人巨細(xì)胞病毒感染與孕婦臍血ADAMTS13蛋白酶活性相關(guān)性研究

閆珺 徐亞輝 劉侃 武海英

450000鄭州，河南省人民醫(yī)院產(chǎn)科

人巨細(xì)胞病毒感染與孕婦臍血ADAMTS13蛋白酶活性相關(guān)性研究

閆珺 徐亞輝 劉侃 武海英

450000鄭州，河南省人民醫(yī)院產(chǎn)科

目的研究人類巨細(xì)胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）感染與晚孕婦女臍血血管性血友病因子裂解蛋白（ADAMTS13）活性的相關(guān)性。方法選擇2014年10月?2015年10月在河南省人民醫(yī)院產(chǎn)科住院分娩的470例健康晚孕孕婦，于分娩時(shí)采集臍血，PCR法檢測(cè)臍血HCMV DNA和mRNA水平，殘余膠原結(jié)合試驗(yàn)法檢測(cè)臍血中ADAMTS13的活性，ELISA法檢測(cè)臍血血友病因子（vWF）抗原水平。結(jié)果470例孕晚期孕婦中，臍血HCMV DNA陽性率7.65%（36／470），其中21例HCMV mRNA陽性，陽性率58.3%（21／36）；HCMV DNA陰性孕婦（正常對(duì)照組，n＝70）ADAMTS13活性為（82.4±12.3%），顯著高于宮內(nèi)感染組（60.4±16.7%，P＜0.001）；HCMV mRNA陽性病例ADAMTS13活性為（51.3±15.9%），顯著低于HCMV mRNA陰性病例（65.8±19.1%，P＜0.01）；正常對(duì)照組臍血vWF水平為（105.6±25.4）ng／ml，顯著低于宮內(nèi)感染組［（147.2±29.1）ng／ml；P＜0.05］；HCMV mRNA陽性病例臍血vWF水平為（161.3±23.3）ng／ml，顯著高于HCMV mRNA陰性病例［（130.5±26.4）ng／ml；P＝0.034］；宮內(nèi)感染組病例ADAMTS13活性水平與vWF抗原水平呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝－0.343，P＝0.014）。結(jié)論孕婦臍血ADAMTS13活性下降與HCMV宮內(nèi)感染密切相關(guān)。

人類巨細(xì)胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）屬皰疹病毒科，在人群中具有較高的感染率，而孕婦是HCMV感染的高發(fā)人群。孕婦感染HCMV后，可經(jīng)胎盤垂直傳播，進(jìn)而引起小兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)先天畸形以及智力發(fā)育障礙等嚴(yán)重后果［1］。目前認(rèn)為，血管內(nèi)皮細(xì)胞是HCMV的易感細(xì)胞［2］。HCMV感染血管內(nèi)皮細(xì)胞后，引起微血栓等血管病理改變，下調(diào)胎盤功能，導(dǎo)致流產(chǎn)、胎兒生長受限等子代異常后果［2］。然而病毒損傷內(nèi)皮細(xì)胞后啟動(dòng)微血栓的機(jī)制尚不明確。血管性血友病因子裂解蛋白（ADAMTS13）是一種的游離于血漿中的金屬蛋白酶，屬于ADAMTS超家族［3］，其生理學(xué)作用是裂解血漿中血友病因子超大多聚體（UL?vWF），預(yù)防微血管血栓形成［4］。有研究證實(shí)，胎盤的絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞中，ADAMTS13均有表達(dá)［5］。但是目前ADAMTS13活性與HCMV宮內(nèi)感染的相關(guān)性國內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以晚孕婦女為研究對(duì)象，研究HCMV感染晚孕婦女臍血中ADAMTS13活性的變化，探討HCMV感染與晚孕婦女臍血ADAMTS13活性的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象選擇2014年10月?2015年10月在河南省人民醫(yī)院產(chǎn)科住院的健康晚孕孕婦470例，年齡22?35歲，平均孕齡（37.6±2.3）周，無自然流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)等不良孕產(chǎn)史。本研究經(jīng)河南大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)通過，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。所有孕婦于分娩時(shí)立即采集臍血全血和血漿均于分裝后－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PCR法檢測(cè)臍血HCMVDNA按照基因組DNA提取試劑盒步驟（上海賽百盛基因技術(shù)公司）抽提臍血DNA。采用PCR法檢測(cè)臍血HCMV DNA水平。擴(kuò)增HCMV引物如下：上游引物：5′?AGACGGAAGAGAAATTCACTGG?3′，下游引物：5′?GCCATAATCTCATCAGGGGAG?3′。PCR反應(yīng)條件：94℃，3 min；94℃，30 s、55℃30 s、72℃1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃5 min。1.5%瓊脂糖電泳，凝膠成像儀觀察。另外隨機(jī)選取PCR陽性產(chǎn)物送上海生工公司測(cè)序，最后將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比較。RT?PCR法檢測(cè)臍血HCMV mRNA采用Rizol法提取臍血RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用RT?PCR法檢測(cè)臍血HCMV mRNA水平。HCMV擴(kuò)增引物如下：上游引物：5′?GTGATCCGACTGGGCGAAAA3′，下游引物：5′?GAGCGCGTCCACAAATCTTA?3′反應(yīng)條件：94℃，3 min；94℃，30 s、55℃30 s、72℃1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃5 min。1.5%瓊脂糖電泳，凝膠成像儀觀察。另外隨機(jī)選取PCR陽性產(chǎn)物送上海生工公司測(cè)序，最后將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比較。

1.3 臍血ADAMTS13活性檢測(cè)采用殘余膠原結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)臍血中ADAMTS13的活性。實(shí)驗(yàn)步驟如下：（1）首先用100 μl 3μg／mL的Ⅲ型膠原稀釋溶液室溫下包被96孔板1 h。用250 μl的PBS液洗3次后將每孔加入200 μl 2.5%的BSA溶液，室溫孵育15 min，PBS液洗3次后備用。（2）用vWF裂解酶活性assay buffer倍比（1∶320?2.5）稀釋血漿；每份樣品各取50 μl，然后加入5 μl 93 mM的BaCL2溶液，37℃孵育5 min，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線；待檢血樣用vWF活性裂解酶assay buffer稀釋成1∶20樣品。每份樣品中加入10 μl／mL的vWF溶液100 μl，37℃孵育過夜，加入10 μl Na2SO4終止反應(yīng)，然后離心，取上清液40 μl，加入160 μl的ELISA稀釋液于各樣品中，混勻，取100 μl于96孔板內(nèi)（用Ⅲ型膠原包被好），37℃孵育1 h。用250 μl的PBS液清洗96孔板三次。（3）每孔加入100 μl 1∶4000的稀釋后的HRP?RAH?vWF IgG多克隆抗體（丹麥Dakocytomation公司），37℃孵育1 h。用250 μl的PBS液清洗96孔板三次。加入100 μl的鄰苯二胺?H2O2底物溶液，室溫下孵育3?5 min，每孔加入10 μl Na2SO4終止反應(yīng)后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定492／630nm處吸光度。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本活性值。1.4臍血vWF水平檢測(cè)采用雙抗夾心ELISA法檢測(cè)臍血vWF抗原水平。（1）首先利用100 μl兔抗人vWF多克隆抗體（A0082，丹麥Dakocytomation公司）包被96孔高親和力酶標(biāo)板，每孔加入200 μl 3.5% BSA封閉，以1∶10?1∶320倍比稀釋混合血樣建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）將待測(cè)血樣進(jìn)行1∶40稀釋，加入100 μl至包被好的酶標(biāo)板中，37℃孵育2 h。用250 μl的PBS液清洗96孔板三次。每孔100 μl1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗人vWF多克隆抗體（P0226），37℃孵育1 h，用250 μl的PBS液清洗96孔板三次。（3）每孔加入100 μl鄰苯二胺?雙氧水顯色5?15 min，每孔加入100 μl Na2SO4終止反應(yīng)。采用酶標(biāo)儀測(cè)定492／630nm處吸光度。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本的vWF抗原水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析軟件為SPSS 19.0，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩個(gè)樣本間均數(shù)比較，采用方差分析法，對(duì)多個(gè)樣本均數(shù)間比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異以P＜0.05表示。

2 結(jié)果

2.1 臍血HCMV感染檢測(cè)結(jié)果本研究共收集孕晚期孕婦臍血470例。臍血HCMV DNA陽性率7.65%（36／470），臍血HCMV DNA陽性36例中，21例HCMV mRNA陽性，陽性率58.3%（21／36）；從上述對(duì)象中選取孕晚期正常對(duì)照組70例（臍血HCMV DNA陰性）、宮內(nèi)感染組36例（臍血HCMV DNA陽性）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)檢測(cè)。

2.2 臍血HCMV感染與ADAMTS13活性正相關(guān)

正常對(duì)照組ADAMTS13活性為（82.4±12.3）%，宮內(nèi)感染組ADAMTS13活性為（60.4±16.7）%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），結(jié)果見表1。將宮內(nèi)感染組內(nèi)HCMV mRNA陽性與HCMV mRNA陰性病例臍血進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示HCMV mRNA陽性病例ADAMTS13活性為（51.3± 15.9）%，HCMV mRNA陰性病例ADAMTS13活性為（65.8±19.1）%；兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果見表1。

2.3 臍血HCMV感染與臍血vWF水平正相關(guān)

正常對(duì)照組臍血vWF水平為（105.6±25.4）ng／ml，宮內(nèi)感染組臍血vWF水平為（147.2±29.1）ng／ml，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果見表1。HCMV mRNA陽性病例臍血vWF水平為（161.3 ±23.3）ng／ml，HCMV mRNA陰性病例臍血vWF水平為（130.5±26.4）ng／ml，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.034），結(jié)果見表1。

表1 各組臍血中ADAMTS13活性和vWF水平比較Tab.1 Comparison of ADAMTS13 activity and vWF level in umbilical cord blood

2.4 臍血ADAMTS13活性與vWF水平負(fù)相關(guān)

宮內(nèi)感染組病例ADAMTS13活性水平與vWF抗原水平呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝－0.343，P＝0.014）。而正常對(duì)照組ADAMTS13活性水平與vWF抗原水平無明顯相關(guān)性（r＝－0.018，P＝0.342）。

3 討論

HCMV是引起宮內(nèi)感染最常見的病原體之一。研究發(fā)現(xiàn)孕婦在妊娠早期的活動(dòng)性感染率約為4.2%［6］，然而早孕患者的HCMV感染率可高達(dá)36.5%［7］。HCMV宮內(nèi)感染對(duì)子代的影響與妊娠階段密切相關(guān)，例如：受精后2周內(nèi)，發(fā)生HCMV宮內(nèi)感染，卵裂球發(fā)育可能收到影響，從而導(dǎo)致流產(chǎn)。受精后3?8周，發(fā)生HCMV宮內(nèi)感染，可能嚴(yán)重影響的胚胎的正常發(fā)育，導(dǎo)致自然流產(chǎn)、死胎、先天畸形等［8］。目前，HCMV宮內(nèi)感染依然影響著我國出生質(zhì)量，而且臨床目前尚無有效防治手段。

目前，HCMV感染無相應(yīng)的臨床表現(xiàn)，但妊娠期婦女感染HCMV時(shí)，病毒可經(jīng)血液循環(huán)感染胎盤，進(jìn)行復(fù)制、包裝，進(jìn)而引起絨毛血管內(nèi)皮病胎盤絨毛膜炎等疾病；胎盤血液循環(huán)受到阻斷，引起胎兒缺氧、宮內(nèi)窒息，甚至死亡。研究已經(jīng)表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞是HCMV宮內(nèi)感染的主要靶細(xì)胞。HCMV在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、擴(kuò)增，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致胎盤絨毛血管微血栓形成，胚胎血供受阻而死亡［8］。

vWF是參與血栓形成與止血的主要糖蛋白之一，能夠啟動(dòng)血小板聚集和局部微血栓的形成。血管內(nèi)皮細(xì)胞受損后vWF大量分泌并釋放入血液循環(huán)，與血管內(nèi)皮下暴露的膠原結(jié)合并與血小板膜上的受體GpIb／IX結(jié)合，活化血小板，促使血小板血栓形成，發(fā)揮止血的作用［9］。vWF是一種大分子多聚體糖蛋白，并以多聚體的形式存在于外周循環(huán)中，分子量范圍在500 000?2 000 000以上。如果vWF表達(dá)過量，UL?vWF大量形成，導(dǎo)致血小板聚集，病理性微血栓生成。而ADAMTS13不僅可以降低vWF與血小板、內(nèi)皮下膠原等的粘附能力，也可以裂解血漿中的UL?vWF，預(yù)防病理性微血栓的形成［4］。正常生理狀況下，ADAMTS13可以識(shí)別并裂解vWF多聚體，釋放血小板，阻礙形成血小板血栓。如果ADAMTS13活性異常，可引起vWF多聚體異常聚集，進(jìn)而引起病理性微血栓。

本研究結(jié)果表明，與正常孕婦比較，HCMV宮內(nèi)感染時(shí)孕婦臍血ADAMTS13活性明顯降低，其原因可能與內(nèi)皮細(xì)胞受病毒感染有關(guān)。何文竹等［10］研究發(fā)現(xiàn)HCMV感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）48 h后，HUVEC細(xì)胞裂解液及細(xì)胞上清中的ADAMTS13蛋白表達(dá)水平均顯著下降，表明HCMV感染HUVEC后可以抑制細(xì)胞中ADAMTS13的表達(dá)，與本研究結(jié)論相符。此外，我們的研究結(jié)果表明，HCMV感染后臍血中vWF水平顯著升高，活動(dòng)性感染的孕婦其vWF水平比非活動(dòng)性感染的孕婦相比較更高。提示HCMV感染促進(jìn)了vWF水平的過渡表達(dá)。更重要的是，我們發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)感染組病例ADAMTS13活性水平與vWF抗原水平呈顯著負(fù)相關(guān)，表明ADAMTS13活性異常后，難以有效裂解血漿中UL?vWF，導(dǎo)致vWF抗原水平大量增加，從而增加了病理性微血栓的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明晚孕孕婦臍血ADAMTS13活性下降與HCMV宮內(nèi)感染密切相關(guān)，這可能是HCMV宮內(nèi)感染誘發(fā)病理性微血栓的重要因素之一。而HCMV感染抑制ADAMTS13活性的具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Correlation between cord blood ADAMTS13 activity and human cytomegalovirus infection in pregnant women

Yan Jun，Xu YAhui，Liu Kan，Wu Haiying

Department of Gynaecology and Obstetrics，Henan Provincial people’s Hospital，Zhengzhou，45000，China

ObjectiveTo explore the correlation between cord blood ADAMTS13 activity and human cytomegalovirus（HCMV）infection in pregnant women.Methods470 pregnant women in the Henan Provincial people’s Hospital between Oct.2014 and Oct.2015 were selected in this study.Cord blood was collected and HCMV DAN／RNA levels were detected by polymerase chain reaction，the activity of ADAMTS13 in cord blood was examined using Residual?collagen Binding Assay，the vWF levels in cord blood was examined by enzyme?linked immunosorbent assay.ResultsAmong 470 cases，36 were HCMV DNA positive（7.65%），and in which 21 cases were HCMV mRNA positive 58.3%（21／36）.The activity of ADAMTS13 in control group（HCMV DNA negative，n＝70）was（82.4±12.3）%，significantly higher than that of intrauterine infection group（60.4±16.7%，P＜0.01）；the levels of vWF in control group was（105.6±25.4）ng／ml，significantly lower than that of intrauterine infection group（147.2±29.1 ng／ml，P＜0.05）；The activity of ADAMTS13 was negatively correlated with vWF levels in pregnant women with intrauterine HCMV infection（r＝－0.343，P＝0.014）.Conclusions HCMV intrauterine infection was significantly associated with decreased activity of ADAMTS13 in cord blood in in the late pregnancy.

Human cytomegalovirus；ADAMTS13；Pregnant women；vWF

武海英，E?mail：ezsr1201＠163.com

10.3760／cma.j.issn.1003?9279.2016.06.000

人巨細(xì)胞病毒；ADAMTS13；孕婦；vWF抗原

2016?07?06）