ω-3多不飽和脂肪酸單藥或聯(lián)合用藥逆轉(zhuǎn)多發(fā)性骨髓瘤耐藥性及細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

石微房德芳趙永剛

·基礎(chǔ)研究·

ω-3多不飽和脂肪酸單藥或聯(lián)合用藥逆轉(zhuǎn)多發(fā)性骨髓瘤耐藥性及細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

石微①房德芳①趙永剛②

目的：探討ω-3多不飽和脂肪酸（ω-3 polyunsaturated fatty acids，ω-3 PUFA）單藥或聯(lián)合糖皮質(zhì)激素地塞米松（dexamethasone，DEX）逆轉(zhuǎn)多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）耐藥性及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制。方法：采用不同濃度的兩種ω-3 PUFA，二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）單藥處理，或與DEX聯(lián)合處理DEX耐藥細(xì)胞系MM1R在24 h或48 h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的細(xì)胞凋亡，Western blot檢測(cè)相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)水平。分析方法采用兩樣本間t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：不同濃度EPA或DHA（10、20、50、100 μM），及50 μM EPA或DHA與10 μM DEX聯(lián)合處理均能夠抑制MM1R細(xì)胞的增殖，且呈劑量和時(shí)間依賴性，聯(lián)合組抑制效果較EPA（50 μM）或DHA（50 μM）單藥組更明顯（P=0.014，0.032）。不同濃度EPA或DHA作用MM1R細(xì)胞48 h后，隨著藥物濃度增加，G0/G1期細(xì)胞逐漸增加，S期和G2期細(xì)胞逐漸減少，細(xì)胞凋亡率逐漸升高，細(xì)胞阻滯在G0/G1期；而兩藥聯(lián)合組與EPA（50 μM）或DHA（50 μM）單藥處理組相比，細(xì)胞阻滯和細(xì)胞凋亡率更加明顯（P=0.015，0.004）；凋亡相關(guān)Cleaved caspase-3、Bax蛋白水平逐漸升高，Pro-caspase-3、BCL-2蛋白水平逐漸降低，且呈劑量依賴性。不同濃度EPA或DHA作用MM1R細(xì)胞，隨藥物濃度增加，耐藥倍數(shù)逐漸下降，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)逐漸上升，而兩藥聯(lián)合組較單藥組細(xì)胞耐藥倍數(shù)下降及逆轉(zhuǎn)倍數(shù)上升更明顯。結(jié)論：ω-3 PUFA能夠抑制DEX耐藥MM細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與DEX聯(lián)合應(yīng)用對(duì)抑制MM細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡具有協(xié)同作用，是一種新型且有效的逆轉(zhuǎn)MM耐藥的治療藥物。

ω-3多不飽和脂肪酸多發(fā)性骨髓瘤地塞米松耐藥

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種起源于漿細(xì)胞的惡性腫瘤。近年來新型化療藥物的應(yīng)用使MM的治療取得長(zhǎng)足進(jìn)展，但是患者的預(yù)后仍較差。耐藥是MM難治、復(fù)發(fā)的原因之一［1］。MM細(xì)胞異質(zhì)性強(qiáng)，基因組高度不穩(wěn)定，生長(zhǎng)增殖高度依賴骨髓微環(huán)境，是耐藥細(xì)胞出現(xiàn)和存在的主要原因［1］。ω-3多不飽和脂肪酸（ω-3 polyunsaturated fatty acid，ω-3 PUFA）為人體必需脂肪酸，是細(xì)胞膜的組成成分，參與基因表達(dá)、生長(zhǎng)發(fā)育等多種生理活動(dòng)［2］。ω-3 PUFA包括二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）。研究表明ω-3 PUFA可通過影響某些基因轉(zhuǎn)錄，抑制細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用［3］。地塞米松（dexamethasone，DEX）作為糖皮質(zhì)激素的一種衍生物，被廣泛應(yīng)用于MM的臨床治療。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)ω-3 PUFA對(duì)MM的影響以及對(duì)糖皮質(zhì)激素耐藥改善情況的報(bào)道。本研究將EPA和DHA單藥或與地塞米松聯(lián)合作用于MM耐藥細(xì)胞系，觀察其對(duì)MM細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，為ω-3 PUFA用于治療MM提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

對(duì)DEX耐藥的人MM細(xì)胞株MM1R由本研究實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存，實(shí)驗(yàn)前從液氮取出，常規(guī)快速?gòu)?fù)蘇后傳代培養(yǎng)。RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清（均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司）；EPA、DHA和DEX（均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司）；MTT試劑盒（購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所）；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、流式凋亡檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自南京凱基公司）；Cleaved caspase-3抗體、Pro-caspase-3抗體、BCL-2抗體、Bax抗體、GAPDH抗體（均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司）；蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)MM1R細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5％CO2飽和濕度下培養(yǎng)，每2～3 d換液傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 藥物濃度設(shè)定根據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用二甲基亞砜配置濃度為10 mM的DEX儲(chǔ)備液，然后用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋至10 μM工作液。用無(wú)水乙醇配置濃度為100 mM的EPA和DHA儲(chǔ)備液，然后用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，EPA和DHA工作濃度梯度為：10、20、50、100 μM。聯(lián)合加藥組中先加入50 μM的EPA或DHA培養(yǎng)12 h，再加入10 μM DEX培養(yǎng)24 h進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MM1R細(xì)胞，以0.25％胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，200 μL/孔，每種濃度5個(gè)復(fù)孔，37℃、5％CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的藥物，分別處理24、48 h，吸去各孔培養(yǎng)液，換無(wú)血清培養(yǎng)液200 μL/孔，并加入20 μL/孔MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸盡各孔培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜（DMSO）200 μL/孔，振蕩器上振蕩溶解5～10 min，以空白對(duì)照調(diào)零，用自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀讀取各組吸光度（A）值，檢測(cè)波長(zhǎng)為492 nm。細(xì)胞增殖抑制率（％）=（A對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組）/（A對(duì)照組-A空白組）×100％。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值為最終結(jié)果。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡細(xì)胞處理方法同上；培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞，用4℃預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2次，1 000 r/min離心5 min。取l×105個(gè)細(xì)胞，加入4℃預(yù)冷的70％乙醇固定6 h。用4℃預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2次，1 000 r/min離心5 min。。將細(xì)胞重懸于100 μL PBS中，加入5 μL碘化丙錠（propidium iodide，PI），混勻后室溫避光反應(yīng)15 min，加入300 μL PBS，立即上流式細(xì)胞儀（BD FASC Calibur）檢測(cè)。另取1×105個(gè)細(xì)胞，用100 μL結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，加入5 μL AnnexinnV-FITC和5 μL PI，混勻后于室溫避光孵育15 min。加入400 μL結(jié)合緩沖液，立即上流式細(xì)胞儀分析。采用Modifit 1.0軟件分析細(xì)胞周期分布，采用CellQuest Pro軟件分析細(xì)胞凋亡，結(jié)果判斷：活細(xì)胞（Annexin-V-/PI-），早期凋亡細(xì)胞（Annexin-V+/PI-），晚期凋亡細(xì)胞（Annexin-V+/ PI+），細(xì)胞總凋亡=早期凋亡細(xì)胞+晚期凋亡細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值為最終結(jié)果。

1.2.5 測(cè)定EPA和DHA單藥或與地塞米松聯(lián)合作用對(duì)MM細(xì)胞耐藥及逆轉(zhuǎn)倍數(shù)的影響細(xì)胞處理方法同上；取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用胰酶消化后用培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以每孔6 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板上，每孔體積100 μL。細(xì)胞貼壁后，用細(xì)胞培養(yǎng)液配制不同濃度梯度的藥物培養(yǎng)細(xì)胞，對(duì)照孔細(xì)胞用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)。48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。以空白孔調(diào)零，全自動(dòng)酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定各孔吸光值（OD值），參比波長(zhǎng)為630 nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD）×100％。采用直線回歸方程計(jì)算出生長(zhǎng)抑制率50％時(shí)的藥物濃度即為半數(shù)抑制濃度（IC50）。耐藥倍數(shù)=耐藥細(xì)胞IC50/敏感細(xì)胞IC50；逆轉(zhuǎn)倍數(shù)（RF）=藥物IC50（不加逆轉(zhuǎn)劑）/藥物IC50（加逆轉(zhuǎn)劑）。

1.2.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平細(xì)胞處理方法同上；培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞，用蛋白裂解液裂解細(xì)胞后，離心去細(xì)胞碎片，取上清液，BCA法定量細(xì)胞總蛋白，各組取20 μg總蛋白進(jìn)行12％SDSPAGE，并轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用1％牛血清白蛋白（BSA）和0.05％Tween 20封閉非特異性抗原后，一抗4℃溫育過夜。次日TBST洗膜后，二抗1∶5 000稀釋，37℃溫育1 h，TBST洗膜后ECL熒光顯色。蛋白質(zhì)條帶用掃描儀進(jìn)行掃描，以GAPDH條帶作為參照，應(yīng)用Imagaquent 5.1軟件對(duì)蛋白質(zhì)條帶灰度進(jìn)行相對(duì)定量分析。以目的蛋白條帶與GAPDH灰度比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值為最終結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均采用±s表示，分析方法采用兩樣本間t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EPA和DHA單藥或與地塞米松聯(lián)合作用對(duì)MM細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，EPA和DHA單藥或與DEX聯(lián)合均對(duì)MM1R細(xì)胞的增殖有抑制作用；同一時(shí)間點(diǎn)不同濃度的EPA或DHA對(duì)MM1R的增殖抑制率，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；同一濃度不同時(shí)間EPA或DHA對(duì)MM1R的增殖抑制率，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；兩藥聯(lián)合組較單藥組對(duì)細(xì)胞抑制作用更強(qiáng)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)果見表1，2。

表1 EPA單藥或與地塞米松聯(lián)合作用對(duì)MM細(xì)胞增殖的影響（±s）Table 1Effects of EPA alone or in combination with dexamethasone on MM cell proliferation±s)

表1 EPA單藥或與地塞米松聯(lián)合作用對(duì)MM細(xì)胞增殖的影響（±s）Table 1Effects of EPA alone or in combination with dexamethasone on MM cell proliferation±s)

a.Compared with control group,P＜0.05;b.compared with 50 μM EPA group,P＜0.05;c.compared with 24 h,P＜0.05

Group Control group 10 μM EPA 20 μM EPA 50 μM EPA 100 μM EPA 50 μM EPA+10 μM DEX MM1R cell proliferation inhibition rate 24 h 0 8.45±0.57a15.24±1.27aa21.97±2.14a23.44±2.21a38.78±2.73ab48 h 0 12.07±0.94ac24.59±1.29ac35.47±2.41ac41.58±2.19ac68.24±2.02abc

表2 DHA單藥或與地塞米松聯(lián)合作用對(duì)MM細(xì)胞增殖的影響（±s）Table 2Effects of DHA alone or in combination with dexamethasone on MM cell proliferation(±s)

表2 DHA單藥或與地塞米松聯(lián)合作用對(duì)MM細(xì)胞增殖的影響（±s）Table 2Effects of DHA alone or in combination with dexamethasone on MM cell proliferation(±s)

a.Compared with control group,P＜0.05;b.compared with 50 μM EPA group,P＜0.05;c.compared with 24 h,P＜0.05

Group Control group 10 μM DHA 20 μM DHA 50 μM DHA 100 μM DHA 50 μM DHA+10 μM DEX MM cell proliferation inhibition rate 24 h 0 7.21±0.61a12.67±0.91aa24.37±1.24a29.74±1.35a43.54±2.68ab48 h 0 15.47±0.64ac26.49±0.96ac37.22±1.37ac50.64±3.49ac71.28±3.33abc

表3 EPA單藥或與地塞米松聯(lián)合作用對(duì)MM細(xì)胞周期的影響（±s）Table 3Effects of EPA alone or in combination with dexamethasone on the cell cycle of MM(±s)

表3 EPA單藥或與地塞米松聯(lián)合作用對(duì)MM細(xì)胞周期的影響（±s）Table 3Effects of EPA alone or in combination with dexamethasone on the cell cycle of MM(±s)

Total variance analysis,significant level α=0.05.Multiple comparison,adjusting the significance level by comparing the number of times K,α'=0.05/K. Comparisonbetweenthetwogroups,usingLSDmethodandHSDmethod.a.Comparedwiththeblankgroup,therewasstatisticaldifference;b.therewas statisticaldifferencebetweenarbitrarilytwogroups

Group Control group 10 μM EPA 20 μM EPA 50 μM EPA 100 μM EPA 50 μM EPA+ The effect of MM cell cycle G0/G1phase 35.22±1.34b48.14±1.09ab52.31±1.01ab64.26±0.78ab75.14±1.25ab83.13±1.22abS phase 16.24±0.84b11.62±0.94ab8.31±0.97ab5.88±0.69ab4.23±1.05ab3.15±1.16abG2phase 56.24±1.89b44.37±2.57ab35.16±1.84ab27.38±1.32ab20.32±1.23ab13.27±1.04abApoptosis rate(％) 7.94±1.85b27.35±2.06ab38.12±1.24ab49.36±1.53ab71.28±1.13ab81.93±1.51ab

2.2 EPA和DHA單藥或與地塞米松聯(lián)合作用對(duì)MM細(xì)胞周期的影響

不同濃度EPA或DHA作用MM1R細(xì)胞48 h后，隨著藥物濃度增加，G0/G1期細(xì)胞逐漸增加，S期和G2期細(xì)胞逐漸減少，細(xì)胞阻滯在G0/G1期。而兩藥聯(lián)合組較單藥組細(xì)胞阻滯更明顯（均P＜0.05）。結(jié)果見表3，4。

2.3 EPA和DHA單藥或與地塞米松聯(lián)合作用對(duì)MM細(xì)胞凋亡的影響

不同濃度EPA或DHA作用MM1R細(xì)胞48 h后，隨著藥物濃度增加，細(xì)胞凋亡率逐漸增加，而兩藥聯(lián)合組較單藥組細(xì)胞凋亡增加更明顯（均P＜0.05）。結(jié)果見表3，4。

2.4 EPA和DHA單藥或與地塞米松聯(lián)合作用對(duì)MM細(xì)胞耐藥及逆轉(zhuǎn)倍數(shù)的影響

不同濃度EPA或DHA作用MM1R細(xì)胞，隨藥物濃度增加，耐藥倍數(shù)逐漸下降，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)逐漸上升，而兩藥聯(lián)合組較單藥組細(xì)胞耐藥倍數(shù)下降及逆轉(zhuǎn)倍數(shù)上升更明顯。結(jié)果見表5，6。

表4 DHA單藥或與地塞米松聯(lián)合作用對(duì)MM細(xì)胞周期的影響（±s）Table 4Effects of DHA alone or in combination with dexamethasone on the cell cycle of MM(±s)

表4 DHA單藥或與地塞米松聯(lián)合作用對(duì)MM細(xì)胞周期的影響（±s）Table 4Effects of DHA alone or in combination with dexamethasone on the cell cycle of MM(±s)

Total variance analysis,significant level α=0.05.Multiple comparison,adjusting the significance level by comparing the number of times K,α'=0.05/K. Comparison between the two groups,using LSD method and HSD method.a.Compared with the blank group,there was statistical difference;b.there wasstatisticaldifferencebetweenarbitrarilytwogroups

Group Control group 10 μM EPA 20 μM EPA 50 μM EPA 100 μM EPA 50 μM EPA+ The effect of MM cell cycle G0/G1phase 36.52±1.56b46.23±1.74ab51.47±1.18ab62.85±0.84ab75.26±1.13ab80.23±1.54abS phase 7.58±1.24b11.62±0.94ab8.84±0.56ab6.82±0.47ab4.43±1.15ab3.27±1.62abG2phase 57.62±2.54b43.48±3.15ab34.26±1.42ab29.75±1.57ab21.08±0.87ab14.81±1.49abApoptosis rate(％) 6.78±1.53b28.74±2.13ab39.26±1.53ab47.53±1.08ab71.64±1.85ab82.33±1.16ab

表5 EPA單藥或與地塞米松聯(lián)合作用對(duì)MM細(xì)胞耐藥、逆轉(zhuǎn)及增敏倍數(shù)的影響（±s）Table 5Effects of EPA alone or in combination with dexamethasone on drug resistance，reversal，and enhancement of MM cells(±s)

表5 EPA單藥或與地塞米松聯(lián)合作用對(duì)MM細(xì)胞耐藥、逆轉(zhuǎn)及增敏倍數(shù)的影響（±s）Table 5Effects of EPA alone or in combination with dexamethasone on drug resistance，reversal，and enhancement of MM cells(±s)

a.Compared with the control group,there were significant differences;b.there were significant differences between the two groups in any group

Group Control group 10 μM EPA 20 μM EPA 50 μM EPA 100 μM EPA 50 μM EPA+10 μM DEX IC50 μmol/L 21.22±0.87b19.28±1.53ab15.67±1.65ab13.42±1.08ab9.47±1.14ab3.78±0.91abMultidrug resistance 4.86 3.57 2.76 2.19 1.45 0.49 Reversal index 0 1.15 1.79 2.58 3.76 4.89

表6 DHA單藥或與地塞米松聯(lián)合作用對(duì)MM細(xì)胞耐藥倍數(shù)及逆轉(zhuǎn)倍數(shù)的影響（±s）Table 6Effects of DHA alone or in combination with dexamethasone on drug resistance and enhancement of MM cells(±s)

表6 DHA單藥或與地塞米松聯(lián)合作用對(duì)MM細(xì)胞耐藥倍數(shù)及逆轉(zhuǎn)倍數(shù)的影響（±s）Table 6Effects of DHA alone or in combination with dexamethasone on drug resistance and enhancement of MM cells(±s)

Adjusting the significance level by comparing the number of times K,α'=0.05/K.Comparison between the two groups,using LSD method and HSD method.a.Compared with the blank group,there was statistical difference;b.there was statistical difference between arbitrarily two groups

Group Control group 10 μM DHA 20 μM DHA 50 μM DHA 100 μM DHA 50 μM DHA+10 μM DEX IC50μmol/L 22.38±1.85b18.76±1.63ab14.36±1.36ab12.42±1.57ab7.13±0.82ab4.57±0.81abMultidrug resistance 5.34 3.72 2.69 2.07 1.38 0.58 Reversal index 0 1.24 1.48 2.37 3.86 5.17

2.5 EPA和DHA單藥或與地塞米松聯(lián)合作用對(duì)MM細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

不同濃度EPA或DHA作用MM1R細(xì)胞24 h后，隨著藥物濃度增加，凋亡相關(guān)Cleaved caspase-3、Bax蛋白水平逐漸增加，Pro-caspase-3、BCL-2蛋白水平逐漸減少，且呈劑量依賴性。兩藥聯(lián)合組Cleaved caspase-3、Bax蛋白水平上調(diào)更明顯，而Pro-caspase-3、BCL-2蛋白水平下調(diào)更明顯（均P＜0.05），結(jié)果見圖1～3。

1.Control group;2.20 μM EPA or DHA;3.50 μM EPA or DHA;4.50 μM EPA or DHA+10 μM DEX圖1Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平Figure 1Detection of the expression level of apoptosis-related proteins

圖2 EPA單藥或與地塞米松聯(lián)合作用對(duì)MM細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 2Effect of EPA alone or in combination with dexamethasone on the expression of apoptosis-related proteins in MM cells

圖3 DHA單藥或與地塞米松聯(lián)合作用對(duì)MM細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 3Effect of DHA alone or in combination with dexamethasone on the expression of apoptosis-related proteins in MM cells

3 討論

糖皮質(zhì)激素是治療MM的一線藥物，是聯(lián)合化療方案中不可缺少的藥物。在化療過程中，不同MM患者對(duì)激素的反應(yīng)差異較大，部分MM患者即使加大激素劑量仍表現(xiàn)為反應(yīng)差甚至無(wú)反應(yīng)，這種現(xiàn)象稱為糖皮質(zhì)激素抵抗（glucocorticoid resistance，GCR）［4］。GCR導(dǎo)致化療無(wú)效或出現(xiàn)藥物嚴(yán)重不良反應(yīng)，這是MM治療的難點(diǎn)。因此，如果能夠減少化療藥物的用量而降低化療藥物的不良反應(yīng)顯得尤為重要。ω-3 PUFA與腫瘤的關(guān)系為：1）進(jìn)展期腫瘤患者血ω-3 PUFA濃度降低；2）抗腫瘤治療期間補(bǔ)充ω-3 PUFA可以提高治療反應(yīng)并改善患者生存質(zhì)量；3）ω-3 PUFA在提高抗腫瘤治療的療效及減輕化療不良反應(yīng)等方面起到重要作用［5-6］。如果EPA或DHA對(duì)MM細(xì)胞有抑制和殺傷作用，或有改善MM細(xì)胞GCR的作用，這在MM的治療領(lǐng)域?qū)⒕哂蟹浅ＵT人的前景。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EPA和DHA單藥對(duì)DEX耐藥的MM細(xì)胞株MM1R的生長(zhǎng)均有顯著的抑制作用，隨著劑量的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制效果越發(fā)顯著，呈濃度梯度和時(shí)間梯度依賴性，表明ω-3 PUFA對(duì)耐藥的MM細(xì)胞增殖起作用。同時(shí)聯(lián)合ω-3 PUFA與DEX來觀察兩者的協(xié)同作用，顯示采用50 μM ω-3 PUFA與10 μM DEX聯(lián)合產(chǎn)生的細(xì)胞增殖抑制效果均較EPA和DHA單藥產(chǎn)生的抑制效果強(qiáng)，且聯(lián)合組的抑制效果也呈時(shí)間梯度依賴性。不同濃度EPA或DHA作用MM1R細(xì)胞，隨藥物濃度增加，耐藥倍數(shù)逐漸下降，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)逐漸上升，而兩藥聯(lián)合組較單藥組細(xì)胞耐藥倍數(shù)下降及逆轉(zhuǎn)倍數(shù)上升更明顯。充分表明ω-3 PUFA與DEX聯(lián)合具有協(xié)同作用，能夠發(fā)揮更大的腫瘤殺傷效果，微摩爾濃度的ω-3 PUFA能對(duì)耐藥MM細(xì)胞產(chǎn)生明顯的抑制作用，表明ω-3 PUFA是高效、低劑量毒性的抗MM藥物，并且能夠改善MM細(xì)胞的GCR作用。ω-3 PUFA的增強(qiáng)化療敏感性在臨床實(shí)體腫瘤中也獲得研究和證實(shí)。Serini等［7］研究發(fā)現(xiàn)ω-3 PUFA通過調(diào)控基因表達(dá)遺傳和M2巨噬細(xì)胞極性化改善大腸炎性反應(yīng)和腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在動(dòng)物水平上，Chen等［8］研究發(fā)現(xiàn)，飲食內(nèi)源性的ω-3 PUFA，無(wú)論是在體外還是體內(nèi)，均有預(yù)防乳腺癌發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。Abdi等［9］研究結(jié)果表明EPA和DHA能誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡，增加硼替佐米對(duì)MM細(xì)胞的敏感性，而正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞的活性不受影響。Fahrmann等［10］對(duì)B細(xì)胞性慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系EHEB和MEC-2、B細(xì)胞性幼淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系JVM-2進(jìn)行體外培養(yǎng)，判斷在有無(wú)PUFA的情況下對(duì)化療藥物阿霉素、長(zhǎng)春新堿或氟達(dá)拉濱的敏感性，結(jié)果提示EPA和DHA能通過G2/M阻滯、脂質(zhì)過氧化作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增加上述化療藥物的敏感性，ω-3 PUFA可能是慢性淋巴細(xì)胞白血病有效的化療增敏劑。因此，上述研究和本研究結(jié)果均證實(shí)ω-3 PUFA具有改善激素耐藥、增加化療敏感性的作用，具有良好的臨床應(yīng)用前景。ω-3 PUFA可能通過以下幾個(gè)方面發(fā)揮其抗腫瘤作用：1）ω-3 PUFA可以摻入膜磷脂層影響膜相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)?？赡荜P(guān)聯(lián)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有Ras、PI3K/Akt、HER-2/neu途徑等；2）脂質(zhì)過氧化作用：ω-3 PUFA的脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物可抑制腫瘤細(xì)胞DNA合成、細(xì)胞分裂及生長(zhǎng)，誘導(dǎo)凋亡；3）抑制NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：NF-κB是重要的核轉(zhuǎn)錄因子，激活后可調(diào)控多種基因表達(dá)，參與炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答以及細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程；4）改變腫瘤細(xì)胞膜通透性，增加抗腫瘤藥物的攝入；5）作用于細(xì)胞凋亡相關(guān)因子，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。ω-3 PUFA影響腫瘤的機(jī)制非常復(fù)雜，是作用于多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮效果。本研究發(fā)現(xiàn)EPA和DHA單藥或與DEX聯(lián)合應(yīng)用能夠使MM1R細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，且隨著藥物劑量和作用時(shí)間的增加，阻滯效果逐漸明顯，呈劑量依賴性。表明ω-3 PUFA作用的敏感點(diǎn)在細(xì)胞周期的早期G0/G1期。藥物作用48 h后出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，且隨著藥物劑量的增加，凋亡率越來越高，并且ω-3 PUFA與DEX聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞凋亡增加更明顯，充分表明ω-3 PUFA具有細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡的雙重作用。有研究顯示EPA和DHA主要通過影響線粒體膜電位和激活caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且在細(xì)胞凋亡中起到不可替代的作用，是細(xì)胞凋亡過程中最主要的剪切酶［11］。另外，BCL-2和Bax是調(diào)控細(xì)胞凋亡非常重要的兩個(gè)基因，同屬BCL-2家族，BCL-2發(fā)揮抗凋亡作用，而Bax則促進(jìn)細(xì)胞凋亡，它們?cè)谡{(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞耐藥方面具有重要作用［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)ω-3 PUFA作用后，MM1R細(xì)胞的Cleaved caspase-3、Bax蛋白水平均逐漸上調(diào)，Pro-caspase-3、BCL-2蛋白逐漸下調(diào)，而且具有劑量依賴性，表明ω-3 PUFA可能是通過caspase途徑和調(diào)節(jié)BCL-2/Bax比率來誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡的。

綜上所述，ω-3 PUFA是一種新型且有效逆轉(zhuǎn)MM耐藥的治療藥物，為MM尤其是發(fā)生激素抵抗MM的治療提供新思路和新靶點(diǎn)，為提高M(jìn)M的治療效果、降低化療藥物的不良反應(yīng)、減少治療費(fèi)用、改善患者生存質(zhì)量開辟新的方法，具有重要的臨床意義。但是，目前該藥物對(duì)MM逆轉(zhuǎn)耐藥作用仍停留在初步研究階段，后續(xù)還需要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)進(jìn)一步研究和證實(shí)。

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（2016-07-25收稿）

（2016-10-18修回）

（編輯：孫喜佳 校對(duì)：周曉穎）

Role and mechanisms of ω-3 polyunsaturated fatty acids in inducing cell apoptosis and reversing drug resistance in multiple myeloma

Wei SHI1,Defang FANG1,Yonggang ZHAO2

Defang FANG;E-mail:782674212@qq.com
1Nursing Department,Lianyungang TCM Branch,Jiangsu Union Vocational Technical Institute,Lianyungang 222006,China;2Department of Pathology,the First People's Hospital of Lianyungang,Lianyungang 222006,China

Objective:To explore the role and mechanisms of ω-3 polyunsaturated fatty acids(ω-3PUFAs)alone or in combination with dexamethasone(DEX)in inducing cell apoptosis and reversing drug resistance in multiple myeloma(MM).Methods:DEX-resistant MM cell line MM1R was treated with different concentrations of eicosapentaenoic acid(EPA)or docosahexaenoic acid(DHA)alone or in combinationwithDEXfor 24or 48h.Cell proliferationwasdetectedbyMTTassay.Cell cycleandapoptosisweremeasuredbyflowcytometry. Expression levels of apoptosis-related proteins were analyzed by Western blot.Two-tailed,unpaired Student's t-test was used to compare the two treatment groups.A value of P＜0.05 was considered statistically significant.Results:MM1R proliferation was inhibited by different concentrations(10,20,50,and 100 μM)of EPA or DHA alone or in combination with 10 μM DEX in a dose-and time-dependent manner. The inhibition effect was significantly higher in combinative groups than in single EPA or DHA treatment group(P=0.014,P=0.032).The percentage of G0/G1phase and cell apoptosis rate in MM1R treated with different concentrations of EPA or DHA alone increased in a dosedependent manner.This percentage was also significantly higher in the combinative groups than in the single EPA or DHA treatment group (P=0.015,P=0.004).The expression levels of cleaved caspase-3 and Bax were upregulated,whereas those of pro-caspase-3 and BCL-2 were downregulated in a dose-dependent manner.Drug resistance gradually decreased in MM1R cells at different concentrations of EPA or DHA with the increase of drug concentration.The reversal fold also increased gradually,whereas the cells decreased in the two drug-combination groups compared with the single-drug group.Moreover,the drug-resistance reversal index increased significantly.Conclusion:ω-3PUFAs can inhibit DEX-resistant MM cell proliferation,arrest cell cycle,and induce cell apoptosis.ω-3PUFAs also exhibit a synergistic anti-resistanteffect in combination with DEX.Furthermore,ω-3PUFAs can serve as novel effective drugs for MM treatment.

:ω-3 polyunsaturated fatty acids,multiple myeloma,dexamethasone,drug resistance

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.24.879

①江蘇省聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院連云港中醫(yī)藥分院醫(yī)學(xué)護(hù)理系臨床醫(yī)學(xué)教研室（江蘇省連云港市222006）；②江蘇省連云港市第一人民醫(yī)院病理科

房德芳782674212@qq.com

石微專業(yè)方向?yàn)樯锘瘜W(xué)教學(xué)和分子生物學(xué)。

E-mail：846855639@qq.com