人用狂犬病疫苗中糖蛋白抗原檢測方法的建立及適用性研究

曹守春 張全福 王云鵬 劉洋 李阿茜 李川 孫麗娜 梁米芳

北京，100050中國食品藥品檢定研究院（曹守春、王云鵬）；北京102206，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所（張全福、劉洋、李川、李阿茜、孫麗娜、梁米芳）

·技術(shù)方法·

人用狂犬病疫苗中糖蛋白抗原檢測方法的建立及適用性研究

曹守春 張全福 王云鵬 劉洋 李阿茜 李川 孫麗娜 梁米芳

北京，100050中國食品藥品檢定研究院（曹守春、王云鵬）；北京102206，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所（張全福、劉洋、李川、李阿茜、孫麗娜、梁米芳）

曹守春、張全福同為第一作者

目的建立可快速檢測人用狂犬病疫苗中糖蛋白抗原含量的方法并進行適用性驗證。方法取2株抗狂犬病病毒糖蛋白的基因工程抗體，采用雙抗體夾心ELISA技術(shù)，方陣滴定法確定包被單抗和酶標(biāo)二抗的最佳工作濃度。對該方法進行特異性，靈敏度，重復(fù)性和適用性驗證。結(jié)果包被抗體的使用濃度為200 ng／孔，HRP酶標(biāo)二抗的最佳稀釋比例為1：2000。驗證結(jié)果顯示該方法具有良好的特異性和靈敏性，變異系數(shù)＜15%，對于不同疫苗生產(chǎn)毒株CTN株、aG株P(guān)M1503株和PV株均可有效檢測。結(jié)論成功建立了適用于人用狂犬病疫苗糖蛋白ELISA檢測方法，這對于人用狂犬病疫苗生產(chǎn)質(zhì)控及效價測定方法替代奠定基礎(chǔ)，具有重要意義。

狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的一種人畜共患病，一旦發(fā)病，幾乎100%死亡，人用狂犬病疫苗在狂犬病的預(yù)防控制中起著重要作用?？袢《咎堑鞍资侵饕Ｗo性抗原，可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體［1］。糖蛋白抗原含量高低基本上可以決定疫苗的效價的高低。因此在人用狂犬病疫苗的質(zhì)量控制研究中，糖蛋白含量的檢測對于疫苗生產(chǎn)和質(zhì)量評價具有較強的指導(dǎo)意義。本研究利用抗狂犬病病毒糖蛋白的兩株基因工程抗體建立了雙抗體夾心ELISA方法，可用于人用狂犬病疫苗中的糖蛋白含量的快速檢測，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料抗狂犬病病毒糖蛋白的基因工程抗體（編號：RVAB09和RVAB22）。96孔板購自Costar公司，酶聯(lián)免疫儀，HRP快速標(biāo)記試劑盒（購自北京雁棲灣生物技術(shù)有限公司），人用狂犬病疫苗國際標(biāo)準(zhǔn)品（6th，07／162，購自英國NIBSC），人用狂犬病疫苗（國內(nèi)不同生產(chǎn)企業(yè)疫苗產(chǎn)品各1批）、流感病毒裂解疫苗、出血熱疫苗、甲型肝炎滅活疫苗和乙型腦炎疫苗均為國內(nèi)疫苗生產(chǎn)公司贈送。其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 糖蛋白檢測雙抗體夾心ELISA方法的建立

1.2.1 微孔板包被：配置NaHCO3（pH9.0）包被液，將抗狂犬病病毒糖蛋白基因工程抗體RVAB09按一定濃度（50 ng／孔，100 ng／孔，50 ng／孔，200 ng／孔）加入，100 μl／孔，4℃過夜。

1.2.2 酶標(biāo)二抗的制備：取抗狂犬病病毒糖蛋白基因工程抗體RVAB22，按HRP快速標(biāo)記試劑盒說明書操作，最終獲得酶標(biāo)二抗溶液（1 mg／ml）。HRP標(biāo)二抗工作濃度設(shè)1∶100，1∶200，1∶400；1∶800；1∶1000，1∶2000和1∶4000系列梯度。采用方陣滴定法確定包被單抗和酶標(biāo)二抗的最佳工作濃度。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品曲線繪制：取人用狂犬病疫苗國際標(biāo)準(zhǔn)品，2倍稀釋，最高稀釋至2 048倍，2倍開始上板，100 μl／孔，37℃溫育1 h，洗板3次，加入酶標(biāo)二抗，37℃溫育0.5 h，洗板6次后450 nm比色并記錄A450 nm值。試驗中標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對照和空白組均設(shè)復(fù)孔。以糖蛋白抗原含量（IU／ml）和相應(yīng)吸光度值作散點圖，糖蛋白抗原含量為Y軸，吸光度值為X軸，用EXCEL軟件進行二項式回歸，得回歸方程（Y＝a?X2＋bX＋C）。將待測樣品的吸光度值代入回歸方程即可計算出糖蛋白的含量。

1.3 糖蛋白檢測雙抗體夾心ELISA方法學(xué)驗證

1.3.1 特異性驗證：參考文獻［2］取流感裂解疫苗等其他非狂犬人用疫苗原倍濃度上樣檢測，100 μl／孔，記錄A450nm值，根據(jù)Cut?off值，對檢測結(jié)果作出判定。為驗證人用狂犬疫苗中輔料成分是否有非特異反應(yīng)，取不同濃度人血白蛋白（10%），右旋糖苷（40%）等疫苗中常見的輔料進行檢測。

1.3.2 重復(fù)性驗證：組內(nèi)重復(fù)性試驗，取人用狂犬病疫苗國際標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶64倍稀釋后（糖蛋白含量為0.103 IU／ml），平行10份，進行ELISA檢測，記錄A450nm值。組間重復(fù)性試驗，取上述64倍稀釋的國家標(biāo)準(zhǔn)品100 μl進行ELISA檢測，記錄A450nm值，于不同工作日內(nèi)各重復(fù)6次。

1.3.3 靈敏度驗證：取人用狂犬病疫苗國際標(biāo)準(zhǔn)品進行2倍系列稀釋，各取100 μl進行ELISA檢測，設(shè)立陰性對照及空白孔。Cut?off值＝（A450nm陰性對照?A450nm空白）×2.1。

1.3.4 適用性驗證：取疫苗生產(chǎn)毒株分別為CTN，aG，PM1503和PV株的人用狂犬病疫苗各1批，系列倍比稀釋后，各取100 μl進行雙抗體夾心ELISA檢測，記錄A450 nm值。并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算出待檢樣品中糖蛋白抗原含量。

2 結(jié)果

2.1 人用狂犬病疫苗中糖蛋白檢測方法的建立

采用方陣滴定法最終確定包被抗狂犬病病毒糖蛋白基因工程抗體RVAB09的最佳濃度為200 ng／孔，HRP酶標(biāo)二抗（標(biāo)記前抗體濃度為1 mg／ml）的最佳工作濃度為1∶2 000倍稀釋。采用第6批人用狂犬病疫苗國際標(biāo)準(zhǔn)品作為ELISA試驗定量檢測用標(biāo)準(zhǔn)品，該批國際標(biāo)準(zhǔn)品采用1 ml雙蒸水復(fù)溶，則糖蛋白抗原含量為3.3 IU／ml。對該標(biāo)準(zhǔn)品進行2倍稀釋檢測后，取糖蛋白抗原含量和相應(yīng)吸光度值做散點圖（圖1），可見典型的拋物線型，用EXCEL軟件進行二項式回歸，二項式方程為y＝0.015x2＋0.0767x＋0.0042，R2＝0.9984。

圖1 糖蛋白抗原含量檢測標(biāo)準(zhǔn)品檢測回歸曲線Fig.1 Standard regression curve of detection for glycoprotein antigen

2.2 糖蛋白檢測雙抗體夾心ELISA方法學(xué)驗證

2.2.1 特異性：選用流感病毒裂解疫苗、出血熱疫苗、甲型肝炎滅活疫苗和乙型腦炎疫苗原倍濃度下進行檢測，檢測結(jié)果均為陰性。為驗證疫苗中輔料成分對實驗的影響程度，對人血清白蛋白，右旋糖苷等疫苗中常見的輔料進行了檢測，結(jié)果亦為陰性。其中人血清白蛋白濃度在1%濃度下時450 nm下的吸光度值平均僅為0.058（Cut?off值為0.1365）。以上結(jié)果顯示該ELISA糖蛋白檢測方法與非狂犬病疫苗及人血清白蛋白等疫苗輔料成分無交叉反應(yīng)，特異性良好。

2.2.2 重復(fù)性：重復(fù)性驗證分組內(nèi)重復(fù)性和組間重復(fù)性兩方面進行驗證，64倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品（糖蛋白含量為0.103 IU／ml），平行10次檢測，450 nm下的吸光度值分別為1.078、1.136、1.109、1.076、1.084、1.118、1.122、1.081、1.128和1.079，計算得組內(nèi)變異系數(shù)為2.2%；同一樣品在不同時間段平行6次檢測，450 nm下的吸光度值分別為1.078、1.096、 1.116、1.057、0.921、1.277，組間變異系數(shù)為10.5%。綜上，該ELISA方法具有較好一致性，精密度良好。

2.2.3 靈敏度：將人用狂犬病疫苗國際標(biāo)準(zhǔn)品（6.6 IU／ml）進行2倍系列稀釋，可見在2048倍稀釋后，對應(yīng)糖蛋白含量僅為0.0016 IU／ml，ELISA檢測450 nm吸光度值為0.028，遠大于Cut?off值，結(jié)果為明顯陽性（詳見表1）。表明該ELISA檢測方法的靈敏度能夠用于對狂犬病病毒糖蛋白的抗原含量的測定檢測，線性范圍為0.002?0.1 IU／mL。

表1 靈敏度驗證結(jié)果（Cut?off值：0.015）Tab.1 Validation of the sensitivity

表2 對不同狂犬病疫苗株的檢測結(jié)果（Cut?off值：0.024）Tab.2 Results of different rabies vaccine strains

2.2.4 適用性驗證：目前國內(nèi)人用狂犬病疫苗企業(yè)所用毒株主要有CTN株，aG株和PV株。為了解ELISA方法對不同毒株人用狂犬病疫苗的檢測效果，每毒株隨機取1個批次進行檢測，總計3批次人用狂犬病疫苗，所用疫苗均為上市產(chǎn)品。將疫苗進行20、40、80和160倍稀釋后，進行檢測。結(jié)果顯示上述3種人用狂犬病疫苗的不同稀釋度的吸光度值呈量效關(guān)系，選取吸光度值在1.0左右的稀釋度進行計算（表2），雖然不同毒株疫苗的檢測稀釋倍數(shù)有一定的差異，但均可檢測。

3 討論

狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的致死性疾病，疫苗是目前有效的重要預(yù)防手段之一，目前，人用狂犬病疫苗主要是由滅活狂犬病病毒組成［1，3］?？袢〔《究乖鶕?jù)組分和功能不同，主要有核衣殼抗原和糖蛋白抗原。其中，糖蛋白抗原位于病毒的包膜和刺突上，是狂犬病病毒唯一能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體的蛋白，此特性主要依賴于其三維結(jié)構(gòu)的維持。糖蛋白也能有效地刺激T淋巴細胞的增生，是誘發(fā)細胞免疫和體液免疫的主要抗原物質(zhì)，能引起抗感染免疫功能［1］。確保人用狂犬病疫苗的安全有效對于該疫苗質(zhì)量控制致關(guān)重要，其中用于評價狂犬病疫苗效力的試驗是美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）方法［4，5］，但該方法實驗周期長（28 d），操作復(fù)雜，不適用于疫苗純化過程中的監(jiān)測。近年來國內(nèi)外已開展了一系列的體外試驗，以尋求便捷可靠的替代方法。基于3R原則和國際動物保護協(xié)會對實驗動物的制約，狂犬病疫苗效力的鑒定迫切需要改進并與國際接軌。因而建立快速、準(zhǔn)確且不用動物的狂犬病疫苗效力檢測方法勢在必行［6］。

ELISA方法是一種快速、準(zhǔn)確、廉價、簡便的免疫學(xué)檢測手段，國內(nèi)外很多研究者［7?9］一直在探索體外檢測糖蛋白抗原含量替代動物檢測疫苗效力的方法。其所采用的包被抗體一般為鼠源單抗，酶標(biāo)二抗為多抗，或者兩者均為多抗，多克隆抗體測定中易受可溶糖蛋白的干擾，會過高估計疫苗的抗原性［10］。本研究采用2株抗狂犬病病毒糖蛋白的基因工程抗體進行配對，建立了可以快速檢測人用狂犬病疫苗中糖蛋白含量的雙抗體夾心ELISA方法。與之前文獻報道的糖蛋白檢測ELISA方向相比，而本研究中所用包被抗體和酶標(biāo)二抗均為抗糖蛋白的基因工程抗體，重組基因工程抗體的活性相對穩(wěn)定，而且制備方法相對簡便。

本研究所建立的方法，經(jīng)過方法學(xué)驗證，具有良好的特異性和重復(fù)性，檢測靈敏度可達0.0016 IU／ml，線性范圍為0.002?0.1 IU／ml。通過檢測國內(nèi)不同毒株的上市疫苗產(chǎn)品，均有檢測信號，疫苗的不同稀釋度的吸光度值呈量效關(guān)系。因此本研究所建立的方法可用于CTN株，aG株，PM1503株和PV株所生產(chǎn)的人用狂犬病疫苗糖蛋白抗原含量的檢測，可用于疫苗生產(chǎn)中的原液質(zhì)量控制，指導(dǎo)半成品的配制。另外，本研究也發(fā)現(xiàn)單純糖蛋白抗原含量與傳統(tǒng)動物法的NIH效價之間對應(yīng)關(guān)系不理想，但對于相同毒株，同一企業(yè)的疫苗產(chǎn)品則存在一定的量效關(guān)系（數(shù)據(jù)未展示）。

雖然ELISA檢測糖蛋白抗原方法尚不能替代NIH法，但是對尋找替代人用狂犬病疫苗效價測定方法具有一定參考價值［11］。近年來國內(nèi)外研究人員做了大量的研究工作，并取得可喜的成果［12］。本研究所建立的方法對于人用狂犬病疫苗生產(chǎn)質(zhì)控及效價測定方法替代奠定基礎(chǔ)，具有重要意義。

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Validation of the rapid identification test on rabies vaccine by ELISA methods

Cao Shouchun，Zhang Quanfu，Wang Yunpeng，Liu Yang，Li Aqian，Li Chuan，Sun Linan，Liang Mifang

National Institute for the Food and Drug Control，Beijing，100050，China（Cao SC，Wang YP）；National Institute for viral Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China（Zhang QF，Liu Y，Li AQ，Li C，Sun LN，Liang MF）

Cao Shouchun and Zhang Quanfu contributed equally to this work

Liang Mifang，mifangl＠vip．sina．com

ObjectiveTo establish a rapid detection method for the glycoprotein antigens of rabies vaccine.MethodUse two strains gene engineering antibody of anti?rabies virus glycoprotein to set up sandwich ELISA assay.Phalanx titration had been used to determine the best working concentration of the coated antibody and HRP labeled antibody.Then the specificity，sensitivity，repeatability and applicability were been validated.ResultsThe coated antibody concentration was 200 ng／well，and the best dilution ratio of HRP?antibody was 1：2000.The method has fine specificity and sensitivity.The coefficient of variation of is below 15%.Different vaccines producing by CTN，aG，PM1503 and PV strain can be effective detected.ConclusionGlycoprotein detection method by ELISA was successfully established，and is suitable for rabies vaccine.It is of great significance for quality control of rabies vaccine，and laying the groundwork for the alternative potency test.

Rabies vaccine；Human use；Glycoprotein detection；Validation

梁米芳，Email：mifangl＠vip.sina.com

10.3760／cma.j.issn.1003?9279.2016.06.000

人用狂犬病疫苗；糖蛋白檢測；驗證

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