TNF-α和IL-6在鼻咽血管纖維瘤中的表達(dá)及意義

吳賢敏，葉凡，武鵬，陳曉云，林昶，廖志蘇

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 耳鼻咽喉-頭頸外科，浙江 溫州 325015；2．福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 耳鼻咽喉-頭頸外科，福建 福州 350004）

?論 著?

TNF-α和IL-6在鼻咽血管纖維瘤中的表達(dá)及意義

吳賢敏1，葉凡1，武鵬1，陳曉云1，林昶2，廖志蘇1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 耳鼻咽喉-頭頸外科，浙江 溫州 325015；2．福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 耳鼻咽喉-頭頸外科，福建 福州 350004）

目的：檢測(cè)腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）在鼻咽血管纖維瘤（JNA）中的表達(dá)水平，并探討TNF-α和IL-6在JNA骨質(zhì)破壞機(jī)制中的作用。方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)TNF-α和IL-6在20例JNA患者和10例正常下鼻甲組織中的表達(dá)。結(jié)果：TNF-α和IL-6蛋白在JNA中的陽(yáng)性表達(dá)率均為90.0%，明顯高于TNF-α和IL-6蛋白在下鼻甲組織中的陽(yáng)性表達(dá)率（均為20.0%）（均P＜0.01）。TNF-α和IL-6蛋白的表達(dá)與JNA臨床分期無(wú)關(guān)（均P＞0.05）。結(jié)論：TNF-α和IL-6在JNA組織中表達(dá)增高，可能是參與JNA骨質(zhì)破壞的影響因素。

腫瘤壞死因子α；白細(xì)胞介素-6；鼻咽血管纖維瘤

鼻咽血管纖維瘤（juvenile nasopharyngeal angiofibroma，JNA）為鼻咽部最常見(jiàn)的良性腫瘤，與一般纖維瘤不同，它由致密結(jié)締組織、大量的彈性纖維及血管組成，常發(fā)生于10～25歲的青年男性，又稱(chēng)“男性青春期出血性JNA”。Liang等[1]研究發(fā)現(xiàn)其本質(zhì)是血管錯(cuò)構(gòu)瘤。雖然JNA是良性腫瘤，但其向鄰近組織擴(kuò)張生長(zhǎng)，破壞周?chē)琴|(zhì)，可引起嚴(yán)重的并發(fā)癥。JNA的骨質(zhì)破壞機(jī)制尚未明確。最近在研究病理性骨質(zhì)破壞性疾病中發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）與中耳膽脂瘤骨

質(zhì)破壞密切相關(guān)[2-3]。JNA與膽脂瘤在骨質(zhì)破壞過(guò)程中有許多相似之處，雖然它們都是良性腫瘤，但都會(huì)破壞周?chē)琴|(zhì)向鄰近組織擴(kuò)張性生長(zhǎng)。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)JNA組織中TNF-α和IL-6的表達(dá)情況，探討其在JNA骨質(zhì)破壞機(jī)制中的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 20例JNA標(biāo)本來(lái)自2000至2012年福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，福建省耳鼻喉研究所石蠟包埋存檔蠟塊。JNA組：JNA患者標(biāo)本共20例，術(shù)后病理診斷均為JNA，患者年齡范圍11～35歲，平均18.5歲，其中男20例，女0例。對(duì)照組10例下鼻甲組織術(shù)后診斷為下鼻甲慢性炎癥，患者年齡范圍18～40歲，平均25.0歲，其中男5例，女5例。標(biāo)本來(lái)自2015年3月至6月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，在內(nèi)窺鏡下取鼻中隔偏曲伴下鼻甲肥大患者的下鼻甲組織。標(biāo)本都是24 h內(nèi)取材，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 所用一抗?jié)舛染鶠?∶100，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，步驟如下：①烤片，60 ℃，20 min；②常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水；二甲苯I 20 min，二甲苯I I 20 min，100%乙醇I 10 min，100%乙醇I I 10 min，95%乙醇5 min，80%乙醇5 min，70%乙醇5 min；③阻斷滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：3% H2O237 ℃孵育10 min，PBS沖洗3×5 min；④抗原修復(fù)：置0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液（pH=6.0）中煮沸（95 ℃，15～20 min），自然冷卻20 min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫，PBS沖洗3×5 min；⑤正常羊血清工作液封閉，37 ℃ 10 min，傾去勿洗；⑥滴加一抗4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，PBS沖洗3×5 min（用PBS代替一抗作陰性對(duì)照）；滴加生物素標(biāo)記二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3×5 min；⑦滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3×5 min；⑧DAB/H2O2反應(yīng)染色，自來(lái)水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性片做陽(yáng)性對(duì)照。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷[4]：TNF-α和IL-6的陽(yáng)性染色者細(xì)胞胞漿有棕黃色顆粒沉著；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：0分為無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞，1分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜25%，2分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占25%～50%，3分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占51%～75%，4分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞75%；染色強(qiáng)度：0分為無(wú)染色，1分為弱染色，2分為中等強(qiáng)度染色，3分為強(qiáng)染色。計(jì)算各抗體的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度得分，以3～7分為陽(yáng)性。兔抗人TNF-α多克隆抗體和兔抗人IL-6多克隆抗體均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，TNF-α和IL-6的陽(yáng)性表達(dá)率比較采用x2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α和IL-6在2組中的表達(dá) TNF-α和IL-6的陽(yáng)性表達(dá)顆粒主要位于JNA血管壁內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)成纖維細(xì)胞的胞漿中，呈棕黃色。TNF-α和IL-6在下鼻甲組織中呈弱表達(dá)或無(wú)表達(dá)，弱表達(dá)顆粒主要位于成纖維細(xì)胞胞漿、血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿和漿液性腺體中，著色強(qiáng)度不一，見(jiàn)圖1。分別對(duì)JNA組和下鼻甲組的TNF-α和IL-6陽(yáng)性表達(dá)率進(jìn)行比較，JNA組中的IL-6、TNF-α表達(dá)水平明顯高于下鼻甲組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。見(jiàn)表1。

圖1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×400）

表1 TNF-α和IL-6在2組中的表達(dá)（例）

2.2 TNF-α和IL-6在JNA中不同臨床分期中的表達(dá) TNF-α和IL-6在JNA不同臨床分期中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

3 討論

TNF-α具有廣泛生物學(xué)活性。TNF-α不僅有抗腫瘤、抗病毒、誘發(fā)炎癥反應(yīng)等作用，還能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能，在骨重建中也發(fā)揮重要作用。Wise 等[5]研究發(fā)現(xiàn)TNF-α是一種強(qiáng)有力的骨吸收誘導(dǎo)劑，調(diào)控破骨細(xì)胞的分化及其生物學(xué)活性。Nanes等[6]研究發(fā)現(xiàn)TNF-α具有抑制骨形成，促進(jìn)骨吸收的作用，TNF-α還可間接作用于破骨細(xì)胞分化所必需的下游細(xì)胞因子，如集落刺激因子-1、IL-6，促進(jìn)破骨祖細(xì)胞的增殖，抑制成骨細(xì)胞的功能。Kubota等[7]研究顯示TNF-α對(duì)核因子-κB受體活化因子配體（nuclear factor-kappa B ligand，RANKL）和護(hù)骨素（osteoprotegerin，OPG）的表達(dá)有調(diào)節(jié)作用。有研究[8]證明TNF-α刺激骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)RANKL，結(jié)合破骨細(xì)胞前體或破骨細(xì)胞表面的核因子-κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factorkappa B，RANK）后引起破骨細(xì)胞分化和活化，抑制骨形成和鈣化，進(jìn)而影響骨代謝。有研究[9]發(fā)現(xiàn)TNF-α和RANKL可以相互作用，增強(qiáng)人破骨細(xì)胞活性。TNF-α促進(jìn)破骨細(xì)胞的活性，特別是在炎癥狀態(tài)骨溶解中如牙周炎，促進(jìn)牙槽骨破壞[10]。有研究[11]顯示在一些伴有骨質(zhì)破壞的炎性關(guān)節(jié)疾病如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和發(fā)生骨質(zhì)溶解的患者假體周?chē)M織及關(guān)節(jié)液中TNF-α水平均升高。Vitale等[12]在膽脂瘤研究中發(fā)現(xiàn)TNF-α的表達(dá)增高，而且TNF-α的表達(dá)量與膽脂瘤骨質(zhì)破壞相關(guān)。

表2 TNF-α和IL-6在不同臨床分期中的表達(dá)（例）

IL-6是細(xì)胞因子的核心成員之一，在機(jī)體的防御機(jī)制中起著不可忽視的作用。它由活化的T細(xì)胞、單核巨嗜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及成骨細(xì)胞等產(chǎn)生并作用于多種效應(yīng)細(xì)胞，因此具有廣泛的生物學(xué)活性。IL-6也是破骨細(xì)胞主要的調(diào)節(jié)因子之一。首先，它可誘導(dǎo)骨髓單個(gè)核細(xì)胞和成骨細(xì)胞產(chǎn)生RANKL，在生理?xiàng)l件下，這些細(xì)胞中IL-6受體的表達(dá)水平較低，但在可溶性IL-6受體（SIL-6R）及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子-3（STAT-3）被激活的情況下，可引起RANKL的表達(dá)[13-16]。RANKL與其受體RANK結(jié)合后激活NF-κB、ERK1/2和p38/MAP激酶，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的成熟及其相關(guān)受體的表達(dá)[17-18]，增加破骨細(xì)胞的活性，進(jìn)而引起骨丟失。其次，IL-6還能誘導(dǎo)一些不依賴(lài)于RANKL的促破骨細(xì)胞合成因子如IL-lB的生成。研究發(fā)現(xiàn)IL-lB能增加NF-κB的生成，從而影響骨代謝，而NF-κB又可反過(guò)來(lái)促進(jìn)IL-6的釋放，進(jìn)一步使IL-6生成增加[19-20]。已有研究[21]發(fā)現(xiàn)IL-6在中耳膽脂瘤中表達(dá)增高，而且表達(dá)量與聽(tīng)骨鏈的破壞顯著相關(guān)。也有研究[22]證明IL-6可直接激活破骨細(xì)胞分化而產(chǎn)生骨質(zhì)降解效應(yīng)。有研究[23]報(bào)道TNF-α和IL-6在COPD患者血清中表達(dá)增高，而且它們的表達(dá)與骨吸收指標(biāo)呈正相關(guān)。Murakami等[24]研究發(fā)現(xiàn)IL-6誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化和活性，Tocilizumab（TCZ）-人源化抗IL-6受體抗體，抑制IL-6信號(hào)，對(duì)骨和軟骨的破壞有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在JNA中TNF-α和IL-6蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均為90.0%，明顯高于它們?cè)谡Ｏ卤羌捉M織中均為20.0%的陽(yáng)性表達(dá)率，二者間差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TNF-α和IL-6在鼻咽血管纖維瘤中不同臨床分期中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），我們認(rèn)為T(mén)NF-α和IL-6蛋白與鼻咽血管纖維瘤的擴(kuò)張性生長(zhǎng)無(wú)顯著相關(guān)。TNF-α和IL-6在JNA組織中表達(dá)增高，IL-6是破骨細(xì)胞分化所必需的下游細(xì)胞因子，本研究推測(cè)TNF-α間接作用于IL-6，刺激破骨細(xì)胞增殖，使成骨細(xì)胞的功能受到抑制，使成骨細(xì)胞堿性磷酸酶的活性降低，參與骨質(zhì)破壞。IL-6可能誘導(dǎo)RANKL與RANK結(jié)合，進(jìn)而激活NF-κB、ERK1/2和p38/MAP激酶，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的成熟及其相關(guān)受體的表達(dá)，增加破骨細(xì)胞的活性，引起骨丟失。TNF-α和IL-6可能是參與JNA骨質(zhì)破壞的影響因素，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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（本文編輯：趙翠翠）

Expression and signifi cance of tumor necrosis factor-alpha and interleukin-6 in juvenile nasopharyngeal angiofi broma

WU Xianmin1, YE Fan1, WU Peng1, CHEN Xiaoyun1, LIN Chang2, LIAO Zhisu1.
1.Department of Otorhinolaryngology and Head and Neck Surgery, the First Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Otorhinolaryngology and Head and Neck Surgery, the First Affi liated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou, 350004

Objective: To detect the expression of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) in nasopharyngeal angiofi broma (JNA) and to explore the role of TNF-α and IL-6 in the mechnism of the bone destruction in JNA.Methods: The expressions of TNF-α and IL-6 in JNA tissue of 20 patients and normal inferior turbinate tissues in 10 cases of persons were determined by SP method of immunohistochemistry.Results: The positive expression rates of TNF-α and IL-6 proteins in JNA both were 90.0%, signifi cantly higher than those in inferior turbinate tissues which both were 20.0% (P＜0.01).The expressions of TNF-α and IL-6 protein were no correlation with the clinical stage of JNA (P＞0.05).Conclusion: The higher expressions of TNF-α and IL-6 in JNA tissues may be the infl uence factors involved in bone destruction of the JNA.

tumor necrosis factor-alpha; interleukin-6; juvenile nasopharyngeal angiofi broma

R739.63

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2016.12.007

2016-04-09

溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20140596）。

吳賢敏（1982-），男，浙江溫州人，主治醫(yī)師，碩士。