α-酮戊二酸對松浦鏡鯉腸道形態(tài)與功能的影響

李晉南，魏玉強，徐奇友，張冬梅

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

α-酮戊二酸對松浦鏡鯉腸道形態(tài)與功能的影響

李晉南1，魏玉強2，徐奇友1，張冬梅1

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

本試驗旨在研究不同蛋白源飼料中添加α-酮戊二酸（AKG）對松浦鏡鯉腸道形態(tài)與功能的影響。在水溫23℃下，將初始體質(zhì)量為（217.93±0.78）g的松浦鏡鯉Cyprinus carpio Songpu 400尾，隨機分成4組，每組5個重復(fù)，每個重復(fù)20尾魚，飼養(yǎng)在控溫循環(huán)水系統(tǒng)中，投喂4種在不同蛋白源的等氮等脂飼料中添加不同劑量的α-酮戊二酸（AKG）的飼料10周，即飼料1（44%豆粕+0%AKG）、飼料2（44%豆粕+1.5%AKG）、飼料3（30%豆粕+10%魚粉+0%AKG）、飼料4（30%豆粕+10%魚粉+1.5%AKG），飼料中蛋白質(zhì)和脂肪水平分別為28%和5.1%。結(jié)果表明：不同蛋白源飼料中添加AKG能顯著提高松浦鏡鯉后腸皺襞高度、前腸肌層厚度和前腸Na+,K+-ATP酶活性（P＜0.05）；蛋白源和AKG對腸道形態(tài)指標(biāo)和Na+,K+-ATP酶活性無顯著交互作用（P＞0.05）；飼料中蛋白源添加AKG能顯著提高松浦鏡鯉前腸和中腸蛋白酶、脂肪酶活性（P＜0.05），蛋白源和AKG對后腸蛋白酶活性具有顯著交互作用（P＜0.05）。綜上所述，飼料中添加1.5%AKG可以促進松浦鏡鯉腸道發(fā)育，增強腸道消化酶活性。

α-酮戊二酸；松浦鏡鯉；腸道形態(tài)；消化酶；Na+,K+-ATP酶

α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，AKG）是生物體三羧酸循環(huán)中重要的中間產(chǎn)物，是谷氨酰胺的前體物，在溶液中具有良好的穩(wěn)定性，能夠克服谷氨酰胺的缺點[1]。在三羧酸循環(huán)過程中，AKG能夠運載和貯存氮，參與多種氨基酸轉(zhuǎn)氨基作用，為精氨酸、鳥氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸的合成提供碳骨架。外源性AKG可以替代部分谷氨酸和谷氨酰胺，為腸黏膜細胞和腸道菌群的代謝提供能量，提高機體消化功能，誘導(dǎo)腸黏膜細胞的增殖，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[2]，減少細菌移位，維持腸道屏障功能。近年來，關(guān)于AKG對促生長、腸道發(fā)育、消化吸收及抗氧化能力等方面的影響，已經(jīng)在大鼠[2]、肉仔雞[3]以及仔豬[4,5]中進行了相關(guān)研究。通過對水產(chǎn)動物的研究表明，AKG可以提高松浦鏡鯉增重率和蛋白質(zhì)效率[6]。但AKG對水產(chǎn)動物的其他作用，還需要進一步的研究。

豆粕蛋白質(zhì)含量高、來源廣，是替代飼料魚粉的最佳植物蛋白源。但有研究表明，豆粕能引起大馬哈魚 Oncorhynchus tshawytscha和虹鱒 Oncorhynchus mykiss腸道病理變化[7,8]，而對比目魚Hippoglossus hippoglossus和鯧Pampus sinensis的腸道發(fā)育卻沒有不良影響[9,10]。本試驗在不同蛋白源飼料中添加AKG投喂松浦鏡鯉，研究不同蛋白源飼料中添加AKG對松浦鏡鯉腸道形態(tài)與功能的影響，為AKG在水產(chǎn)動物中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

AKG購自Sigma-Aldrich公司，白色粉末，純度≥98.5%。

本試驗按2×2因子設(shè)計配制成4種等氮等脂的試驗飼料，即飼料1（44%豆粕+0%AKG）、飼料2（44%豆粕+1.5%AKG）、飼料3（30%豆粕+10%魚粉+0%AKG）、飼料4（30%豆粕+10%魚粉+1.5% AKG）。飼料蛋白質(zhì)和脂肪水平分別為28%和5.1%，其飼料配方和營養(yǎng)成分見參考文獻[11]。各飼料原料粉碎后，過80目篩，逐級混合均勻，用小型顆粒機擠壓成顆粒飼料，常溫風(fēng)干后，于-20℃冰柜中保存待用。

試驗魚選自黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭試驗站。

1.2 方法

試驗選擇健康、規(guī)格一致的初始體質(zhì)量為（217.93±0.78）g的松浦鏡鯉400尾，預(yù)飼2周后，隨機分成4組，每組5個重復(fù)，每個重復(fù)20尾，在可控溫循環(huán)水系統(tǒng)中養(yǎng)殖10周，分別投喂不同試驗飼料。試驗期間，水溫23℃，溶氧大于5mg/L，氨氮小于0.1mg/L。每天8:00、13:00、18:00，飽食投喂3次，記錄投喂量和魚攝食情況，定期檢測水質(zhì)，確保水質(zhì)良好。

1.3 腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

腸道組織切片的制備：試驗結(jié)束時，將魚禁食24h，每缸隨機選取4尾魚，用麻醉劑（MS222）麻醉，置于冰盤上解剖，取腸道，去除腸表面脂肪，用冰浴的0.86%生理鹽水沖洗后去除內(nèi)容物，濾紙吸干水分，將腸道分為前腸、中腸和后腸（第一個回折拐彎點前為前腸，第二個回折拐彎處至最后一個拐彎處為中腸，最后一個回折拐彎點至肛門之間為后腸），固定于Bouin氏液中。將Bouin氏液中固定的腸道，經(jīng)過乙醇逐級脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、HE染色、脫水、透明，最后用中性樹膠封片，每段腸樣品用Motic顯微圖像系統(tǒng)（Motic Images Plus 2.0軟件）測量8個以上完整皺襞高度和肌層厚度（單位μm，成像倍數(shù)為10×100）。

1.4 腸道消化酶活性的測定

試驗結(jié)束時，按上述方法測量魚體長、體質(zhì)量，剝離腸道，測量腸長度，計算腸長指數(shù)（腸長/體長）、腸體指數(shù)（腸質(zhì)量/體質(zhì)量）。前腸、中腸和后腸分別以生理鹽水按1∶9質(zhì)量體積比，用FJ-200CL高速組織勻漿機冰浴勻漿，勻漿液4℃4 000r/min離心10min，上清液為粗酶液，分裝后保存于-20℃冰箱，用于測定蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性[12]。

1.5 腸道Na+,K+-ATP酶活性的測定

采用南京建成試劑盒測定Na+,K+-ATP酶活性，其活力單位定義為每h每g組織分解ATP產(chǎn)生1mol無機磷為1個ATP酶活單位。

1.6 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準差表示，用SPSS 17.0軟件分析，采用雙因素方差分析和Duncan′s多重比較進行統(tǒng)計，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白源和AKG劑量對松浦鏡鯉腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

松浦鏡鯉攝食添加1.5%AKG的飼料時，后腸皺襞高顯著高于不添加AKG的對照魚（P＜0.05），而在復(fù)合蛋白源中添加1.5%AKG顯著提高了中腸皺襞高度和前腸肌層厚度（P＜0.05）。與豆粕蛋白源飼料比較，復(fù)合蛋白源飼料顯著降低了中腸皺襞高度（P＜0.05）。蛋白源和AKG對前腸肌層厚度具有顯著的交互作用（P＜0.05）（表1）。

蛋白源和AKG劑量對松浦鏡鯉腸長指數(shù)和腸體指數(shù)均無顯著影響（P＞0.05）（表2）。雙因素方差分析表明，蛋白源和AKG劑量對腸長指數(shù)和腸體指數(shù)均沒有交互作用（P＞0.05）。

表1 飼料蛋白源和AKG劑量對松浦鏡鯉腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響（n=5）Tab.1 Effects of different dietary protein sources and doses of α-ketoglutarate（AKG）on intestinal morphology of Songpu mirror carp

表2 飼料蛋白源和AKG劑量對松浦鏡鯉腸道腸體指數(shù)和腸長指數(shù)的影響（n=10）Tab.2 Effects of different dietary protein sources and doses of α-ketoglutarate（AKG）on Intestine body length index and body weight index of Songpu mirror carp

表3 飼料蛋白源和AKG劑量對松浦鏡鯉腸道消化酶活性的影響（n=4）Tab.3 Effects of different dietary protein sources and doses of α-ketoglutarate（AKG）on activities of intestinal digestive enzymes in Songpu mirror carp（U/g prot）

2.2 不同蛋白源和AKG劑量對松浦鏡鯉腸道消化酶活性的影響

由表3可知，在復(fù)合蛋白源飼料中添加1.5% AKG顯著提高了松浦鏡鯉前腸和中腸蛋白酶以及脂肪酶活性（P＜0.05）；在豆粕蛋白源飼料中添加AKG顯著提高前腸和中腸蛋白酶、前腸淀粉酶和脂肪酶活性（P＜0.05）。雙因素方差分析可知，飼料中添加AKG顯著提高了前腸和中腸蛋白酶、脂肪酶活性（P＜0.05）。蛋白源和AKG對后腸蛋白酶具有顯著交互作用（P＜0.05）。

2.3 不同蛋白源和AKG劑量對松浦鏡鯉腸道Na+,K+-ATP酶活性的影響

由表4可知，在復(fù)合蛋白和豆粕蛋白源飼料中添加AKG分別顯著提高了松浦鏡鯉前腸和后腸Na+,K+-ATP酶的活性（P＜0.05）。蛋白源和AKG對腸道Na+,K+-ATP酶活性不存在交互作用（P＞0.05）。

表4 飼料蛋白源和AKG劑量對松浦鏡鯉腸道Na+,K+-ATP酶的影響（n=8）Tab.4 Effects of different dietary protein sources and doses of α-ketoglutarate（AKG）on intestinal Na+, K+-ATPase activities in Songpu mirror carp

3 討論

魚類腸道是營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的重要場所，無胃魚類松浦鏡鯉腸道的結(jié)構(gòu)功能與其生長發(fā)育更為密切相關(guān)。魚類腸道形成許多皺襞，其高度增加，微絨毛長度及粘膜厚度的增加，可以擴大腸道的表面積，增加腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力，是水生動物腸道發(fā)育和吸收能力的重要標(biāo)志[13]。有研究表明，飼料中添加豆粕對大西洋大比目魚Hippoglossus hippoglossus[14]、斑點叉尾鮰Ictalurus punctatus[15]、埃及鰨Solea aegyptiaca[16]等的腸道形態(tài)沒有顯著影響。本試驗中除中腸皺襞高度外，豆粕蛋白源飼料組與復(fù)合蛋白源飼料組相比，腸道形態(tài)沒有明顯差異。而復(fù)合蛋白源飼料組顯著降低了中腸皺襞高度，其原因有待進一步研究。飼料中添加1% AKG可以顯著提高仔豬腸道絨毛高度與隱窩深度的比值，提高絨毛表面積[13,17-19]。本試驗中，飼料中添加AKG能顯著提高松浦鏡鯉腸道皺襞高度和肌層厚度。由此可知，AKG可以改善松浦鏡鯉腸道結(jié)構(gòu)，增加腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和消化能力。這可能是因為AKG為腸上皮細胞代謝提供能量[18]，促進腸道細胞的生長發(fā)育，促進腸道皺襞高度和肌層厚度的增加。

Na+,K+-ATP酶作為一種重要的膜轉(zhuǎn)運蛋白，能分解體內(nèi)ATP，為機體的各項生理活動提供能量，其活力是腸黏膜生長發(fā)育的重要標(biāo)志之一[20]。腸道Na+,K+-ATP酶活性的升高表明腸道消化吸收能力增強。本試驗中，飼料中添加AKG顯著提高了松浦鏡鯉腸道Na+,K+-ATP酶活性，改善了腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力。有研究[21]表明，豆粕替代魚粉對建鯉的Na+,K+-ATP酶活性沒有顯著影響，這與本試驗結(jié)果一致。

腸道消化酶可以作為衡量魚類對營養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收的重要指標(biāo)[22]。動物機體生長發(fā)育的快慢與消化酶活性的高低存在一定的正相關(guān)性[23]。有研究表明，豆粕替代魚粉對翹嘴紅鲌Erythroculter Ilishaeformis Bleeker腸道淀粉酶和脂肪酶活性沒有顯著影響[24]，這與本試驗結(jié)果相一致。本試驗結(jié)果顯示，不同蛋白源飼料中添加AKG顯著提高了松浦鏡鯉前腸和中腸蛋白酶、脂肪酶活性和前腸淀粉酶活性，這與AKG可以顯著提高松浦鏡鯉前腸淀粉酶和脂肪酶的活性[12]的結(jié)果較為一致。這些結(jié)果說明，飼料中添加AKG可以提高松浦鏡鯉腸道消化酶活性，能促進腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高魚體的生長速度。其原因可能是：AKG能夠促進腸道和消化腺的生長發(fā)育，增加腸道消化酶的分泌量，提高腸道消化酶含量。飼料中添加AKG提高了松浦鏡鯉的攝食量，即提高了腸道酶消化的底物濃度，刺激了腸道消化酶活性的增加[6,12,25]。

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Effects of α-ketoglutarate Supplementation on Intestinal Morphology and Function of Songpu Mirror Carp（Cyprinus carpio Songpu）

LI Jin-nan1,WEI Yu-qiang2,XU Qi-you1,ZHANG Dong-mei1
（1.Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China; 2.College of Fisheries and Life Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China）

The aim of this study was to investigate the dietary effects of α-ketoglutarate（AKG）supplementation and protein source treatments on the intestinal morphology and function of Songpu mirror carp（Cyprinus carpio Songpu）.Four experimental diets were formulated to contain two protein sources（soybean meal or fish meal+soybean meal）and two levels of α-ketoglutarate（0%or 1.5%）. A total of 400 Songpu mirror carp with an average initial body weight of（217.93±0.78）g was divided into 4 groups reared in a recycling system and fed one of the four experimental diets at water temperature of 23℃for 10 weeks with 5 replicates per group and 20 fish per replicate.The results showed that fold height of hindgut and muscular thickness of foregut and Na+,K+-ATPase activity in foregut were significantly improved by AKG（P＜0.05）.However,there was no significant interaction influence of protein source and AKG on intestinal morphology and Na+,K+-ATPase activity（P＞0.05）.The activities of protease and lipase in foregut and midgut were shown to be significantly increased in the fish fed the diets containing the diets supplemented with AKG（P＜0.05）.There was significant interaction influence of protein source and AKG on protease activity in hindgut（P＜0.05）.It is concluded that supplementation of 1.5%AKG can promote intestine development and digestive enzyme activities in Songpu mirror carp.

α-ketoglutarate;Songpu mirror carp;intestinal morphology;digestive enzyme;Na+,K+-ATPase

S948

A

1005-3832（2016）04-0043-05

2016-04-05

中國水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費（2014A08XK03）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-46）.

李晉南（1983-），女，助理研究員，博士，從事水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料研究.E-mail:lijinnan123@163.com