北京市EV?D68型腸道病毒引起的急性呼吸道感染

李愛華 張鐵鋼 李茂中 龔成 羅明 李仁清 張和潤 黃芳

100013北京市疾病預(yù)防控制中心，北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心（李愛華、張鐵鋼、李茂中、龔成、羅明、李仁清、張和潤、黃芳）；100069北京，首都醫(yī)科大學(xué)（黃芳），

·短篇論著·

北京市EV?D68型腸道病毒引起的急性呼吸道感染

李愛華 張鐵鋼 李茂中 龔成 羅明 李仁清 張和潤 黃芳

100013北京市疾病預(yù)防控制中心，北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心（李愛華、張鐵鋼、李茂中、龔成、羅明、李仁清、張和潤、黃芳）；100069北京，首都醫(yī)科大學(xué)（黃芳），

目的了解北京地區(qū)呼吸道感染病例中EV?D68型腸道病毒感染情況，發(fā)現(xiàn)北京地區(qū)EV?D68型腸道病毒的流行規(guī)律，為呼吸道傳染病預(yù)防控制策略的制定提供依據(jù)。方法從監(jiān)測哨點醫(yī)院采集呼吸道感染病例的咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等標(biāo)本，利用實時熒光PCR方法，篩查腸道病毒，利用EV?D68型腸道病毒特異性引物對腸道病毒核酸檢測陽性標(biāo)本進(jìn)行RT?PCR擴(kuò)增和測序。測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST，分析腸道病毒血清型，并進(jìn)行進(jìn)化分析。結(jié)果從2015?2016年6月的10494例呼吸道感染病例病原學(xué)標(biāo)本中，檢測到330例腸道病毒核酸陽性標(biāo)本，其中兩例為EV?D68型特異性引物擴(kuò)增陽性，經(jīng)測序證實其為EV?D68血清型。對VP1區(qū)的序列進(jìn)化分析結(jié)果表明，兩株EV?D68腸道病毒均屬于3個已知的進(jìn)化分支中的亞系1。結(jié)論北京地區(qū)存在EV?D68型腸道病毒的流行，并可引起呼吸道感染，流行的EV?D68均屬于亞系1，與國際上主要流行的亞系一致。本研究結(jié)果為闡明EV?D68病毒的流行特點提供了數(shù)據(jù)參考。

Fund programs：National Science and Technology Major Project of China during the 13thFive?Year PlanPeriod（2016ZX10004206）；BeijingMunicipalScienceandTechnologyCommission（Z151100003915140）；Capital Medical Development and Scientific Research Fund（2016?2?3011）

腸道病毒D68（Enterovirus D68，EV?D68）屬于腸道病毒屬、小RNA病毒科D組，可引起呼吸道感染性疾病，在生物學(xué)特性上與鼻病毒非常相似［1］。近年來，包括EV?D68等新型腸道病毒不斷被發(fā)現(xiàn)和證實，其引起的疾病也呈現(xiàn)多樣化、癥狀日趨嚴(yán)重的趨勢［2］。EV?D68由原來僅僅引起散發(fā)，引起流鼻涕、咳嗽、呼吸不適等一般感冒癥狀，到2014年在美國近乎全國暴發(fā)流行，出現(xiàn)嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)癥狀，造成1153人感染、13人死亡［3］。從全球的流行趨勢來看，EV?D68在不同國家、不同地區(qū)，均引起越來越多的嬰兒、兒童和青少年呼吸道系統(tǒng)急性感染病例。除美國外，菲律賓、日本、荷蘭、泰國，近些年均出現(xiàn)EV?D68引起的急性呼吸道感染病例［4?7］。我國也有EV?D68散發(fā)感染報道［8，9］。EV?D68已引起全世界公共衛(wèi)生領(lǐng)域的高度關(guān)注。

2014年美國多個州暴發(fā)EV?D68引起的急性呼吸道感染疫情后［3］，我們對北京地區(qū)呼吸道感染病例標(biāo)本進(jìn)行EV?D68的實驗室篩查，在一例重癥肺炎病例標(biāo)本中檢測到EV?D68型腸道病毒［10］，證實北京地區(qū)存在EV?68的感染。為了明確EV?D68在北京地區(qū)的流行特點，我們后續(xù)開展了持續(xù)監(jiān)測，分析了2015年?2016年6月EV?D68的流行情況及其分子特征。

1 材料與方法

1.1 監(jiān)測對象北京市呼吸道多病原監(jiān)測系統(tǒng)包括30家哨點醫(yī)院，通過了倫理委員會審查并簽署知情同意書，監(jiān)測診室包括發(fā)熱門診、兒科門診、兒科病房、急診、呼吸內(nèi)科病房和ICU等。對出現(xiàn)發(fā)熱（腋下體溫≥38℃），伴咳嗽或咽痛、鼻塞、流涕、咳痰等呼吸道感染癥狀的病例，采集發(fā)病一周內(nèi)咽拭子、痰液及肺泡灌洗液標(biāo)本。標(biāo)本采集后在4℃條件下保存，24 h內(nèi)運送至區(qū)縣CDC實驗室，－70℃以下冰箱保存，其中痰液及肺泡灌洗液標(biāo)本用Sputasol（Oxid）預(yù)先處理后凍存。

1.2 標(biāo)本病毒核酸提取利用美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司ABI Mag MAX express 96自動核酸提取儀，采用美國Thermo Fisher公司磁珠法病毒總核酸提取試劑盒（貨號：KFR?805496），按照試劑盒說明書和儀器操作手冊，提取咽拭子和痰液標(biāo)本中病毒總核酸，用于腸道病毒檢測。

1.3 腸道病毒檢測用江蘇和創(chuàng)生物科技有限公司的腸道病毒核酸實時熒光PCR檢測試劑盒（貨號：CN09?4A），按照試劑盒說明書，進(jìn)行體系配制和反應(yīng)條件設(shè)置，利用ABI 7500實時熒光PCR儀器，對標(biāo)本中腸道病毒核酸進(jìn)行檢測。

1.4 EV?D68 RT?PCR檢測合成EV?D68特異性引物［11］。選用美國Invitrogen公司GoldScript一步法RT?PCR試劑盒（貨號：c81401180），按照試劑盒說明書，配制體系和設(shè)置反應(yīng)條件，擴(kuò)增EV?D68的VP1基因，然后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。測序結(jié)果在NCBI中，進(jìn)行核苷酸序列BLAST比對，根據(jù)序列比對同源性的高低獲得腸道病毒血清型。

1.5 其他呼吸道病毒檢測包括流感病毒（新甲型H1N1、甲型H3N2病毒和乙型流感病毒）、副流感病毒1?4型、腺病毒、人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、冠狀病毒（229E、HKU1、OC43和NL63）、鼻病毒和博卡病毒。

1.6 EV?D68VP1基因的進(jìn)化分析利用DNASTAR的MegAlign軟件，以ClustalW的方法，構(gòu)建EV?D68的VP1基因進(jìn)化樹，分析其進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 病例標(biāo)本檢測情況2015年1月至2016年6月份，共采集呼吸道多病原監(jiān)測哨點醫(yī)院10 494例呼吸道感染病例標(biāo)本，檢測到330例腸道病毒核酸陽性標(biāo)本，檢出率為3.1%；其中2例為EV?D68型特異性引物擴(kuò)增陽性，經(jīng)測序證實其為EV?D68血清型；1例為肺炎病例痰液標(biāo)本（2016R3061）、1例為上呼吸道感染病例咽拭子標(biāo)本（2016R3528），年齡分別為7歲、35歲（平均年齡21歲）。2016R3061（GenBank序列號：KX890306）及2016R3528（GenBank序列號：KX890305）陽性產(chǎn)物雙向測序，在NCBI的BLAST結(jié)果顯示，兩株病毒與2014年北京在呼吸道病毒標(biāo)本（GenBank序列號：KP240936.1）中分離的EV?D68型腸道病毒高度同源，VP1區(qū)序列同源性分別達(dá)98%、99%，與急性遲緩性麻痹標(biāo)本（GenBank序列號：KM892501.1）中分離的病毒同源性分別為95%、96%。兩個病例標(biāo)本其他呼吸道病毒核酸均檢測陰性，無混合感染。

本研究檢測EV?D68型腸道病毒（GenBank序列號分別為：KX890305、KX890306）；●參考株：2014年北京分離病毒（GenBank序列號：KP240936.1）和2013年急性遲緩性麻痹標(biāo)本分離病毒（GenBank序列號：KM892501.1）；?既往研究中2011年?2014年北京地區(qū)分離的13株EV?D68毒株。圖1 EV?D68型腸道病毒V P1序列進(jìn)化樹Strains detected in this study（GenBank ID：KX890305，KX890306）；●Reference strains：strains detected in Beijing and AFP cases（GenBank ID：KP240936.1，KM892501.1）.?13 EV?D68 strains identified in Beijing from 2011 to 2014 in a previous studyFig.1 Phylogenetic tree of EV?D68 strains VP1 nucleotide sequences

2.2 EV?D68病例臨床診斷和癥狀2016R3061病例為7歲男童，居于北京市海淀區(qū)，無其它基礎(chǔ)疾病，發(fā)病前未接觸發(fā)熱病人及活禽，2016年5月2日發(fā)病，5月4日收治北京市海淀醫(yī)院，診斷為肺炎，胸部影像學(xué)檢查結(jié)果為又下葉滲出／實變，臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、咳痰等，于12日治愈出院。2016R3528病例為35歲男性，居于北京市石景山區(qū)，無其它基礎(chǔ)疾病，發(fā)病前未接觸發(fā)熱病人及活禽，2016年6月21日發(fā)病，22日就診于北京朝陽醫(yī)院西區(qū)門診，診斷為急性上呼吸道感染，臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、咽痛、鼻塞、流涕等。

2.3 EV?D68的VP1基因進(jìn)化分析全球各處所有已知EV?D68的VP1基因序列進(jìn)化分析數(shù)據(jù)

表明，EV?D68可分為3個進(jìn)化分支：分別為亞系1、2、3［11］。將兩株EV?D68的VP1區(qū)序列與其他國家EV?D68的VP1區(qū)序列比對，結(jié)果如圖1所示，兩株腸道病毒及與之高度同源的KP240936.1和KM892501株，均屬于進(jìn)化分支中的亞系1。

3 討論

2014年EV?D68在美國多個州的暴發(fā)流行，并在全球其他多個國家不斷被檢出，表明EV?D68已成為一種引起呼吸道感染的重要病原體。來自世界不同地方（包括美國、芬蘭、法國、荷蘭、日本、非洲等）的EV?D68型腸道病毒VP1基因序列進(jìn)化分析結(jié)果顯示，EV?D68病毒被分成3個主要的亞系，分別為亞系1、2、3［12］，有研究中也將其分為A、B、C組［13］。在既往研究中，我們從北京地區(qū)2011至2015年呼吸道感染病例中檢測到13例EV?D68陽性標(biāo)本，進(jìn)化分析顯示，2011年至2013年的EV?D68標(biāo)本屬于亞系1和亞系3，而所有2014年的EV?D68均屬于亞系1，2011年和2014年同屬于亞系1的毒株與美國2014年暴發(fā)毒株高度同源［13］。

在本研究中篩查到2例由EV?D68型腸道病毒引起的呼吸道感染病例，說明2015年?2016年間，北京地區(qū)依然存在EV?D68病毒的流行。對VP1基因的進(jìn)化分析表明，其屬于進(jìn)化分支中的亞系1，與北京2014年分離的其他EV?D68毒株及美國2014年暴發(fā)毒株相似，提示2014年以后北京地區(qū)EV?D68感染病例以亞系1為主。

EV?D68腸道病毒可引起不同人群呼吸系統(tǒng)急性感染病例，以嬰兒、兒童和青少年為易感人群。2014年美國多地暴發(fā)的EV?D68感染疫情主要以嬰幼兒為主，菲律賓、泰國等地區(qū)由EV?D68引起的兒童呼吸道感染比例也明顯上升［4，7］。我們在既往研究中檢測的13例EV?D68感染病例，12例為15歲以下兒童病例，僅1例為成人感染［10，13］。此外，Xiang［9］等在2006?2010年北京協(xié)和醫(yī)院發(fā)熱門診患者呼吸到分泌物中檢測到13例EV?D68感染的成人病例。本研究在成人中也檢測到EV?D68病毒感染，但癥狀比兒童感染病例略輕。提示隨著EV? D68的不斷出現(xiàn)，也可能在成人中引發(fā)疾病并不斷傳播，需要引起一定關(guān)注。我們的呼吸道監(jiān)測系統(tǒng)能夠敏感、全面、快速的監(jiān)測到EV?D68病毒引起的感染病例，其傳播和治病機(jī)制需進(jìn)一步研究。

目前，EV?D68的感染呈散發(fā)，病例間未有流行病學(xué)關(guān)聯(lián)，未發(fā)現(xiàn)有聚集性病例。但當(dāng)前流行的亞系與全球流行的主要型別一致，提示仍要加強(qiáng)對北京市呼吸道感染病例EV?D68腸道病毒的監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)可能的聚集性病例，及早采取措施，避免出現(xiàn)大規(guī)模流行。進(jìn)一步了解和揭示各種型別腸道病毒在北京地區(qū)的流行趨勢，也有助于掌握腸道病毒的流行規(guī)律，為相關(guān)疫情的預(yù)警和防控提供數(shù)據(jù)支持。

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Acute respiratory tract infections associated with Enterovirus D68 in Beijing

Li Aihua，Zhang Tiegang，Li Maozhong，Gong Cheng，Luo Ming，Li Renqing，Zhang Herun，Huang Fang

Beijing Center for Disease Prevention and Control．Beijing Preventive Medicine Research Center，Beijing 100013，China（Li AH，Zhang TG，Li MZ，Gong C，Luo M，Li RQ，Zhang HR，Huang F）；Capital Medical University，Beijing 100069，China（Huang F）

Huang Fang，Email：hfxdd1775＠yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the respiratory infection associated with enterovirus D68 in Beijing，learn the epidemic regularity of enterovirus D68，and provide scientific basis for the work of respiratory illness prevention and control.MethodsWe collected the oropharyngeal swabs，sputum and alveolar lavage fluid from the respiratory illness cases in monitoring sentinel hospitals.The Enterovirus was detected by real?time RT?PCR.The gene fragments of enterovirus specimens were amplified by a pair of specific primers for enterovirus D68.The sequences were analyzed in NCBI by BLAST method to determine the serotype and genetic analysis.ResultsIn total of 10 494 specimens from respiratory illness cases，330 cases were positive for enterovirus.Of the 330 cases in whom enterovirus was confirmed，two cases were associated with enterovirus D68 by RT?PCR test.The sequences of PCR products further confirmed that the two viruses were enterovirus D68.Alignment of phylogenetic analysis of VP1 gene sequences showed that these viruses clustered and belonged to clade lineage 1.ConclusionsThe study confirmed that there were respiratory illness cases infected by enterovirus D68 in Beijing.The EV?D68 strains since 2014 all belonged to lineage 1，which was the dominant sublineage epidemic worldwide.

Acute Respiratory tract infections；Enterovirus D68；VP1 gene

黃芳，Email：hhffxdd＠126.com

10.3760／cma.j.issn.1003?9279.2016.06.000

急性呼吸道感染；腸道病毒D68型；VP1基因

國家“十三五”科技重大專項（2016ZX10004206）；北京市科學(xué)技術(shù)委員會（Z151100003915140）；首都醫(yī)學(xué)發(fā)展科研基金（2016?2?3011）

2016?10?24）