AOPAN納米纖維膜的制備及其固定化漆酶研究

武丁勝,鳳 權(quán),魏安方,李 鑫,姜銀國

(安徽工程大學(xué) 安徽省紡織面料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 蕪湖 241000)

AOPAN納米纖維膜的制備及其固定化漆酶研究

武丁勝,鳳 權(quán),魏安方,李 鑫,姜銀國

(安徽工程大學(xué) 安徽省紡織面料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 蕪湖 241000)

利用靜電紡絲和偕胺肟化改性制備偕胺肟聚丙烯腈(AOPAN)納米纖維膜,以戊二醛為偶聯(lián)劑,其兩端的醛基分別與AOPAN納米纖維膜和漆酶上的氨基反應(yīng),進(jìn)而固定化漆酶.研究了戊二醛交聯(lián)條件與固定化漆酶的關(guān)系,同時(shí)測定了固定化漆酶的相關(guān)性能,結(jié)果表明,當(dāng)戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、處理時(shí)間為10 h時(shí),固定漆酶效果最好.對游離漆酶與固定化漆酶進(jìn)行酶促動力學(xué)分析發(fā)現(xiàn),固定化漆酶與底物具有較好的親和性.相對游離漆酶,固定化漆酶對溫度和pH值的變化也表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性,同時(shí)具備良好的儲存穩(wěn)定性和重復(fù)使用能力.固定化漆酶在4 ℃下保存20 d,酶相對活性保持在63.6%以上,固定化漆酶經(jīng)重復(fù)使用10次,酶相對活性保持在65.7%以上.

偕胺肟化改性;偕胺肟聚丙烯腈(AOPAN)納米纖維;固定化漆酶;戊二醛交聯(lián)

漆酶(laccase)是一種多酚氧化酶,能夠催化許多酚類化合物發(fā)生氧化反應(yīng),并使分子氧作為電子受體將其還原成水,其催化底物主要有多酚、甲基替代單酚、芳香胺、苯硫醇、聚甲氧基苯,以及其他容易氧化的化合物等[1-3].因?yàn)槠崦妇哂邢喈?dāng)寬泛的底物專一性和較好的穩(wěn)定性,所以在廢水處理、生物漂白、芳香化合物轉(zhuǎn)化、生物傳感器構(gòu)建等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值[4-6].現(xiàn)在大多使用的漆酶主要產(chǎn)生于真菌,在酚類污染物的處理方面,真菌漆酶作為生物催化劑已經(jīng)顯示了良好的應(yīng)用前景[7-8].

當(dāng)前,用于固定漆酶的載體主要是納米顆粒和磁性微球等[9],將偕胺肟化改性的聚丙烯腈(PAN)納米纖維膜通過戊二醛交聯(lián)作為固定漆酶的載體則很少有人研究.本文首先利用靜電紡絲技術(shù)制備PAN納米纖維膜,通過偕胺肟化改性制備偕胺肟聚丙烯腈(AOPAN)納米纖維膜,然后與戊二醛一端醛基發(fā)生反應(yīng),制備納米纖維膜固定漆酶載體,最后利用納米纖維膜載體中的醛基與酶的氨基反應(yīng)固定漆酶.同時(shí),研究了戊二醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和處理時(shí)間對固定漆酶效果的影響,對比分析了固定化漆酶與游離漆酶的各種性能差異.

1 試 驗(yàn)

1.1 材料及儀器

PAN(粉末狀,相對分子質(zhì)量為90 000)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、鹽酸羥胺、乙酸(36%)、乙酸鈉、碳酸鈉、磷酸(85%)、乙醇(95%)、考馬斯亮藍(lán)(G-250),均為分析純,購于國藥試劑網(wǎng);戊二醛(GA、50%)、愈創(chuàng)木酚,購于阿拉丁試劑網(wǎng);漆酶(米曲霉菌種),購于安徽酷爾生物科技有限公司.

自制靜電紡絲裝置(主要包括注射器、注射泵、高壓直流電源、納米纖維接收裝置);S-4800型掃描電子顯微鏡(日本日立公司);IR Prestige-21型傅里葉紅外光譜儀(日本島津公司);UV-5500型紫外可見分光光度計(jì)(上海普析科學(xué)儀器有限公司).

1.2 AOPAN納米纖維膜的制備

將PAN粉末溶于DMF溶劑中,制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 12%的PAN靜電紡絲液. 將紡絲液倒入注射器(規(guī)格為10 mL)中,將磨平的針頭(規(guī)格為7 號)與注射器連接;環(huán)境溫度為(20±1) ℃,相對濕度為(60±5)%.根據(jù)紡絲效果,分別設(shè)定流速、接收距離、紡絲電壓等工藝參數(shù),靜電紡絲時(shí)間為10～15 h,將收集的納米纖維膜在40 ℃條件下的烘箱中烘干120 min,備用.將1 g PAN納米纖維膜放于濃度為0.2 mol/L、pH值為7、溫度為65 ℃的鹽酸羥胺溶液中浸泡2 h,再用蒸餾水清洗5次,在40 ℃條件下真空干燥2 h,制備AOPAN納米纖維膜.同時(shí)精確稱量反應(yīng)后納米纖維膜質(zhì)量,計(jì)算偕胺肟轉(zhuǎn)化率[10].PAN納米纖維偕胺肟化改性示意圖如圖1所示.

圖1 偕胺肟化反應(yīng)示意圖

Fig.1 Schematic of amidoxime reaction

1.3 AOPAN納米纖維膜固定漆酶

準(zhǔn)確稱量0.01 g AOPAN納米纖維膜(干重),放入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的戊二醛溶液中,在25 ℃、40 rad/min條件下慢速振蕩,進(jìn)行一定時(shí)間的反應(yīng),再用蒸餾水洗去多余戊二醛,將戊二醛改性后的納米纖維膜浸泡在50 mL、3 g/L漆酶溶液(以pH值為4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液配置)中,在4 ℃下固定12 h.將固定有漆酶的AOPAN納米纖維膜用醋酸-醋酸鈉緩沖液多次洗滌,直至洗滌液中檢測不到漆酶為止,將固定化漆酶于4 ℃條件下儲存于上述緩沖液中.AOPAN納米纖維膜固定漆酶原理如圖2所示.

圖2 AOPAN納米纖維膜固定漆酶示意圖Fig.2 Schematic of AOPAN nanofibrous membrane immobilized laccase

1.4 漆酶固定量和活性測定

采用Bradford方法測定AOPAN納米纖維膜對漆酶的固定量.通過測定固定化前后的酶溶液以及清洗固定化酶膜所用醋酸-醋酸鈉緩沖液中漆酶的含量,按式(1)計(jì)算漆酶的固定量(Ge).

(1)

式中:Ge為漆酶固定量(mg/g);C0為固定前酶溶液中漆酶含量(mg/mL);C1為固定后酶溶液中漆酶含量(mg/mL);C2為沖洗固定化酶膜醋酸-醋酸鈉緩沖液中漆酶的含量(mg/mL);V0為固定化試驗(yàn)所用酶溶液的體積(mL);V2為沖洗固定化酶膜所用醋酸-醋酸鈉緩沖液的體積(mL);m為用于固定化酶的AOPAN納米纖維膜的質(zhì)量(g,干重).

將0.3 mL自由漆酶溶液(3 g/L)及成功固定漆酶的納米纖維膜(準(zhǔn)確稱量0.01 g)分別放入8.7 mL、濃度為10 mmol/L的愈創(chuàng)木酚溶液,在50 ℃下反應(yīng)30 min,于波長465 nm處測試愈創(chuàng)木酚吸光度的變化.漆酶活性單位(U)定義為單位時(shí)間內(nèi)每毫克酶所催化的愈創(chuàng)木酚微摩爾數(shù).漆酶活性計(jì)算如式(2)所示.

(2)

式中:v為漆酶活性 (U);A0為初始愈創(chuàng)木酚溶液的吸光度;A為反應(yīng)一段時(shí)間后愈創(chuàng)木酚溶液的吸光度;V1為愈創(chuàng)木酚溶液的體積 (mL);t為反應(yīng)時(shí)間 (min);K為愈創(chuàng)木酚的摩爾消光系數(shù)(1.2×104L/(mol·cm) );mw為漆酶的質(zhì)量(mg).

1.5 游離漆酶與固定化漆酶性能測試

1.5.1 漆酶最適反應(yīng)溫度和pH值

為測定固定化漆酶的最適反應(yīng)溫度,將游離漆酶和固定化漆酶樣品放于pH值為4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液中,在溫度為30～70 ℃的條件下,測定漆酶活性.以最高活性為 100%,得出相對活性.

為測定固定化漆酶的最適反應(yīng)pH值,分別配置pH值為2～7的醋酸-醋酸鈉緩沖液各50 mL,將游離漆酶和固定化漆酶樣品分別放于上述不同pH值的緩沖液中,測試漆酶活性.以最高活性為 100%,得出相對活性.

1.5.2 漆酶的穩(wěn)定性

為測試漆酶的儲存穩(wěn)定性,將一批處于濕態(tài)的固定化漆酶膜和游離漆酶溶液放置于4 ℃下保存,每隔一段時(shí)間取出一份樣品測定其活性.通過考察漆酶相對活性的變化,研究漆酶的儲存穩(wěn)定性.

為測定固定化漆酶的重復(fù)使用性能,將固定化漆酶膜放入10 mmol/L、pH值為4.5的愈創(chuàng)木酚反應(yīng)液中,在50 ℃下反應(yīng)30 min,取出納米纖維膜用醋酸-醋酸鈉緩沖液清洗,然后再加入到新的相同愈創(chuàng)木酚反應(yīng)液中,在相同條件下重復(fù)反應(yīng),以首次使用時(shí)酶活性為100%,測定每次重復(fù)使用后酶相對活性.

1.6 形態(tài)及結(jié)構(gòu)表征

(1) 納米纖維膜形態(tài)觀察.在真空狀態(tài)下,對待測的納米纖維膜表面進(jìn)行噴金處理,采用掃描電子顯微鏡觀察纖維的表面形態(tài).

(2) 納米纖維膜紅外光譜分析.采用溴化鉀壓片制樣法對 PAN 納米纖維膜、AOPAN納米纖維膜進(jìn)行紅外光譜分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 AOPAN納米纖維膜表征

2.1.1 納米纖維膜形貌分析

通過掃描電子顯微鏡觀察PAN納米纖維膜在偕胺肟化改性前后表面形態(tài)變化,其結(jié)果如圖3所示.由圖3(a)可知,靜電紡絲制備的PAN 納米纖維膜是由隨機(jī)排列的納米纖維組成,纖維成型良好,直徑較為均一;由圖3(b)可知,偕胺肟化改性制備的AOPAN納米纖維(轉(zhuǎn)化率為32.8%)依然保持良好的形態(tài),纖維直徑均勻,且結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生明顯的變化,但其表面變得有些粗糙.

(a) PAN

2.1.2 納米纖維膜紅外光譜分析

圖4 PAN和AOPAN納米纖維膜紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectroscopy of the PAN and AOPAN nanofibrous membrane

2.2 交聯(lián)條件對固定漆酶的影響

2.2.1 戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)對固定漆酶的影響

準(zhǔn)確稱取7組0.01 g AOPAN納米纖維膜放于樣品瓶中,加入20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～7%的戊二醛溶液,在25 ℃、40 rad/min條件下慢速振蕩10 h,取出納米纖維膜用蒸餾水洗去多余戊二醛,分別放入50 mL、3 g/L的漆酶溶液中,在4 ℃下固定12 h.然后分別測試不同條件下的漆酶固定量及酶活性,以游離漆酶活性為100%,用固定化酶相對活性表示漆酶活性,每組試驗(yàn)測試3次,求平均值,結(jié)果如圖5所示.由圖5可以看出,隨著戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,漆酶的固定量也在逐漸增加,固定化酶的活性大致保持不變;當(dāng)戊二醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到5%時(shí),漆酶固定量達(dá)到最大值(73.64 mg/g,干重),再繼續(xù)增加戊二醛,漆酶的固定量開始出現(xiàn)下降,固定化漆酶的活性也開始下降.

2.2.2 戊二醛反應(yīng)時(shí)間對固定漆酶的影響

圖5 戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)與酶固定量和酶相對活性關(guān)系Fig.5 Relationship between the mass fraction of glutaraldehyde and the amount of enzyme and relative activity of enzyme

準(zhǔn)確稱取7組0.01 g AOPAN納米纖維膜放于樣品瓶中,加入20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的戊二醛溶液,在25 ℃、40 rad/min條件下振蕩不同時(shí)間,然后用蒸餾水洗去多余戊二醛,之后與2.2.1節(jié)操作相同,結(jié)果如圖6所示.由圖6可以看出,隨著戊二醛處理時(shí)間的延長,酶固定量在逐漸增加,固定化酶的相對活性變化不大,當(dāng)處理時(shí)間為10 h時(shí),酶固定量達(dá)到最大,再延長處理時(shí)間,酶的固定量和酶的活性開始變小.因?yàn)锳OPAN納米纖維膜上的氨基與戊二醛一端的醛基反應(yīng)需要一定時(shí)間[11],反應(yīng)10 h時(shí)效果最好,如果再增加反應(yīng)時(shí)間會引發(fā)副反應(yīng),從而降低酶固定量和固定化酶活性.

圖6 處理時(shí)間與酶固定量和酶相對活性關(guān)系Fig.6 Relationship between treatment time and the relative activity of enzyme and amount of enzyme

2.3 AOPAN納米纖維膜固定化漆酶動力學(xué)分析

通過測定酶催化反應(yīng)中的米氏常數(shù)能夠很好地解釋酶促反應(yīng)現(xiàn)象.用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法可求解動力學(xué)參數(shù),即將米氏方程變?yōu)榈箶?shù)形式,如式(3)所示.

(3)

式中:v0為初始反應(yīng)速率;[S]為底物濃度;Km為米氏常數(shù),在固定化酶中,Km也體現(xiàn)了酶與固定化載體間的親和性;vmax為酶在底物過量時(shí)的最大反應(yīng)速率.

在醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH值為4.5)于50 ℃條件下測試動力學(xué)參數(shù),以愈創(chuàng)木酚為反應(yīng)底物,底物濃度在0.5～10 mmol/L之間變化,反應(yīng)30 min,分別測定游離漆酶與固定化漆酶的最大反應(yīng)速率,測試結(jié)果如表1所示.

表1 游離漆酶和固定化漆酶的動力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of free laccase and immobilized laccase

與游離漆酶相比,漆酶經(jīng)AOPAN納米纖維膜固定化后,其米氏常數(shù)Km值有所增加,表示漆酶與底物的親和性有所下降,但相對其他載體固定化漆酶而言,其仍體現(xiàn)出與載體良好的親和性[12].另外,漆酶的構(gòu)象雖然因?yàn)榻宦?lián)而受到約束,但其vmax值降低較小.

2.4 固定化漆酶的性能

2.4.1 最適反應(yīng)溫度和pH值

漆酶作為一種高效生物催化劑,其活性很容易受到環(huán)境中的酸堿度和溫度的影響,在不同溫度和pH值的條件下,分別對游離漆酶和固定化漆酶進(jìn)行酶活性測試,測試結(jié)果如圖7所示.由圖7(a)可知,游離漆酶的最適pH值為4.5,而固定化漆酶的最適pH值為4.0,而且固定化漆酶對于pH值的變化其性能更穩(wěn)定.這是因?yàn)锳OPAN納米纖維膜經(jīng)交聯(lián)法固定化漆酶使其構(gòu)像更加穩(wěn)定,當(dāng) pH 值在一定范圍內(nèi)變化時(shí),體現(xiàn)出比游離漆酶更穩(wěn)定的催化性能.由圖7(b)可知,固定化漆酶的最適溫度為55 ℃,較游離漆酶上升5 ℃,并且從整體上看,固定化漆酶對溫度變化表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性.這是因?yàn)橥ㄟ^交聯(lián)法固定化酶時(shí),酶大分子與戊二醛交聯(lián)的納米纖維形成多點(diǎn)連接,從而在一定程度上穩(wěn)定了漆酶的構(gòu)象,能防止酶因受熱而發(fā)生肽鏈折疊及伸展變形而影響酶的活性[13].

(a) pH值

(b) 溫度圖7 游離漆酶和固定化漆酶的相對活性與pH值和溫度關(guān)系Fig.7 Relationship between the relative activity of free laccase and immobilized laccase with pH value and temperature

2.4.2 固定化漆酶的穩(wěn)定性

本文主要從固定化漆酶的重復(fù)使用能力和儲存能力來研究固定化漆酶的穩(wěn)定性.當(dāng)固定化漆酶在pH值為4.5、溫度為50 ℃的條件下,前5次重復(fù)使用中,酶相對活性一直保持在85%以上;當(dāng)固定化漆酶在相同條件下重復(fù)使用10次時(shí),其相對活性保持在65.7%以上.由此表明,AOPAN納米纖維膜固定化漆酶具有良好的重復(fù)使用能力.游離漆酶和固定化漆酶的儲存穩(wěn)定性對比如圖8所示.

圖8 游離漆酶與固定化漆酶的儲存穩(wěn)定性對比Fig.8 Storage stability of free laccase and immobilized laccase

由圖8可知,游離漆酶在4 ℃下儲存20 d以后,其相對活性只有35.5%左右,然而在同樣條件下,固定化漆酶相對活性還保持在63.6%以上,說明固定化漆酶具有良好的儲存穩(wěn)定性.因?yàn)榻宦?lián)法固定化漆酶形成的碳氮雙鍵使漆酶的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定,漆酶的性能變得更穩(wěn)定[14].

3 結(jié) 語

本文以AOPAN納米纖維膜為載體通過戊二醛交聯(lián)固定漆酶,當(dāng)戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%,反應(yīng)時(shí)間為10 h時(shí),固定漆酶效果最好,漆酶的固定量達(dá)到73.64 mg/g,而且此時(shí)漆酶的相對活性也達(dá)到最大.

通過測試固定化漆酶與游離漆酶的性能發(fā)現(xiàn),隨著反應(yīng)溫度及pH值的變化,固定化漆酶體現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性.動力學(xué)分析結(jié)果也表明,AOPAN納米纖維膜載體與漆酶之間具有良好的生物親和性.試驗(yàn)結(jié)果同時(shí)表明,固定化漆酶經(jīng)10次重復(fù)使用,其相對活性能保持在65.7%以上,固定化漆酶在4 ℃條件下儲存20 d后,其相對活性還能保持在 63.6%以上,而游離漆酶在相同條件下只保留35.5%的活性.

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Study on Preparation of AOPAN Nanofibrous Membrane and Its Immobilized Laccase

WUDing-sheng,FENGQuan,WEIAn-fang,LIXin,JIANGYin-guo

(Anhui Provincial Key Laboratory of Textile Fabric,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

Amidoxime ployarcylonitrile(AOPAN) nanofibrous membrane was prepared by electrospinning and amidoxime modification. Glutaraldehyde was used as a coupling agent,as its both ends of the aldehyde groups reacted with amino groups of AOPAN nanofibrous membrane and laccase,respectively,in this way using for enzyme immobilization. The relationship between the condition of glutaraldehyde cross-linked and the immobilized laccase was studied,and the relative properties of the immobilized laccase were also determined. Results show that when the mass fraction of glutaraldehyde is 5%,the processing time is 10 h,the immobilized laccase has the best effect. The kinetics analysis of free laccase and immobilized laccase show that the immobilized enzyme and substrate affinity is excellent. Compared with free laccase,the immobilized laccase show a better stability for the change of temperature and pH value,it also has good storage stability and reusability. The immobilized laccase can be kept for 20 d at 4 ℃,and the relative activity of enzyme can be maintained more than 63.6%,and the relative activity of enzyme can be kept more than 65.7% after repeated use 10 times.

amidoxime modification;amidoxime polyarcylonitrile(AOPAN) nanofiber;immobilized laccase;glutaraldehyde crosslinking

1671-0444 (2016)05-0693-06

2016-03-02

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21377004)；安徽省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(1408085ME87)；安徽省高校自然科學(xué)研究資助項(xiàng)目(KJ2016SD04，KJ2015A022)；安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計(jì)劃資助項(xiàng)目

武丁勝(1989—)，男，安徽阜陽人，碩士研究生，研究方向?yàn)楣δ苄约徔椘返拈_發(fā).E-mail: wudingsheng282@126.com 鳳 權(quán)(聯(lián)系人)，男，副教授，E-mail: fengquan@ahpu.edu.cn

TQ 342

A