提高秈稻恢復(fù)系花藥培養(yǎng)綠苗分化率的研究

劉 凱,唐紅生,嚴(yán)國(guó)紅,孫明法

(江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,江蘇 鹽城 224002)

提高秈稻恢復(fù)系花藥培養(yǎng)綠苗分化率的研究

劉 凱,唐紅生,嚴(yán)國(guó)紅*,孫明法

(江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,江蘇 鹽城 224002)

以MS培養(yǎng)基為對(duì)照,對(duì)比分析M8和N6兩種培養(yǎng)基對(duì)秈稻恢復(fù)系花藥培養(yǎng)出愈率的影響,并添加不同質(zhì)量濃度的山梨醇、活性炭，研究其對(duì)愈傷組織綠苗分化率的影響。結(jié)果表明,4個(gè)秈稻恢復(fù)系在M8培養(yǎng)基中均具有最高的出愈率,介于20.97%～30.63%,極顯著高于MS培養(yǎng)基；而在N6培養(yǎng)基上,出愈率介于10.77%～13.70%,僅鹽恢559和鹽恢888顯著高于MS培養(yǎng)基。 隨著山梨醇質(zhì)量濃度升高,4個(gè)秈稻恢復(fù)系在M8分化培養(yǎng)基上的花藥愈傷組織綠苗分化率增加,以30 g/L山梨醇處理最高,介于30.57%～36.77%,其次為20 g/L山梨醇處理,兩者均極顯著高于不添加山梨醇處理。隨著活性炭質(zhì)量濃度升高,4個(gè)秈稻恢復(fù)系在M8分化培養(yǎng)基上的花藥愈傷組織綠苗分化率先增加后降低,總體均以1 g/L處理最高,介于21.38%～27.82%,2 g/L處理次之,兩者均極顯著高于不添加活性炭處理。

秈稻； 恢復(fù)系； 花藥； 組織培養(yǎng)

花藥培養(yǎng)是一種單倍體育種技術(shù),目前已經(jīng)成功應(yīng)用于水稻育種中,它具有加快選擇效率、縮短育種周期、快速創(chuàng)新種質(zhì)材料等諸多優(yōu)勢(shì)。目前,花藥培養(yǎng)技術(shù)在水稻不育系和恢復(fù)系的復(fù)壯提純上應(yīng)用較多,采用花藥培養(yǎng)技術(shù)能使水稻育種材料中的優(yōu)勢(shì)基因高度純和,防止品種退化[1-3]。然而植物組織培養(yǎng)存在很強(qiáng)的物種依賴性和基因型特異性。在栽培稻中,一般認(rèn)為花藥培養(yǎng)力的大小順序?yàn)樽ν鄣?秈粳雜種>粳稻>秈秈雜種>秈稻[4]。秈稻花藥培養(yǎng)力一般偏低,平均出愈率只有0.5%左右,一般不超過(guò)5%,有些材料甚至不能誘導(dǎo)出愈傷組織[5]。一般情況下，花藥培養(yǎng)力與接種材料密切相關(guān),品種基因型是水稻花藥誘導(dǎo)出愈率的重要影響因素[6-7]。黃翠紅等[8]通過(guò)對(duì)6個(gè)不同秈型恢復(fù)系水稻進(jìn)行花藥培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),在同一基本培養(yǎng)基上由于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比水平不同,愈傷誘導(dǎo)率也會(huì)有所不同,盡管花藥培養(yǎng)力的高低更多取決于水稻品種的基因型,但通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基中的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比也能在一定程度上促進(jìn)其花藥培養(yǎng)力的提高。此外,張志雄等[9]研究表明,在培養(yǎng)基中添加馬鈴薯、提取液、椰子汁、玉米汁等天然活性物質(zhì)及水解酪蛋白、酵母汁、脯氨酸等多種有機(jī)添加物,對(duì)提高秈稻花藥培養(yǎng)力均有明顯效果。因此，對(duì)不同基因型秈稻材料進(jìn)行花藥培養(yǎng)技術(shù)體系優(yōu)化具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。為此,在以往研究的基礎(chǔ)上,以4個(gè)秈稻恢復(fù)系鹽恢559、鹽恢269、鹽恢888、鹽恢1120 為試驗(yàn)材料,以MS、N6、M8為基本培養(yǎng)基,研究了添加不同質(zhì)量濃度的山梨醇及活性炭對(duì)秈稻恢復(fù)系花藥愈傷組織誘導(dǎo)、分化的影響,以優(yōu)化秈稻恢復(fù)系花藥培養(yǎng)條件,建立高效的花藥培養(yǎng)技術(shù)體系。

1 材料和方法

1.1 供試水稻材料

鹽恢559、鹽恢269、鹽恢888、鹽恢1120均來(lái)自江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)學(xué)研究所水稻室。材料種植于江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所南洋試驗(yàn)場(chǎng),2014年5月5號(hào)播種,6月5號(hào)移栽,株行距為30 cm×13.33 cm,田間管理按常規(guī)方法。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基 本研究以MS培養(yǎng)基為對(duì)照培養(yǎng)基,比較M8和N6兩種培養(yǎng)基在相同條件下對(duì)秈稻恢復(fù)系花藥出愈率的影響。其中,M8培養(yǎng)基配方參照閻麗娜等[10]的方法,N6培養(yǎng)基配方參照朱至清等[11]的方法,均附加30 g/L蔗糖、8 g/L瓊脂粉、2 mg/L 2,4-D、0.5 mg/L水解酪蛋白和0.1 mg/L肌醇。

1.2.2 分化培養(yǎng)基 分化培養(yǎng)基采用M8培養(yǎng)基,其中添加30 g/L蔗糖、瓊脂粉10 g/L、2 mg/L 6-BA、1 mg/L KT、2 mg/L NAA。并在此基礎(chǔ)上,分別添加不同質(zhì)量濃度的山梨醇(0、10、20、30 g/L)、活性炭(0、1、2、4 g/L),以研究?jī)烧邔?duì)綠苗分化率的影響。

1.3 水稻花藥培養(yǎng)

選取花粉分化正處在單核靠邊期的秈稻穗子,4 ℃預(yù)處理7 d,然后經(jīng)75%乙醇處理90 s,用0.1%氯化汞溶液浸泡5 min,再用無(wú)菌水漂洗4～5次,然后將穗子穎殼剪開,將花粉接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上面。每瓶接種100枚左右,每個(gè)材料3瓶,重復(fù)3次,放入暗培養(yǎng)室于(26±2)℃條件下培養(yǎng),接種30 d后記錄出愈率,分化40 d后統(tǒng)計(jì)綠苗數(shù)目,計(jì)算綠苗分化率。出愈率=愈傷組織數(shù)/接種花藥數(shù)×100%[12]；綠苗分化率=分化綠苗數(shù)/愈傷組織數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)秈稻恢復(fù)系花藥出愈率的影響

由表1可知,4個(gè)秈稻恢復(fù)系在3種培養(yǎng)基上的出愈率差異顯著,在M8培養(yǎng)基中均具有最高的出愈率,介于20.97%～30.63%,極顯著高于對(duì)照；而在N6培養(yǎng)基上,出愈率介于10.77%～13.70%,僅鹽恢559和鹽恢888顯著高于對(duì)照。對(duì)比M8和N6培養(yǎng)基,M8培養(yǎng)基更適合誘導(dǎo)秈稻恢復(fù)系花藥產(chǎn)生愈傷組織,故后期分化率試驗(yàn)均采用M8培養(yǎng)基。另外,不同品種在 M8培養(yǎng)基上的出愈率差異很大,鹽恢559和鹽恢888出愈率相近,均較高；鹽恢269和鹽恢1120出愈率相近,均較低,表明秈稻花藥培養(yǎng)受品種的基因型影響很大。

表1 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)秈稻恢復(fù)系花藥出愈率的影響 %

注:*、**分別表示與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01),下同。

2.2 不同質(zhì)量濃度山梨醇對(duì)秈稻恢復(fù)系花藥培養(yǎng)綠苗分化率的影響

以M8為分化培養(yǎng)基,將前期產(chǎn)生的愈傷組織進(jìn)行分化培養(yǎng)。由表2可知,總體上隨著山梨醇質(zhì)量濃度升高,M8分化培養(yǎng)基上秈稻恢復(fù)系花藥培養(yǎng)綠苗分化率增加,以30 g/L山梨醇處理最高,介于30.57%～36.77%,其次為20 g/L山梨醇處理,兩者均極顯著高于不添加山梨醇處理；而10 g/L處理只有鹽恢559和鹽恢888的綠苗分化率顯著高于不添加山梨醇處理,其余2個(gè)材料與不添加山梨醇處理差異不顯著。這表明一定質(zhì)量濃度的山梨醇作為培養(yǎng)基的碳源能夠有效調(diào)節(jié)和維持愈傷組織細(xì)胞內(nèi)的滲透壓,從而促進(jìn)愈傷組織分化。

表2 不同質(zhì)量濃度山梨醇對(duì)秈稻恢復(fù)系花藥培養(yǎng)綠苗分化率的影響 %

2.3 不同質(zhì)量濃度的活性炭對(duì)秈稻恢復(fù)系花藥培養(yǎng)綠苗分化率的影響

以M8為分化培養(yǎng)基,將前期產(chǎn)生的愈傷組織進(jìn)行分化培養(yǎng)。由表3可知,隨著活性炭質(zhì)量濃度升高,M8分化培養(yǎng)基上秈稻恢復(fù)系花藥培養(yǎng)綠苗分化率先增加后降低,總體均以1 g/L處理最高,介于21.38%～27.82%,2 g/L處理次之,兩者均極顯著高于不添加活性炭處理；而4 g/L處理只有鹽恢559和鹽恢888的綠苗分化率顯著高于不添加活性炭處理,其余2個(gè)材料與不添加活性炭處理差異不顯著,這可能是因?yàn)楦邼舛鹊幕钚蕴磕軌虼罅课脚囵B(yǎng)基中的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、維生素和鐵鹽等外植體生長(zhǎng)所必需的物質(zhì)而抑制分化,降低了分化率。

表3 不同質(zhì)量濃度活性炭對(duì)秈稻恢復(fù)系花藥培養(yǎng)綠苗分化率的影響 %

3 結(jié)論與討論

成功的花藥培養(yǎng)在一定程度上依賴于培養(yǎng)基的選擇,不同的培養(yǎng)基對(duì)不同基因型水稻材料有不同的培養(yǎng)效果,目前主要集中在M8、合5、SK3和N6等幾種培養(yǎng)基上[13]。本研究采用M8和N6兩種培養(yǎng)基對(duì)4個(gè)秈稻恢復(fù)系進(jìn)行花藥愈傷組織誘導(dǎo)研究發(fā)現(xiàn),M8培養(yǎng)基獲得了最高的出愈率,其中鹽恢559和鹽恢888相比其他2個(gè)恢復(fù)系獲得了更高的出愈率和分化率,這表明秈稻花藥培養(yǎng)依賴于水稻品種基因型。

培養(yǎng)基中的碳源主要是為培養(yǎng)物提供能量并維持細(xì)胞內(nèi)的滲透壓,不同種類和不同濃度的碳源都可以引起花藥培養(yǎng)的變化。孫宗修等[14]利用60 g/L麥芽糖代替蔗糖作為碳源,發(fā)現(xiàn)其對(duì)秈稻出愈率和分化率均有較好的效果。本研究發(fā)現(xiàn)，在添加30 g/L山梨醇的M8分化培養(yǎng)基中,4個(gè)秈稻恢復(fù)系都獲得了較高的分化率,極顯著高于不添加山梨醇處理。這可能是由于培養(yǎng)基中添加山梨醇后能夠有效維持細(xì)胞的生存與分化,其在愈傷組織細(xì)胞體內(nèi)氧化分解形成蔗糖或麥芽糖,維持和調(diào)節(jié)離體培養(yǎng)細(xì)胞的滲透壓,從而改善水稻花藥愈傷組織的分化效率[15]。此外,在獲得高的綠苗分化率的同時(shí),伴隨著愈傷組織的褐變,在培養(yǎng)基中添加活性炭能夠有效降低愈傷組織的褐化率,創(chuàng)造適宜培養(yǎng)物生長(zhǎng)的溫和環(huán)境,但是高濃度的活性炭反而會(huì)抑制組織分化效率[16],這與本研究結(jié)果相似。

[1] 李三和,陳志軍,劉凱,等.秈稻不育系花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)條件探討[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,54(19):4868-4870.

[2] 葛美芬,譚長(zhǎng)樂,白和盛,等.花藥培養(yǎng)在秈型野敗不育系提純復(fù)壯上的應(yīng)用[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),1985,1(1):25-32.

[3] 向發(fā)云,宋志紅,劉凱,等.花藥培養(yǎng)在秈稻恢復(fù)系提純與改良中的應(yīng)用[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,46(1):15-17.

[4] 胡含.植物細(xì)胞工程與育種[M].北京:北京工業(yè)大學(xué)出版社,1990.

[5] 向發(fā)云,宋志紅,曾祥國(guó),等.外源脯氨酸及水分脅迫對(duì)秈稻花藥培養(yǎng)效率的影響[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,46(6):861-863.

[6] 李大林,張?jiān)平?付永明.水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)在新品種選育中的利用[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2001,17(2):50-52,59.

[7] 姚焱,盧永根,劉向東,等.粳稻臺(tái)中65花藥培養(yǎng)下的細(xì)胞學(xué)研究[J].中國(guó)水稻科學(xué),2004,18(2):113-118.

[8] 黃翠紅,彭圣法,楊瑰麗,等.水稻秈型恢復(fù)系花藥培養(yǎng)初步研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,41(3):13-16,22.

[9] 張志雄,向躍武,張安中,等.水稻綜合育種技術(shù)及在雜交稻育種中的應(yīng)用研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),1998,31(6):76-78.

[10] 閻麗娜,李霞,吳丹.不同類型水稻材料成熟胚組織培養(yǎng)力的比較[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,43(6):1127-1135.

[11] 朱至清,王敬駒,孫敬三,等.通過(guò)氮源比較試驗(yàn)建立一種較好的水稻花藥培養(yǎng)基[J].中國(guó)科學(xué),1975,5(5):484-490.

[12] 苗立新,李鑫,李珣,等.1個(gè)秈粳雜交F1花藥培養(yǎng)及其影響因素研究[J].北方水稻,2013,43(2):14-18.

[13] 季彪俊,陳啟鋒,黃群策,等.水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)的總結(jié)與探討[J].福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,30(1):22-28.

[14] 孫宗修,斯華敏,程式華,等.麥芽糖提高水稻花藥培養(yǎng)效率的研究[J].中國(guó)水稻科學(xué),1993,7(4):227-231.

[15] 黃慧君,黃道強(qiáng).山梨醇對(duì)水稻體細(xì)胞培養(yǎng)的特殊作用[J].中國(guó)水稻科學(xué),1999,13(4):248-250.

[16] 丁元豐,季彪俊.活性炭在不同水稻組合花藥培養(yǎng)中的作用[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2006,18(2):37-40.

Study on Improvement of Differentiation Rate of Green Plantlets in Anther Culture ofIndicaRestorer Lines

LIU Kai,TANG Hongsheng,YAN Guohong*,SUN Mingfa

(Coastal Areas of Jiangsu Institute of Agricultural Sciences,Yancheng 224002,China)

As MS medium was control,the effects of M8and N6mediums on anther callus induction rate ofindicarestorer lines were studied,as well as the differentiation rate ofindicarestorer lines were studied with different concentrations of sorbitol and activated carbon added in medium.The results showed that fourindicarestorer lines in M8medium had the highest rate of callus,ranging from 20.97% to 30.63%,significantly higher than that in MS medium;while in the N6medium,the rate of callus was 10.77%—13.70%,only Yanhui 559 and Yanhui 888 were significantly higher than that in MS medium.With the increase of concentration of sorbitol,the green plantlets differentiation rate of fourindicarestorer lines in the M8differentiation medium increased,reached the highest value with 30 g/L sorbitol,ranging from 30.57% to 36.77%,followed by 20 g/L sorbitol,both significantly higher than the treatment without sorbitol.With the increase of concentration of activated carbon,the green plantlets differentiation rate of fourindicarestorer lines in M8differentiation medium increased first and then decreased,reached the highest value with 1 g/L,ranging from 21.38% to 27.82%,followed by 2 g/L,both significantly higher than the treatment without activated carbon.

indica; restorer lines； anther； tissue culture

2016-04-20

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK20161308)；鹽城市農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新專項(xiàng)引導(dǎo)資金項(xiàng)目(YK2015016)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015BAD01B01)

劉 凱(1984-)，男，河南南陽(yáng)人，助理研究員，碩士，主要從事水稻分子育種工作。E-mail：liukai11121@163.com

*通訊作者：嚴(yán)國(guó)紅(1968-)，男，江蘇鹽城人，研究員，主要從事水稻育種與栽培工作。E-mail：guohongyc@163.com

S511.2+1

A

1004-3268(2016)10-0032-03