematic diagram of amino acid composition of cGnRH in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco

圖5 功能注釋及特征預(yù)測(cè)Fig.5 Functional annotation and feature prediction of cGnRH in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco

表1 用于構(gòu)建親緣關(guān)系樹(shù)的其他物種序列信息Tab.1 The sequence information of other species used to construct phylogenetic trees

3 討論

本課題組前期利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)雌雄黃顙魚(yú)不同發(fā)育時(shí)期的腦及性腺組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)裝配整理及基因注釋獲得了大量的黃顙魚(yú)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)資源，在此基礎(chǔ)上針對(duì)雌雄黃顙魚(yú)性別決定基因進(jìn)行了大量的研究分析工作[7,8]。這些資源和成果為黃顙魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)和性狀研究提供了重要的基礎(chǔ)。本研究在這些成果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)生長(zhǎng)調(diào)控基因GnRH進(jìn)行挖掘和鑒定。

GnRH在魚(yú)類性腺發(fā)育和成熟的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)中起重要作用。早在20世紀(jì)80年代，方永強(qiáng)等[9]就通過(guò)注射促性腺激素釋放素類似物（GnRH-A）誘導(dǎo)文昌魚(yú)性腺過(guò)早發(fā)育。GnRH基因的突變還會(huì)導(dǎo)致生物生殖生長(zhǎng)異常變化。黎雙飛等[10]利用反義轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)了腦水平調(diào)控魚(yú)類性腺發(fā)育，獲得了敗育的轉(zhuǎn)基因鯉。這些研究充分證明了GnRH對(duì)魚(yú)類生長(zhǎng)性狀的顯著調(diào)控作用。GnRH是下丘腦分泌的由10個(gè)氨基酸構(gòu)成的高度保守的肽類物質(zhì)[11]。現(xiàn)階段已經(jīng)完成了包括鯉、斑馬魚(yú)、雙棘黃姑魚(yú)Protonibea diacanthus等在內(nèi)的許多魚(yú)類GnRH基因的序列分析及鑒定工作[12-14]。在已鑒定過(guò)的GnRH十肽中，1、4、9、10位的氨基酸序列都是完全保守的，基本結(jié)構(gòu)都是pGlu（1）—…—Ser（4）—…—Pro（9）-Gly（10）-NH2，這也為GnRH的篩選鑒定工作提供了重要的參考信息[10,15]。本研究所鑒定分析得到的黃顙魚(yú)cGnRH氨基酸序列也完全符合這一特點(diǎn)，含有23個(gè)信號(hào)肽和10個(gè)核心肽，這也與其他脊椎動(dòng)物中的cGnRH基本結(jié)構(gòu)相一致[16-18]。

圖6 黃顙魚(yú)cGnRH與其他種屬魚(yú)的氨基酸序列比對(duì)Fig.6 Comparative sequence alignment of cGnRH in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco with other teleosts

圖7 黃顙魚(yú)cGnRH的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.7 The phylogenetic tree of cGnRH in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco

魚(yú)腦中cGnRH主要分布在中腦區(qū)域，cGnRH肽不僅參與硬骨魚(yú)生長(zhǎng)激素的調(diào)節(jié)，也與一些其他垂體激素的分泌密切相關(guān)[19]。大量研究表明，生長(zhǎng)激素在調(diào)節(jié)魚(yú)類的生長(zhǎng)生殖及性別分化中具有極為重要的作用[20]。本研究所鑒定獲得的黃顙魚(yú)cGnRH基因有待后續(xù)進(jìn)一步驗(yàn)證研究基因的表達(dá)，同時(shí)也為探索cGnRH對(duì)黃顙魚(yú)生長(zhǎng)性狀的調(diào)節(jié)作用奠定了極為重要的前期工作基礎(chǔ)。

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Screening,Identification and Bioinformatics of cGnRH Gene in Yellow Catfish（Pelteobagrus fulvidraco）

WANG Le,LU Jian-guo,WANG Ping-ping,LUAN Pei-xian,WANG Qiu-shi,SUN Xiao-wen
（Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China）

In previous studies,our group has obtained transcription data of yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco,and in current study candidate sequences of cGnRH gene were screened and sequenced using the blast program and amino acid sequence analysis.Results showed that full-length cDNA of cGnRH was found to be 261 bp,encoding 86 amino acid sequences,with ten core peptides of QHW SHGWYPG,relative molecular mass of 9 755.5 and the theory PI of 9.02.The similarity of cGnRH amino acids in yellow catfish was as high as 70.93%to zebrafish Danio rerio,68.60%to grass carp Ctenopharyngodon idella,and 67.44%to common carp Cyprinus carpio.The neighbour-joining phylogenetic tree of cGnRH amino acids in yellow catfish and 27 other teleosts was established using MEGA.The cGnRH of yellow catfish was found to be co-clustered with Astyanax mexicanus in Characidae preferentially,then co-clustered with zebrafish,grass carp,Pimephales promelas and Gobiocypris rarus in Cyprinidae.The cGnRH sequence of yellow catfish was screened first time,and analyzed and identified using bioinformatics.The findings provide foundation for gene expression subsequently,and necessary sequence resources for analysis of the regulation of cGnRH in reproduction and growth.

Pelteobagrus fulvidraco;GnRH;sequence analysis.

S917.4

A

1005-3832（2016）04-0001-05

2016-04-29

黑龍江省科學(xué)基金項(xiàng)目（QC2016045）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（HSY201505）.

王樂(lè)（1988-），男，助理研究員，博士研究生，從事分子生物學(xué)與生物技術(shù)研究.E-mail:wangle0455@163.com

孫效文（1955-），研究員，博士生導(dǎo)師.