BMSCs聯(lián)合3D打印PLLA支架促進兔顱骨PDO的研究

趙丹陽 姜聞博 張海峰 杜 朝 杜子婧 韓 冬

BMSCs聯(lián)合3D打印PLLA支架促進兔顱骨PDO的研究

趙丹陽 姜聞博 張海峰 杜 朝 杜子婧 韓 冬

目的探討骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）促進骨膜牽張成骨（Periosteal distraction osteogenesis，PDO）的可行性。方法全骨髓貼壁培養(yǎng)法獲取新西蘭白兔BMSCs，體外擴增培養(yǎng)并進行成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化。用3D打印（Three-dimensional printing，3D printing）的左旋聚乳酸（Poly l-lactic acid，PLLA）支架牽張兔顱骨骨膜，在牽張期結(jié)束時，實驗組于骨膜與顱骨間隙內(nèi)注射兔BMSCs，對照組則注射等量生理鹽水（Normal saline，NS）。分別在固定期后的4周和8周，對兔顱骨的牽張部位進行取材，行Micro-CT掃描和組織學(xué)染色，評價新骨形成情況。結(jié)果全骨髓培養(yǎng)法獲取的兔BMSCs具有多向分化能力。Micro-CT顯示實驗組和對照組的牽張區(qū)域在4周和8周均有新骨生成，實驗組在兩個時間點的新生骨量（Bone volume，BV）、骨量/組織量（Bone volume/Tissue volume，BV/TV）、骨密度（Bone mineral density，BMD）、骨小梁數(shù)量（Trabecular number，Tb.N）和厚度（Trabecular thickness，Tb.Th）均明顯高于對照組，骨小梁間隔（Trabecular separation，Tb.Sp）小于對照組。HE染色顯示，實驗組與對照組均有新骨生成，實驗組新生骨小梁增厚增多，比對照組成熟，且與顱骨皮質(zhì)的界線不明顯。結(jié)論在兔顱骨PDO區(qū)域內(nèi)注射自體BMSCs可以補充成骨細胞的不足，有利于骨膜牽張成骨。

骨髓間充質(zhì)干細胞三維打印左旋聚乳酸骨膜牽張成骨

針對骨折后引起的功能缺陷和外觀畸形，尤其是陳舊性骨折造成的大塊骨缺損的修復(fù)，一直是重建外科領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)。臨床上常采用移植替代物、引導(dǎo)骨再生（Guided bone regeneration，GBR）和牽張成骨（Distraction ostogenesis，DO）等技術(shù)，對骨缺損進行治療，但均存在不同程度的缺陷。骨膜牽張成骨（Periosteal distraction osteogenesis，PDO）技術(shù)是繼DO后的又一次突破，它將組織擴張術(shù)和GBR相結(jié)合，在骨表面和骨膜之間形成人工空間，不需要截骨術(shù)或骨皮質(zhì)切開，僅通過牽張骨膜就可以誘導(dǎo)新骨形成。本實驗采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法，分離兔骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），聯(lián)合三維打?。═hree-dimensional printing，3D printing）技術(shù)定制的左旋聚乳酸（Polyl-lactic acid，PLLA）支架，牽張兔顱骨骨膜，為修復(fù)大塊骨缺損提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

PLLA材料（濟南岱罡生物工程有限公司），鈦釘（OsteoMed公司，美國）。DMEM/高糖培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素（HyClone公司，美國），0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（Gibco公司，美國），CCK-8試劑盒（Dojindo公司，日本）。

CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國），酶標儀（Tecan公司，瑞士），倒置相差顯微鏡（Zeiss公司，德國），掃描電鏡（FEI公司，美國），離子濺射鍍膜儀（Quorum公司，英國），力學(xué)測試機（Instron公司，美國），Micro-CT掃描儀（Scanco公司，瑞士）。

1.2 實驗動物

6～8周齡新西蘭大耳白兔16只，雄性，體質(zhì)量2.5～3 Kg（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物科學(xué)部）。1.3培養(yǎng)原代BSMCs

1.3.1 BSMCs分離與培養(yǎng)

利用全骨髓貼壁法培養(yǎng)兔BMSCs。抽取骨髓液4～5 mL，使用20 mL完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素）進行培養(yǎng)，第3天開始半換液，經(jīng)過3次半換液后，每2～3天全換液一次，使用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)及生長情況。待BMSCs達到80%～90%融合后，0.25%胰酶消化傳代。采用第3代細胞進行后續(xù)實驗。

1.3.2 繪制BSMCs增殖曲線

胰酶消化第二代BMSCs，計數(shù)后1×105cells/mL的密度接種于96孔板，分別于接種后1 d、3 d、5 d、7 d和9 d檢測細胞活性。每孔加入10 μL CCK8試劑，于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標儀檢測450 nm處的光密度值，每組5個復(fù)孔，統(tǒng)計后繪制細胞增殖曲線。

1.3.3 BSMCs的多向分化

1.3.3.1 成骨分化

BMSCs以1×105cells/mL的密度接種于6孔板，在完全高糖培養(yǎng)基中加入0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和50 μmol/L維生素C，每3天換液一次，于第7天行堿性磷酸酶染色，第21天行茜素紅染色，觀察BMSCs向成骨細胞分化情況。

1.3.3.2 成脂分化

BMSCs以1×105cells/mL的密度接種于6孔板，以10-6mol/L地塞米松、10 μm/L胰島素、0.5 mmol/L IBMX和0.2 mmol/L吲哚美辛，進行成脂誘導(dǎo)分化，第12天行油紅染色，倒置相差顯微鏡下觀察。

1.3.3.3 成軟骨分化

用微球培養(yǎng)方式誘導(dǎo)BMSCs分化為軟骨細胞，將細胞密度調(diào)整為1×107cells/mL進行接種，待細胞貼附后加入成軟骨誘導(dǎo)液，成軟骨誘導(dǎo)液含10ng/mL TGF-β1、1×ITS、4.7 μg/mL亞油酸、0.5 mg/mL BSA、100 nM地塞米松、37.5 μg/mL維生素C。誘導(dǎo)21 d后，將形成的軟骨小球固定，脫水，包埋，切片，阿爾新藍染色，檢測細胞外基質(zhì)中的蛋白聚糖。

1.43 D打印PLLA支架

本實驗采用熔融沉積造型術(shù)基礎(chǔ)上的3D打印技術(shù)。首先以計算機輔助設(shè)計軟件設(shè)計支架，PLLA尺寸設(shè)置為長12 mm、寬10 mm、高1 mm，在邊緣恰當位置設(shè)置三個直徑2 mm的孔洞，然后將設(shè)計完成的參數(shù)輸入3D打印機，設(shè)置孔徑為300 μm，調(diào)整相關(guān)打印參數(shù)，即可按生物擠壓的方法進行材料的批量打印，最后對多余的材料進行修整即可。

1.5 PLLA支架的特點

1.5.1 掃描電鏡

將BMSCs以1×105cells/mL的接種于3D打印的PLLA支架，7 d后將材料-細胞復(fù)合物用臨界點干燥法干燥，2.5%戊二醛固定，乙醇梯度脫水，加入乙酸異戊酯替換30 min后，使用雙面膠將支架固定在電鏡觀察臺上，離子濺射鍍膜儀表面噴金后抽真空，觀察拍攝。

1.5.2 力學(xué)測試

將打印好的PLLA支架行力學(xué)測試，重復(fù)5組，記錄應(yīng)力-應(yīng)變曲線并分析。

1.5.3 毒性試驗

PLLA材料照射紫外線殺菌后，浸沒于完全培養(yǎng)基中（10 mL/cm2），配制標準1×浸提液，同樣的方法準備0.5×、2×和4×的浸提液，并于培養(yǎng)箱中孵育48 h后4℃冷藏。將BMSCs消化后接種于96孔板（1×105cells/mL，100 μL/well），細胞貼壁后，將培養(yǎng)基更換為不同濃度的浸提液，培養(yǎng)1 d、3 d、5 d、7 d后CCK-8法檢測細胞活性。以完全培養(yǎng)基中的細胞作為陰性對照，RGR=(實驗組光密度值/對照組光密度值)×100%。毒性分為5級：分級0，RGR≥100%；分級1，RGR≥80%；分級2，RGR≥50%；分級3，RGR≥30%；分級4，RGR≥0。毒性分級為0和1的材料可用于體內(nèi)實驗。

1.6 牽張裝置的組成和設(shè)計

骨膜牽張裝置由三部分組成，PLLA支架（長×寬×高=12 mm×10 mm×1 mm，包括三個直徑2 mm的孔）、兩枚自鉆鈦釘（長度5 mm，直徑1.5 mm）和一枚自攻鈦釘（長度12 mm，直徑2 mm）。PLLA支架構(gòu)成了整個牽張裝置的主體，兩枚自鉆螺釘用于固定PLLA網(wǎng)，通過PLLA網(wǎng)一端的兩個孔將支架固定在兔的顱骨上，另一根自攻螺釘用于牽張支架，使支架的另一端不斷抬升，形成斜坡，從而達到牽張骨膜的效果。總的來說，就是在骨膜和顱骨間形成一個楔形的間隙，既可以有效防止周圍組織的入侵，也為成骨提供空間（圖1）。

圖1 牽張裝置的組成和設(shè)計Fig.1Constitution and design of the distraction device

1.7 手術(shù)方法

在兔前額處由后向前設(shè)計一“L”型切口，切開皮膚，與骨膜分離后，再以倒“L”型切開并剝離骨膜，使骨質(zhì)充分暴露，注意保護好毗鄰的顳淺血管分支及骨膜的完整性。該切口設(shè)計剛好可以使牽張螺釘?shù)奈恢媒?jīng)過皮膚切口。將PLLA牽張支架置于骨膜下空間并用自鉆螺釘固定在顱骨皮質(zhì)骨上。最后，使骨膜完全覆蓋材料后，逐層縫合骨膜及皮膚。

經(jīng)過7 d的延遲期，于術(shù)后1周拆除部分皮膚切口縫線，在支架的牽張螺釘部位以2 mm切口切開骨膜，將消毒后的自攻螺釘擰入PLLA支架。螺釘每旋轉(zhuǎn)180°前進0.5 mm。牽張螺釘每天旋轉(zhuǎn)360°，每天旋轉(zhuǎn)兩次，5 d后牽張螺釘共進入5 mm。實驗組于牽張最后一天注射BMSCs，將1×106BMSCs以200 μL NS重懸并注射于牽張間隙內(nèi)，對照組注射等量的NS。

實驗動物均術(shù)后3 d連續(xù)肌注抗生素。在固定期內(nèi)，觀察螺釘有無脫落或松動，切口是否感染。

1.8 Micro-CT掃描

于牽張術(shù)后4周和8周時，將實驗組和對照組牽張區(qū)域的顱骨和牽張裝置一并取材，4%多聚甲醛固定48 h后，使用高分辨Micro-CT，在電壓90 KV、電流200 μA下以連續(xù)增量20 μm進行掃描。將掃描后的圖像用中值濾波法去除噪聲，并用固定閾值提取礦化骨成分。之后，采用Scanco uCT100分析軟件對顱骨以上100個掃描層面獲得的三維掃描圖像進行統(tǒng)計分析。

1.9 HE染色

在組織學(xué)染色之前，將掃描后的顱骨（去除牽張裝置）置于乙二胺四乙酸（EDTA）中脫鈣，2～3個月后待脫鈣完全，流水沖洗過夜，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，7 μm厚度切片，HE染色，對牽張區(qū)域內(nèi)的新生骨組織進行形態(tài)分析。

1.10 統(tǒng)計方法

所有的統(tǒng)計結(jié)果均以（x±s）表示，使用t檢驗進行數(shù)據(jù)差異分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代BMSCs的形態(tài)觀察和增殖曲線

3次半換液后，從第12天全換液開始，倒置相差顯微鏡下可見細胞呈集落生長，同一集落處細胞緊密，形狀如成纖維細胞的梭形，增殖迅速，造血細胞隨著換液和傳代逐漸消失。20 d時集落融合成片，細胞變得扁平，呈多層生長狀態(tài)，按1∶2進行傳代，傳代后的細胞在培養(yǎng)皿中均勻貼壁，細胞形態(tài)不改變，呈成纖維細胞樣的梭形，一般5～6 d即可達到80%～90%融合（圖2）。

圖2 BMSCs的形態(tài)Fig.2Morphology of BMSCs

2.2 BMSCs的增殖曲線

CCK8檢測細胞活性與細胞數(shù)量呈正比，第三代細胞增殖曲線表明BMSCs符合Logistic S形生長曲線，傳代后1～3 d細胞生長緩慢，4～7 d進入快速增長期，7 d后進入生長平臺期（圖3）。

圖3 BMSCs的增殖曲線Fig.3Proliferation curve of BMSCs

2.3 BMSCs的成骨、成脂以及成軟骨分化

成骨誘導(dǎo)7 d后，堿性磷酸酶染色顯示成骨誘導(dǎo)組顏色深于對照組。誘導(dǎo)21 d后，成骨誘導(dǎo)組的茜素紅染色可見鈣結(jié)節(jié)沉積明顯多于對照組。表明兔BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后可以向成骨方向分化。

對成脂誘導(dǎo)12 d后的BMSCs行油紅染色，細胞內(nèi)出現(xiàn)紅色的脂滴，大小不一，成串排列并圍繞在細胞核周圍，而對照組未觀察到胞漿內(nèi)脂滴形成。說明兔BMSCs可在特定條件下快速分化為脂肪細胞。

BMSCs在經(jīng)過軟骨微球誘導(dǎo)分化形成軟骨小球，對照組細胞在完全培養(yǎng)基中則沒有微球形成。軟骨小球阿爾新藍染色陽性，細胞外基質(zhì)酸性多糖呈藍色，細胞核用品紅染成紅色，說明BMSCs在體外具有向軟骨分化的潛能（圖4）。

圖4 BMSCs的成骨、成脂、成軟骨分化Fig.4The osteogenic,adipogenic and chondrogenic differentiation of BMSCs

2.4 掃描電鏡

掃描電鏡可見3D打印的PLLA支架呈現(xiàn)縱橫交錯的多孔通道，細胞復(fù)合培養(yǎng)7 d后可見BMSCs伸出偽足，附著于材料表面，細胞之間有絲狀纖維生成（圖5）。

圖5 PLLA支架掃描電鏡觀察Fig.5SEM observation of PLLA scaffold

2.5 力學(xué)測試

PLLA支架力學(xué)測試顯示,材料具有一定的彈性，彈性模量為（2052.8±56.21）MPa，最大彎曲載荷為（72.2±4.97）N，最大彎曲位移是（1.4±0.06）mm（圖6）。本實驗中，支架未見斷裂現(xiàn)象，說明其力學(xué)性能可以滿足牽張要求。

圖6 PLLA支架應(yīng)力應(yīng)變曲線Fig.6Stress-strain curve of PLLA scaffold

2.6 毒性試驗

不同濃度的PLLA支架浸提液，在不同時間作用于BMSCs的毒性分級均在0～1之間，而且高濃度的浸提液與低濃度浸提液相比，對細胞生長的影響并無明顯差異，可見PLLA支架具有良好的生物相容性，適合用于體內(nèi)實驗。

2.7 Micro-CT掃描

實驗組和對照組在兩個取材時間點，均肉眼可見在顱骨和PLLA支架之間的牽張區(qū)域內(nèi)，有新生組織形成，經(jīng)Micro-CT掃描證實均有新生骨質(zhì)長出。對新生的骨質(zhì)進行定量分析發(fā)現(xiàn)，NS和BMSCs組8周時的骨量（Bone volume，BV）、骨量/組織量（Bone volume/Tissue volume，BV/TV）以及骨密度（Bone mineral density，BMD）相對4周時增長明顯。BMSCs組在這兩個時間點的BV、BV/TV以及BMD都比NS組高。實驗組新生骨小梁的數(shù)量（Trabecular number，Tb.N）和厚度（Trabecular thickness，Tb. Th）高于對照組，骨小梁之間的間隔（Trabecular separation，Tb.Sp）低于對照組（圖7）。

圖7 各組Micro-CT掃描Fig.7Micro-CT scanning of each group

2.8 HE染色

HE染色同樣證實了新骨生成。4周時即出現(xiàn)骨小梁結(jié)構(gòu)，垂直于顱骨表面，與顱骨皮質(zhì)分界清晰，實驗組成骨較對照組成熟，軟組織較少。8周時骨小梁增粗增多，逐漸成熟，BMSCs組新生骨組織較NS組密集，與原有骨面垂直關(guān)系基本消失（圖8）。

圖8 各組組織學(xué)觀察（HE染色）Fig.8Histological observation of each group(HE staining)

3 討論

骨膜中富含可以分化為成骨細胞的骨祖細胞。PDO是一項新興的技術(shù)，利用骨膜的成骨能力，在骨表面和骨膜間形成人工空間，通過牽張骨膜再生骨組織。2002年，Schmidt等[1]首先通過組織學(xué)證實僅控制對骨膜的牽張，而不切開骨皮質(zhì)就可誘導(dǎo)新骨形成。PDO、DO均屬于膜性成骨，Kanno等[2]對人的骨膜細胞施以牽張力后，發(fā)現(xiàn)牽張力可刺激骨膜細胞表達成骨和成血管生長因子。在骨膜牽張的過程中，緩慢而穩(wěn)定的牽張力可以激活骨膜中的間充質(zhì)干細胞和未分化的成骨細胞，誘導(dǎo)分化為具有較高活性的成骨細胞，甚至鈣化為成熟的骨組織。與DO相比，PDO的優(yōu)勢在于不需要骨皮質(zhì)切開或截骨術(shù)，對機體損傷??；與移植替代物相比，PDO新生的骨組織用于骨缺損的治療類似于自體骨移植，避免了免疫相關(guān)的并發(fā)癥，解決了供體不足的問題。

Sencimen等[3]在對PDO和DO進行組織形態(tài)學(xué)比較時發(fā)現(xiàn)，PDO形成的骨量不及DO，而且DO形成的骨更加致密，PDO新生骨則富含脂肪組織，這是由于PDO成骨細胞僅來源于骨膜，而DO在成骨過程中成骨細胞和營養(yǎng)來源除了骨膜，還有骨折斷端暴露的骨組織。有研究采用骨皮質(zhì)鉆孔來改善這一問題[4-5]。骨皮質(zhì)表面鉆孔暴露骨松質(zhì)有利于骨髓和骨內(nèi)膜中的干細胞釋放，同時引起出血增多，允許成血管細胞進入膜下空間，還有利于骨組織的血管化。Saulacic等[6]的研究表明，如果骨髓腔沒有暴露，那么新生骨主要取決于骨膜，反之將取決于皮質(zhì)骨，說明骨髓和骨內(nèi)膜對PDO新骨形成均存在影響。為了減少對機體的損害，本實驗通過注射自體BMSCs來促進PDO，BMSCs注射與骨皮質(zhì)鉆孔可以達到相同的效果，兩者均能克服傳統(tǒng)PDO中成骨細胞來源不足的問題。

BMSCs是具有多向分化潛能的干細胞，來源廣泛、擴增表型穩(wěn)定，是目前組織工程最為理想的種子細胞[7]。BMSCs分離方法有密度梯度離心法和貼壁篩選法，本實驗采用全骨髓貼壁法分離兔BMSCs，貼壁能力強，增殖旺盛，體外傳代后可穩(wěn)定維持其生長特性，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMSCs可以分別向成骨、成脂和成軟骨分化，說明分離純化得到的BMSCs具有干細胞特性。本實驗在PDO的骨皮質(zhì)和骨膜之間注射自體BMSCs，Mirco-CT和組織學(xué)染色均表明新生骨的骨量、厚度和礦化程度上均明顯高于對照組，說明注射BMSCs有利于在骨膜牽張區(qū)誘導(dǎo)成骨。有研究表明，BMSCs不僅參與成骨，還可以分泌足量的VEGF促進新生血管的形成[8]。今后的研究中，我們還將進一步探索其對新生骨組織血管化的影響，以及最佳注射時間和注射頻率。

為了獲得良好的成骨效果，必須對骨膜進行穩(wěn)定且持續(xù)的牽張。傳統(tǒng)的U型牽張裝置雖然可以對骨膜進行可控牽張，及時調(diào)整牽張的速率和頻率，但對組織（特別是骨膜）損傷大，偶爾也報道有出現(xiàn)螺釘松動、鈦網(wǎng)脫離等問題[1，3，6，9-12]。本實驗在牽張裝置的設(shè)計上進行了改進，采用3D打印的PLLA支架和鈦釘進行牽張，不僅簡化了手術(shù)過程，對組織的損傷也相應(yīng)減小。PLLA是安全可靠的可降解生物材料，具有較高的生物強度，其降解速度也低于體內(nèi)骨組織發(fā)生的速度。生物可降解牽張裝置的使用既避免了二次取出帶來的諸多并發(fā)癥，也符合仿生構(gòu)建組織工程骨的理念。3D打印技術(shù)已經(jīng)在口腔頜面外科、骨科以及組織工程等領(lǐng)域用于骨缺損的修復(fù)，利用三維打印設(shè)計個性化的植入物，可通過調(diào)整支架孔隙的大小和形狀來滿足不同生物力學(xué)強度和細胞黏附等要求[13-14]。Kostopoulous等[15]探討骨膜在下頜形成中的作用時發(fā)現(xiàn)，骨膜牽張裝置應(yīng)該打孔以保持骨膜與骨皮質(zhì)間的溝通。我們利用三維打印技術(shù)定制一個既滿足牽張要求，又具有孔隙結(jié)構(gòu)的PLLA支架，在具備牽張力學(xué)強度的同時，保證骨膜與骨皮質(zhì)之間的交互作用。今后我們還將嘗試利用3D打印技術(shù)打印出不同孔隙的牽張支架，觀察牽張支架的孔隙大小對PDO的影響。

骨膜牽張成骨最初應(yīng)用于牽張萎縮的牙槽骨，以增加高度和寬度。以往的牽張裝置大多放置于下頜骨的內(nèi)外側(cè)面，但是牙槽骨間隙狹窄，手術(shù)操作困難，且牽張裝置在術(shù)后會因咀嚼而脫落。Steven等[16]利用脛骨骨膜獲得新生骨組織，與下頜骨相同的是，該方法受骨膜的面積和空間所限，再生骨量不足，難以修復(fù)大塊的骨缺損。Kessler等[17]在豬的顱骨骨膜下植入鈦網(wǎng)和螺釘，通過螺釘?shù)膭討B(tài)旋轉(zhuǎn)牽張骨膜。由于顱骨骨膜相對較厚，且面積大、易于分離，利用顱骨骨膜進行牽張在某種程度上解決了骨組織來源不足的問題，也減少了供區(qū)損傷。牽張部位的選擇決定著牽張的效果，平坦的骨質(zhì)以及強韌的骨膜會大大提高實驗的成功率。所以，為了獲得最佳的成骨效果，本實驗選擇對顱骨骨膜進行牽張。此外，牽張位置還應(yīng)盡可能離切口縫合位置要遠，以免在牽張過程中張力過大，傷口裂開，導(dǎo)致實驗失敗。

目前針對骨缺損的治療還存在著很多爭議，PDO技術(shù)已被應(yīng)用于治療萎縮的牙槽骨、腭裂等先天性疾病中，但是大多研究還主要集中在動物實驗上，很少有臨床應(yīng)用報道，主要是因為存在牽張裝置不穩(wěn)定、軟組織損傷和感染等并發(fā)癥。理論上，骨膜牽張成骨得到的新生骨可以應(yīng)用于由甲狀旁腺機能亢進、鈣代謝紊亂、佝僂病、創(chuàng)傷、感染和先天畸形或其他病理條件所造成的各個部位的骨缺損。骨膜牽張成骨技術(shù)理應(yīng)與組織工程技術(shù)及三維打印技術(shù)相結(jié)合，使用可降解材料通過打印出與骨缺損一致的牽張裝置，獲取功能性的組織工程骨，同時實現(xiàn)功能和美學(xué)上的修復(fù)。

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Research of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Combined with Three-dimensional Printed Poly L-lactic Acid for Promoting Periosteal Distraction Osteogenesis of Rabbit Skull

ZHAO Danyang1,JIANG Wenbo2,ZHANG Haifeng1,DU Chao1,DU Zijing1,HAN Dong1.1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery;2 Clinical Translational Research and Development Center of 3D Printing Technology,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:HAN Dong(E-mail:handong12000@163.com).

ObjectiveTo investigate whether bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)can promote periosteal distraction osteogenesis(PDO).MethodsBMSCs isolated from New Zealand white rabbits were cultured by the whole bone marrow adherent method and induced to differentiate into osteocytes,adipocytes and chondrocytes in vitro.Poly l-lactic acid (PLLA)scaffold produced by three-dimensional printing(3D printing)technology was used to distract the calvarial periosteum of rabbit.At the end of distraction period,BMSCs were injected into the gap between periosteum and skull in experimental group while the control group received equal normal saline(NS).The distraction parts of rabbits'skull were collected after 4 and 8 weeks of consolidation periods.The newly formed bone of both groups was evaluated by Micro-CT scanning and histological staining.ResultsBMSCs obtained by the whole bone marrow culture method had the ability of multi-directional differentiation.Micro-CT scanning showed that there were new tissues formed in the distraction area at each time point both in experimental group and control group.The bone volume(BV),bone volume/tissue volume(BV/TV), bone mineral density(BMD),trabecular number(Tb.N)and trabecular thickness(Tb.Th)in experimental group were higher than that in control group,however,the trabecular separation(Tb.Sp)in the experimental group was lower than that of the control group.HE staining also indicated new bone formation both in experimental group and control group.Compared withthe control group,the newly formed trabecular bone in the experimental group was thicker and maturer,and the boundary between the new bone and the skull cortex was not obvious.ConclusionInjection of autologous BMSCs into the PDO region of rabbit skull can supplement the deficiency of osteocytes,which is beneficial to PDO.

Bone marrow mesenchymal stem cells;Three-dimensional printing;Poly l-lactic acid; Periosteal distraction osteogenesis

Q813.1+2

A

1673－0364（2016）06－0340－07

2016年9月23日；

2016年11月14日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.06.003

國家自然科學(xué)基金項目（81272132，81571944）。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科（趙丹陽，張海峰，杜朝，杜子婧，韓冬）；3D打印技術(shù)臨床轉(zhuǎn)化研發(fā)中心（姜聞博）。

韓冬（E-mail：handong12000@163.com）。