改良小鼠后肢淋巴水腫模型的構(gòu)建

孫一宇 崔春曉 戴婷婷 蔣朝華 曹衛(wèi)剛 李圣利

改良小鼠后肢淋巴水腫模型的構(gòu)建

孫一宇 崔春曉 戴婷婷 蔣朝華 曹衛(wèi)剛 李圣利

目的通過調(diào)整輻射劑量和手術(shù)時(shí)機(jī)，構(gòu)建一種更為穩(wěn)定和持久的小鼠后肢淋巴水腫模型。方法將36只8周齡雌性C57小鼠隨機(jī)分為3組：術(shù)前放療組（R+S）、術(shù)后放射組（S+R）、術(shù)前及術(shù)后放射組（r+S+r）。采用淋巴結(jié)摘除手術(shù)聯(lián)合局部放射的方法進(jìn)行模型構(gòu)建。R+S組于術(shù)前3 d接受4.5 Gy的局部放射，S+R組于術(shù)后2周接受4.5 Gy的局部放射，r+S+r組于術(shù)前3 d和術(shù)后2周分別接受2.25 Gy的局部放射。術(shù)后采用排水法測量動(dòng)物后肢體積變化。術(shù)后24周時(shí)在后肢注射FDNG以顯示體內(nèi)淋巴管的分布，并結(jié)合免疫組化計(jì)數(shù)微淋巴管數(shù)目來評價(jià)淋巴管新生的情況。結(jié)果在我們?yōu)槠?個(gè)月的觀察中，所有小鼠均成功形成淋巴水腫。尤以r+S+r組形成的淋巴水腫最為明顯、穩(wěn)定持久，且死亡率和并發(fā)癥率較低。術(shù)后24周的淋巴管造影顯示，R+S及S+R組后肢淺表淋巴管密度增加，r+S+r組少有淋巴管再生。免疫組化結(jié)果顯示，r+S+r組的淋巴管數(shù)量要少于R+S及S+R組（P＜0.05）。結(jié)論在術(shù)前3 d及術(shù)后2周分別接受2.25 Gy的局部放射，可以成功構(gòu)建穩(wěn)定持久的小鼠后肢淋巴水腫模型。

淋巴水腫動(dòng)物模型淋巴管放射

構(gòu)建持久穩(wěn)定的淋巴水腫動(dòng)物模型極為困難，傳統(tǒng)的小鼠淋巴水腫模型是通過手術(shù)切除淋巴結(jié)聯(lián)合局部放療的方法進(jìn)行的，存在著較高的死亡率及眾多的并發(fā)癥[1-2]。我們對放射劑量和時(shí)機(jī)進(jìn)行了優(yōu)化，成功構(gòu)建出一種持久穩(wěn)定的小鼠后肢淋巴水腫模型，死亡率及并發(fā)癥都較低，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

兔抗小鼠LYVE-1抗體（1∶400，Angiobio公司，美國）；山羊抗兔抗體（1∶200），二氨基聯(lián)苯胺（武漢谷歌生物科技有限公司）；熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；倒置相差顯微鏡（Leica公司，德國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

36只健康8周齡C57雄性小鼠（中國科學(xué)院動(dòng)物研究所），SPF級條件下飼養(yǎng)，遵守中國國家衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)室研究動(dòng)物保健和使用指南。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

36只小鼠隨機(jī)分成3組：R+S組（n=12），即術(shù)前3 d接受4.5 Gy的局部照射；S+R組（n=12），即術(shù)后2周接受4.5 Gy的局部照射；r+S+r組（n=12），即分別于術(shù)前3 d及術(shù)后2周接受2.25 Gy的局部照射。未作處理的對側(cè)后肢作為正常對照組。

1.4 手術(shù)方式

在小鼠右后肢足墊處皮下注射亞甲藍(lán)，使得淋巴結(jié)及淋巴管顯影，之后腹腔注射5%水合氯醛進(jìn)行麻醉。麻醉后在右后肢膝上1 cm處作一環(huán)形切口，并環(huán)形切除1 cm的皮膚及皮下組織。術(shù)中仔細(xì)保留神經(jīng)血管束、肌肉及肌腱。在解剖顯微鏡下摘除腘窩淋巴結(jié)，并切除藍(lán)染的淋巴管，電刀灼燒周圍皮膚。手術(shù)完成后傷口處涂抹紅霉素軟膏預(yù)防感染。

1.5 放射處理

手術(shù)處理側(cè)的后肢置于銫139的輻射下，暴露的放射區(qū)域以術(shù)區(qū)為中心面積1.1 cm2，余下部位用鉛板進(jìn)行遮擋。R+S組及S+R組分別于術(shù)前3 d和術(shù)后2周接受4.5 Gy的照射。r+S+r組則分別于術(shù)前3 d及術(shù)后2周接受2.25 Gy的照射。

1.6 排水法測量后肢體積變化

為了觀察實(shí)驗(yàn)側(cè)后肢體積的變化情況，我們采用排水法進(jìn)行測量。將小鼠后肢浸入裝滿生理鹽水的5 mL的Ep管內(nèi)，浸水深度為膝關(guān)節(jié)上方1 cm平面。將后肢拿出后，重新將離心管裝滿，此時(shí)所需要的液體量即為后肢的體積。同樣的方法測量未接受處理的后肢。所有動(dòng)物每周測量1次，持續(xù)6個(gè)月。每次測量重復(fù)3次，取平均值。

1.7 熒光顯微鏡進(jìn)行淋巴管成像

前期研究中，我們采用葡聚糖-聚丙烯酸熒光納米凝膠（FDNG）作為顯影劑[3]，該材料可在體內(nèi)清楚顯示淋巴管分布情況，具有生物安全性。本實(shí)驗(yàn)仍以此為顯影劑來顯示深部淋巴管。為了觀察后肢新生淋巴管的分布情況，在術(shù)后24周進(jìn)行了熒光顯微鏡的拍攝。于局麻下經(jīng)后肢足墊處皮內(nèi)注射FDNG（20 μg的樣本與20 μg的水混合），并輕輕按摩足墊促使其更好分散。在熒光光學(xué)成像系統(tǒng)下進(jìn)行拍攝，觀察造影劑的攝取及淋巴管的分布情況。

1.8 免疫組化染色

所有小鼠在術(shù)后24周處死，取后肢的皮膚及肌肉組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，5 μm厚度切片。脫蠟、水化、封閉后，標(biāo)本與一抗LYVE-1在4℃條件下孵育過夜。次日，標(biāo)本與二抗孵育30 min，DAB染色，高倍鏡下隨意選取4個(gè)視野進(jìn)行LYVE-1陽性的管狀結(jié)構(gòu)的計(jì)數(shù)，結(jié)果取平均值。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，排水法測量肢體體積，微淋巴管計(jì)數(shù)采用t檢驗(yàn)及方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后觀察

所有動(dòng)物術(shù)后都很快產(chǎn)生了急性淋巴水腫。r+ S+r組有1只小鼠（9%）因麻醉過量死亡，說明重復(fù)低劑量的放射對小鼠來說是可以耐受的。S+R組有3只小鼠（25%）死于感染，還有5只（42%）發(fā)生了肢端壞死。R+S組有3只（25%）小鼠死于感染，另有4只（33%）發(fā)生肢端壞死。

2.2 各組模型淋巴水腫效果的比較

術(shù)后1周，R+S和r+S+r組的腫脹程度要明顯高于S+R組。1周后，3組體積均有所減小，相較于S+R組，R+S和r+S+r組的減少速度較慢。術(shù)后第2周，分別給予S+R組及r+S+r組4.5 Gy和2.25 Gy的局部放射，之后這兩組的體積繼續(xù)增加，直到第6周。相比之下，由于缺少放射對淋巴管的破壞作用，R+S組的體積持續(xù)減小。6周后，3組的體積均開始減小。在第10周和第12周時(shí)，R+S組及S+R組的體積接近對照組的水平，r+S+r組第8周后肢體的體積無明顯變化，且維持到術(shù)后6個(gè)月（圖1、2）。

2.3 淋巴水腫后肢的淋巴管顯影

我們在術(shù)后24周時(shí)使用FDNG為造影劑，來顯影淋巴管。在R+S及S+R組，后肢淺表淋巴管不僅密度增加，且呈現(xiàn)卷曲、分枝的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)（圖3）。大量的微淋巴管穿越術(shù)區(qū)的瘢痕組織，并形成新的連接。r+S+r組少有淋巴管再生，也沒有觀察到術(shù)區(qū)兩端淋巴管相連接的情況。

2.4 淋巴水腫后肢淋巴管新生的評估

免疫組化染色顯示，r+S+r組的淋巴管數(shù)量要少于R+S及S+R組（圖4、5）。相較于對照側(cè)，實(shí)驗(yàn)側(cè)的淋巴管呈現(xiàn)出薄壁、管腔擴(kuò)大且卷曲等特點(diǎn)（圖4）。這表明多次的局部放射在抑制淋巴管新生方面更有效。

圖1 術(shù)后24周各組肢體腫脹情況對比Fig.1Comparison of the edematous limbs in each group at the 24th week after operation

圖2 術(shù)后各組肢體體積變化Fig.2Volume changes of the hind limbs in each group at different time point

圖3 術(shù)后24周后肢活體淋巴管造影Fig.3Lymphatic mapping of hind limbs in vivo at the 24thweek after operation

圖4 微淋巴管免疫組化觀察Fig.4Immunohistochemical observation of lymphatic vessels

圖5 微淋巴管計(jì)數(shù)Fig.5Microlymphatic count

3 討論

我們成功制備了一種較持久且穩(wěn)定的小鼠后肢淋巴水腫模型，可維持至少6個(gè)月。我們發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)的放射方式相比[4-5]，通過多次低劑量照射的方式，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡率及并發(fā)癥的發(fā)生顯著降低。因此，我們認(rèn)為通過手術(shù)輔以多次低劑量局部放射的方式可以有效制備持久且穩(wěn)定的淋巴水腫模型，為相關(guān)研究提供了可靠的淋巴水腫模型制備方法。

采用單純的手術(shù)方式，并不能制備持久的水腫模型。主要是由于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力較強(qiáng)，而導(dǎo)致淋巴管恢復(fù)再通。Joseph等[6]的研究顯示，淋巴管切除術(shù)后所致的炎性反應(yīng)，會(huì)使周圍組織釋放促淋巴管新生因子，如VEGF-C、bFGF等，激活干細(xì)胞和已存在的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，使其分化增殖，從而促進(jìn)淋巴管新生。該研究指出，沒有額外的干預(yù)很難形成持久的淋巴水腫。研究報(bào)道，通過術(shù)前或術(shù)后放射的方式可使淋巴水腫的持續(xù)時(shí)間延長[1,7]。但是，以往的研究中，小鼠的死亡率及肢端壞死率都較高，可能是不恰當(dāng)?shù)姆派鋭┝克鶎?dǎo)致。因此，調(diào)整放射劑量使得小鼠既不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重副作用，又能維持穩(wěn)定的淋巴水腫，顯得尤為重要。我們設(shè)計(jì)了3種組合，以確定能與手術(shù)較好結(jié)合的放射劑量，即術(shù)前3 d接受4.5 Gy的局部放射（R+S），術(shù)后2周接受4.5 Gy的局部放射（S+R），術(shù)前3 d及術(shù)后2周分別接受2.25 Gy的放射（r+S+r組）。結(jié)果顯示，3組都發(fā)生了淋巴水腫，其中r+S+r組水腫最為明顯且持久，死亡率及并發(fā)癥率最低，且無肢體壞死發(fā)生。

有報(bào)道顯示，放射導(dǎo)致淋巴水腫，是由于射線破壞了淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，從而導(dǎo)致脂質(zhì)沉積、TGF-β生成增多（已知其會(huì)抑制淋巴管內(nèi)皮的增殖）[8]。但是，由于手術(shù)刺激會(huì)使淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞及祖細(xì)胞參與淋巴管新生，因此術(shù)前給予放射就有可能會(huì)被術(shù)后刺激所產(chǎn)生的淋巴管新生作用所抵消，而無法產(chǎn)生明顯的淋巴水腫效果。這就是術(shù)后1周R+S組的體積增長最快，但水腫狀態(tài)很快消退，最后并沒有形成明顯的淋巴水腫的原因。而在術(shù)后給予放射，不僅抑制了手術(shù)刺激產(chǎn)生的淋巴管新生作用，而且抑制了VEGF-C的釋放[9]。因此，S+R組水腫時(shí)間持續(xù)更長。然而，4.5 Gy的放射量及手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致小鼠的死亡率及肢體壞死率上升。而將總量為4.5 Gy的放射劑量分成兩等分，并在不同時(shí)間點(diǎn)給予（術(shù)前3 d，術(shù)后2周），結(jié)果顯示，淋巴管新生現(xiàn)象及大劑量輻射導(dǎo)致的肢體壞死確實(shí)得到了抑制及避免。另外，由于反復(fù)放射導(dǎo)致的細(xì)胞輻射敏感性增加[10]，其抑制淋巴管新生的效應(yīng)明顯得到加強(qiáng)。因此，術(shù)后很快就能達(dá)到淋巴水腫急性期的高峰，且水腫程度在24周內(nèi)都維持在一個(gè)較高水平，而死亡及肢體壞死之類的副反應(yīng)卻較少?；铙w淋巴管造影及免疫組化顯示，淋巴管密度的差異證實(shí)了r+S+r組淋巴管新生作用較弱。而且輻射的時(shí)機(jī)對模型的構(gòu)造也起到關(guān)鍵作用，之所以選擇術(shù)前3 d進(jìn)行放射，是因?yàn)橛形墨I(xiàn)報(bào)道輻射對淋巴組織的損害是在3 d后開始的[11]；而術(shù)后2周正是術(shù)后淋巴管新生作用開始的時(shí)候。雖然總劑量仍為4.5 Gy，但采取分次放射的方法顯著減輕了副作用。因此，我們認(rèn)為上述聯(lián)合方式是構(gòu)建淋巴水腫模型的有效方法。

4 總結(jié)

我們通過“低劑量放射+手術(shù)+低劑量放射”的方式成功構(gòu)建小鼠淋巴水腫模型，效果持久，死亡率及并發(fā)癥率較低，此模型能夠滿足繼發(fā)性淋巴水腫研究的要求。

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An Improvement Model of Secondary Lymphedema in Hind Limb of Mouse

SUN Yiyu,CUI Chunxiao,DAI Tingting,JIANG Chaohua,CAO Weigang,LI Shengli.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:LIShengli(E-mail:drlishengli@sina.com).

ObjectiveTo establish a more stable and sustainable model of mouse lymphedema by adjusting the administrating timing and radiation doses.MethodsThirty-six female C57 mice aged 8weeks were randomly divided into 3 groups:"radiation before surgery"group(R+S,n=12),"radiation after surgery"group(S+R,n=12),and"radiation before and after surgery"group(r+S+r,n=12).The experimental groups received radiation at varied time points:S+R group,4.5 Gy at 2 weeks after surgical treatment;R+S group,4.5 Gy at 3 days before surgery;and r+S+r group,2.25 Gy at both 3 days before and 2 weeks after surgery.The volume change of the hind limbs of animals was measured by drainage method. Lymphangiogenesis in vivo situation was visualized by FDNG injection through the hind limb at 24th week after operation and immunohistochemistry staining was performed to show superficial lymphatic vessels.ResultsIn six-month observation, all mice in the experimental groups formed lymphedema successfully.The r+S+r group showed the most stable hind limb lymphedema with lower mortality and morbidity rates.At 6 months post operation,according to the lymphatic mapping,the lymphatic vessels in R+S and S+R group increased,while rare lymphatic regeneration was observed in the r+S+r group. Immunohistochemistry revealed a decreased number of lymphatic vessels in the r+S+r group,compared with other groups(P＜0.05). ConclusionA radiation dose of 2.25 Gy administered 3 days before surgery and 2 weeks after operation successfully enhanced the stability of the lymphedema model of mice hind limb.

Lymphedema;Animal model;Lymphatic vessels;Radiation

R551.2

A

1673－0364（2016）06－0349－04

2016年9月10日；

2016年10月29日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.06.005

國家自然科學(xué)基金（81501571）。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

李圣利（E-mail：drlishengli@sina.com）。