金納米團(tuán)簇標(biāo)記PLGA支架的研究

王祥盛 王賢松 張智勇 周廣東 劉 偉 曹誼林 張文杰

·論著·

金納米團(tuán)簇標(biāo)記PLGA支架的研究

王祥盛 王賢松 張智勇 周廣東 劉 偉 曹誼林 張文杰

目的探討金納米團(tuán)簇用于示蹤可降解高分子支架的可行性，為非侵入成像方式監(jiān)測(cè)體內(nèi)組織工程支架降解提供方法和思路。方法用氯金酸和牛血清白蛋白（BSA）為原料合成金納米團(tuán)簇（Au Nanoclusters，AuNCs），進(jìn)行相關(guān)表征及細(xì)胞毒性檢測(cè)。以AuNCs標(biāo)記聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA），制備AuNCs/PLGA支架，掃描電鏡檢測(cè)支架表面結(jié)構(gòu)，熒光及CT掃描檢測(cè)支架特性。將支架植入裸鼠皮下，應(yīng)用熒光成像及Micro-CT掃描，以觀測(cè)支架在體內(nèi)的情況。結(jié)果合成的AuNCs具有熒光特性，無細(xì)胞毒性；納米團(tuán)簇標(biāo)記的PLGA支架保持熒光特性，同時(shí)在CT掃描中可顯影；AuNCs/PLGA支架可以在裸鼠皮下通過熒光成像及Micro-CT掃描來示蹤。結(jié)論AuNCs可作為組織工程支架的示蹤劑，為非侵入成像方式監(jiān)測(cè)體內(nèi)高分子組織工程支架降解情況提供可能。

金納米團(tuán)簇支架材料非侵入成像

理想的組織工程支架材料的重要特征之一，是具有與組織形成相匹配的降解速率[1]。因此，無創(chuàng)且動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)支架材料的降解是一個(gè)亟待解決的難題。非侵入成像技術(shù)（Non-invasive Imaging Technology，NIR）包括CT、MRI和熒光光學(xué)成像等技術(shù)，為無創(chuàng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)體內(nèi)組織工程支架材料的降解提供了可能性。然而，生物大分子和高分子聚合物等組織工程支架常用材料，無法采用上述方法成像或顯影。因此，需要開發(fā)一種能長期標(biāo)記支架材料的“造影劑”，用于非侵入成像技術(shù)，以此來達(dá)到無創(chuàng)監(jiān)測(cè)體內(nèi)組織工程支架降解的目的。

金納米團(tuán)簇（Au Nanoclusters，AuNCs）是一種新型的熒光納米材料，生物毒性小，具有穩(wěn)定的激發(fā)熒光，和良好的X線衰減效應(yīng)[2]。本實(shí)驗(yàn)中，我們利用牛血清白蛋白（BSA）和氯金酸（HAuCl4）為原料，合成BSA包裹的金納米團(tuán)簇，驗(yàn)證其光學(xué)特性和生物毒性，并用該團(tuán)簇標(biāo)記組織工程常用的高分子材料聚乳酸-羥基乙酸共聚物（Poly lactic-co-glycolic acid，PLGA），利用熒光成像和CT掃描等方式，監(jiān)測(cè)該支架在動(dòng)物體內(nèi)的情況，探討利用金納米團(tuán)簇來示蹤組織工程支架的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

主要試劑：氯金酸（HAuCl·43H2O，99%）、牛血清白蛋白（BSA）、1.4-二氧六環(huán)（國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司）；PLGA（50∶50，Mw 38 000～54 000）（Sigma，美國）。

主要儀器：Micro-CT（Scanco Medical，美國）；小動(dòng)物成像儀（PerkinElmer，美國）；掃描電鏡（Phenom，荷蘭）；紫外分光光度計(jì)（Beckman，美國）；酶標(biāo)光度計(jì)（Thermo，美國）。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6周齡BALB/c裸鼠6只（本院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）。

1.2 金納米團(tuán)簇的合成與表征

1.2.1 金納米團(tuán)簇的合成

在攪拌條件下，將BSA溶液（10 mL，25 mg/mL）加入到氯金酸溶液（10 mL，10 mM）中，加入NaOH溶液（1 mL，1 mol/L），繼續(xù)攪拌1 h后停止，然后使混合溶液在37℃溫度下孵育12 h，即可得到穩(wěn)定的金納米團(tuán)簇溶液。

1.2.2 金納米團(tuán)簇的表征

以高分辨率透射電鏡觀察合成的金納米團(tuán)簇粒子的形貌及粒子大小。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定金納米團(tuán)簇的吸收光譜，其光譜測(cè)量范圍為400～700 nm。用酶標(biāo)光度計(jì)測(cè)其在440 nm激發(fā)光下的熒光發(fā)射光譜。高分辨率掃描電鏡測(cè)其粒子的形貌。

1.2.3 金納米團(tuán)簇的毒性測(cè)定

利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系（HUVEC，來源于本實(shí)驗(yàn)室）檢測(cè)金納米團(tuán)簇的細(xì)胞毒性。將HUVEC以10 000個(gè)/孔的密度均勻接種于iCELLigence實(shí)時(shí)細(xì)胞檢測(cè)儀的培養(yǎng)板里，實(shí)驗(yàn)組中加入1 000 nM的金納米團(tuán)簇溶液，對(duì)照組中加入同量的PBS溶液。細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)第1、2、3、4、5天的細(xì)胞的指數(shù)。

1.3 支架制備與表征

將合成好的金納米團(tuán)簇凍干制成粉末，取20 mg加入到1 mL的1.4-二氧六環(huán)中，經(jīng)超聲震蕩使其充分分散，再加入100 mg的PLGA，攪拌2 h。經(jīng)凍干成型后得到多孔的AuNCs/PLGA支架。同樣通過冷凍干燥法制備單純的PLGA支架。將兩種材料制備成直徑10 mm，厚2 mm的圓片。60Co消毒備用。將上述方法制備得到的兩種支架噴金鍍膜，掃描電鏡下觀察。利用365 nm便攜式紫外燈照射兩種支架，檢測(cè)其熒光情況，同時(shí)用Micro-CT來掃描兩種支架，觀察在CT中的顯影情況，并測(cè)量CT值。

1.4 支架植入裸鼠皮下

腹腔麻醉后，在裸鼠后背正中近尾端處作1 cm長的直線切口，并鈍性分離皮膚與皮下組織，將消毒好的AuNCs/PLGA支架植入左側(cè)，單純的PLGA支架植入右側(cè)。術(shù)后切口處涂抹紅霉素軟膏預(yù)防感染。共植入6只裸鼠。

1.5 熒光成像和Micro-CT掃描

支架植入后第三天，將裸鼠吸入麻醉后置入小動(dòng)物成像儀中，檢測(cè)皮下支架的熒光情況，并熒光成像拍照和測(cè)算其熒光強(qiáng)度。以此時(shí)間點(diǎn)為第一周，此后每周同一時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)支架的熒光情況，連續(xù)監(jiān)測(cè)5周。分別記錄每周支架的熒光成像結(jié)果和熒光強(qiáng)度數(shù)值。制作熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的曲線。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)及方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金納米團(tuán)簇的合成和表征

金納米團(tuán)簇在正常光下呈棕黃色，365 nm便攜式紫外光照下呈現(xiàn)紅色熒光。透射電鏡結(jié)果顯示，合成的金納米團(tuán)簇顆粒呈大小分布均勻的球狀粒子，平均粒徑約為3 nm，這與相關(guān)報(bào)道基本一致[3]。金納米團(tuán)簇在400～700 nm的吸收光譜和在激發(fā)光為440 nm下的熒光光譜顯示，該納米團(tuán)簇在520 nm處呈特征吸收峰；當(dāng)以440 nm為激發(fā)波長時(shí)，可發(fā)現(xiàn)金納米團(tuán)簇的發(fā)射波峰位于700 nm附近，符合紅色熒光的波長范圍（圖1）。

2.2 金納米團(tuán)簇的細(xì)胞毒性

第1～5天實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞指數(shù)顯示，金納米團(tuán)簇溶液（實(shí)驗(yàn)組）中HUVEC的細(xì)胞指數(shù)分別是PBS溶液（對(duì)照組）的99.8%、102.0%、104.5%、105.9%和105.4%，平均相對(duì)增殖率是103.5%，其中第2～4天，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異明顯（P＜0.05），第1和5天，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無顯著差異（P＞0.05）。依據(jù)細(xì)胞相對(duì)增殖率與細(xì)胞毒性分級(jí)關(guān)系，金納米團(tuán)簇溶液在第1、2、3、4、5天的細(xì)胞毒性分別是I級(jí)、0級(jí)、0級(jí)、0級(jí)和0級(jí)，說明金納米團(tuán)簇對(duì)細(xì)胞無毒性（圖2）。

2.3 支架制備和表征

通過冷凍干燥法制備AuNCs/PLGA和單純的PLGA支架，均為圓盤狀，直徑10 mm，厚度2 mm，其中AuNCs/PLGA支架外觀呈淡粉色，而單純PLGA支架外觀呈白色。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，兩種支架的孔徑都在50 μm左右，孔隙分布不均勻。用激發(fā)波長為365 nm的紫外光照射兩種支架，可以發(fā)現(xiàn)單純PLGA呈現(xiàn)紫藍(lán)色，無激發(fā)熒光；而AuNCs/ PLGA支架則呈較為均勻的紅色熒光。Micro-CT掃描兩種支架，可以發(fā)現(xiàn)單純PLGA支架基本不顯影，而AuNCs/PLGA支架則為均勻的高密度影；AuNCs/ PLGA支架的CT值為200 HU，高于軟組織（20～50 HU）或內(nèi)臟器官（40～100 HU）（圖3）。

2.4 熒光和CT雙模式成像結(jié)果

分別在同一只裸鼠的皮下植入兩種支架，單純PLGA支架植入右側(cè)，AuNCs/PLGA支架植入左側(cè)。應(yīng)用小動(dòng)物成像儀檢測(cè)材料熒光情況，可以看到全部6只裸鼠的AuNCs/PLGA支架可有明顯的熒光成像，而單純PLGA支架無熒光成像。Micro-CT掃描重建可見AuNCs/PLGA支架顯影清晰，與周圍軟組織區(qū)分明顯，而單純PLGA支架基本不能顯影，無法和周圍軟組織鑒別。通過三維重建，可以看到AuNCs/PLGA支架的精確三維結(jié)構(gòu)。這表明通過標(biāo)記金納米團(tuán)簇于PLGA支架上，不僅可以通過熒光強(qiáng)度來監(jiān)測(cè)材料的狀態(tài)，還能通過CT成像了解支架在體內(nèi)的三維結(jié)構(gòu)和形態(tài)變化（圖4）。

圖1 金納米團(tuán)簇的表征Fig.1Characterization of AuNCs

圖2 HUVEC在AuNCs作用下的生長曲線Fig.2The growth curves of HUVEC coincubation with AuNCs in the cell medium

圖3 單純PLGA支架和AuNCs/PLGA支架大體觀及表征Fig.3Gross observation and Characterization of PLGA and AuNCs/PLGA scaffolds

圖4 體內(nèi)支架熒光變化（5周）Fig.4 Fluorescence change of scaffold in vivo within 5 weeks

3 討論

傳統(tǒng)組織工程支架降解的研究通常采用組織切片染色法，以確定支架材料的降解和組織再生情況，無法實(shí)現(xiàn)同一動(dòng)物體內(nèi)的連續(xù)觀察，且不適用于臨床研究。目前，快速發(fā)展的非侵入成像技術(shù)（Noninvasive Imaging Technology，NIR），包括CT、MRI和熒光光學(xué)成像技術(shù)[3]，為動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)體內(nèi)組織工程支架材料降解提供了可能。然而，生物大分子或高分子聚合物等組織工程支架材料，無法采用上述方法成像或顯影。Natalie等[4]通過有機(jī)熒光染料標(biāo)記可降解支架材料聚乙二醇（PEG），并在大鼠模型上成功實(shí)現(xiàn)熒光光學(xué)成像。但是，有機(jī)染料在生物體內(nèi)長時(shí)間應(yīng)用過程中，存在熒光信號(hào)不穩(wěn)定，甚至淬滅等問題，不適合作為體內(nèi)長期研究的熒光探針，因而限制了熒光成像技術(shù)在支架材料研究領(lǐng)域的應(yīng)用[5-6]。Kim等[7]通過兩性離子近紅外熒光納米分子探針，標(biāo)記膠原支架，并對(duì)其進(jìn)行了長時(shí)間小鼠體內(nèi)近紅外熒光成像。結(jié)果表明，熒光成像可以實(shí)時(shí)示蹤膠原支架在體內(nèi)代謝的動(dòng)態(tài)過程。然而熒光分子探針和熒光成像系統(tǒng)雖然能對(duì)支架材料的降解情況在細(xì)胞、分子水平上進(jìn)行示蹤，具有很高的靈敏度，但是只能平面成像，無法獲得活體三維結(jié)構(gòu)。同時(shí)，熒光探針在代謝時(shí)有可能被周圍細(xì)胞吸收，從而進(jìn)入新生組織中，熒光殘留其中時(shí)，無法區(qū)分新生組織的殘留熒光和原支架材料熒光。而Micro-CT成像技術(shù)剛好可以解決熒光成像的不足，與熒光成像技術(shù)構(gòu)成互補(bǔ)，能彌補(bǔ)熒光成像無法獲取的支架材料三維空間結(jié)構(gòu)信息。Micro-CT成像具有較高的時(shí)間和空間分辨率，安全可靠。更為重要的是，Micro-CT能區(qū)分新生組織里的殘留熒光和原支架材料熒光。如果生物體內(nèi)的支架材料能夠同時(shí)進(jìn)行熒光成像和Micro-CT雙模式成像，則可以順利對(duì)支架材料的降解和組織再生進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。然而，Micro-CT成像對(duì)密度低的高分子材料或聚合物等成像效果差，與組織之間無法區(qū)分，甚至不能成像。因此，開發(fā)“支架材料造影劑”，使其具有熒光成像特性，且能提高M(jìn)icro-CT材料三維空間上的分辨率具有重要意義。

金納米團(tuán)簇是一種新型的熒光納米材料，是在分子層保護(hù)下，由幾個(gè)到幾百個(gè)金原子組成的相對(duì)穩(wěn)定的聚集體，相比小分子熒光染料和量子點(diǎn)，金納米團(tuán)簇具有毒性低、表面易于修飾、熒光穩(wěn)定性強(qiáng)且可調(diào)、Stokes位移大等優(yōu)點(diǎn)[8]。同時(shí)，由于金元素比碘元素具有更高的原子序數(shù)和X線衰減特性，故在X線成像中具有更高的增強(qiáng)效應(yīng)[9]。金納米團(tuán)簇在小動(dòng)物血管造影和腫瘤成像中都具有良好的成像效果[10]。

本實(shí)驗(yàn)中，我們利用無細(xì)胞毒性的牛血清白蛋白作為包裹分子，來合成金納米團(tuán)簇，同時(shí)我們選用目前廣泛使用的、非侵入成像技術(shù)無法顯影和監(jiān)測(cè)的支架材料PLGA作為研究對(duì)象[11]。我們發(fā)現(xiàn)，合成的金納米團(tuán)簇，具有強(qiáng)烈的紅色激發(fā)熒光。紅色熒光具有波長較長、易于穿透生物體、能避免生物體內(nèi)自發(fā)熒光干擾的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，金納米團(tuán)簇能明顯提高PLGA的密度，在CT掃描下具有良好的成像效果，能與周圍軟組織明顯區(qū)分。本實(shí)驗(yàn)中合成的金納米團(tuán)簇?zé)o細(xì)胞毒性，可用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為金納米團(tuán)簇可作為標(biāo)記支架材料的特殊“造影劑”，結(jié)合近紅外熒光和Micro-CT雙模式成像，可建立無創(chuàng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)體內(nèi)支架材料降解的模型。

我們認(rèn)為，金納米團(tuán)簇可以監(jiān)測(cè)支架的降解，隨著支架材料在體內(nèi)的降解，解體的材料單體和熒光納米探針將被釋放和清除，修復(fù)區(qū)域的熒光會(huì)越來越弱，密度也會(huì)逐漸降低，直至支架完全降解而消失，此時(shí)降解區(qū)會(huì)形成熒光空洞，并且通過CT掃描后的三維重建，可以看到具體形態(tài)的變化。

雖然在本實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)驗(yàn)證了合成的金納米團(tuán)簇可以標(biāo)記組織工程支架，并且能通過熒光成像和CT掃描的方式檢測(cè)其在體內(nèi)的情況，然而在實(shí)際的降解過程中，熒光強(qiáng)度的變化、CT成像的變化是否與支架降解的實(shí)際情況相一致，即該方法的精確度，還需通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來加以驗(yàn)證。

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Labeling PLGA Scaffold with Gold Nanoclusters

WANG Xiangsheng,WANG Xiansong,ZHANG Zhiyong,ZHOU Guangdong,LIU Wei,CAO Yilin,ZHANG Wenjie.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering, Shanghai 200011,China;National Tissue Engineering Center of China,Shanghai 200240,China.Corresponding author: ZHANG Wenjie(E-mail:wenjieboshi@aliyun.com).

ObjectiveTo explore the feasibility of using Au nanoclusters(AuNCs)to label the tissue engineering scaffold which degradation could be further monitored by noninvasive approach in vivo.MethodsChlorauric acid and bovine serum albumin(BSA)were used to synthesize AuNCs.The nanoclusters were characterized and their cytotoxicity was evaluated. AuNCs were then mixed with poly lactic-co-glycolic acid(PLGA)to fabricate AuNCs/PLGA scaffold.The scaffolds were implanted subcutaneously in nude mice.Fluorescence imaging and CT scanning were performed to detect the scaffolds in vivo.ResultsSynthesized AuNCs possess fluorescence without cytotoxicity.The AuNCs labeled PLGA scaffolds were detected by fluorescence imaging and CT scanning in vitro.The scaffolds were detected by these two noninvasive methods after being implanted in nude mice.ConclusionAuNCs could be potentially used for labeling polymer scaffold,which degradation could be possibly monitored by non-invasive imaging technology.

Au nanoclusters;Scaffold;Non-invasive imaging

Q813.1+2

A

1673－0364（2016）06－0331－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.06.001

國家自然科學(xué)基金（81271714，31170944）；上海市科委基礎(chǔ)重點(diǎn)研究項(xiàng)目（15JC1490600）。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科，上海市組織工程研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；200240上海市組織工程國家工程中心。

張文杰（E-mail：wenjieboshi@aliyun.com）。