靶向熱休克蛋白-27基因沉默對5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制

黃崇杰，劉長寶，胡萬樂，蔡錨

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 肛腸外科，浙江 溫州 325027）

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靶向熱休克蛋白-27基因沉默對5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制

黃崇杰，劉長寶，胡萬樂，蔡錨

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 肛腸外科，浙江 溫州 325027）

目的：通過RNA干擾抑制熱休克蛋白-27（HSP27）基因的表達(dá)，探討沉默該基因?qū)?-氟尿嘧啶（5-FU）誘導(dǎo)大腸癌SW480細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制。方法：將細(xì)胞分為正常對照組（Normal組）、陰性siRNA轉(zhuǎn)染組（NC組）、HSP27-siRNA轉(zhuǎn)染組（siRNA組）、單純5-FU組（5-FU組）、5-FU+陰性siRNA轉(zhuǎn)染組（NC+5-FU組）、5-FU+HSP27-siRNA轉(zhuǎn)染組（siRNA+5-FU組），通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將HSP27-siRNA導(dǎo)入SW480細(xì)胞，CCK-8法檢測靶向HSP27的siRNA和5-FU對SW480細(xì)胞增殖的抑制作用，流式細(xì)胞技術(shù)觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在5-FU作用下的早期凋亡情況，Western blot方法檢測凋亡相關(guān)蛋白Active-casepase-3、Active-caspase-9及細(xì)胞色素C（Cytc）的表達(dá)。結(jié)果：CCK-8法檢測結(jié)果顯示siRNA+5-FU組細(xì)胞增殖抑制率明顯高于同期siRNA組和5-FU組，表明聯(lián)合應(yīng)用抑制率明顯升高（P＜0.05）。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明siRNA組和5-FU組均可誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡，兩者聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞早期凋亡率明顯升高，與Normal組及NC組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；Western blot檢測結(jié)果顯示siRNA+5-FU組Active-casepase-3、Active-caspase-9、Cytc蛋白相對表達(dá)水平均高于siRNA組和5-FU組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論：靶向HSP27-siRNA能有效抑制大腸癌SW480細(xì)胞HSP27蛋白的表達(dá)，上調(diào)Active-casepase-3、Active-caspase-9、Cytc蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)5-FU誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對5-FU的耐藥。

結(jié)直腸腫瘤；熱休克蛋白-27；RNA干擾；5-氟尿嘧啶；細(xì)胞凋亡

近年來，大腸癌發(fā)病率和病死率不斷攀升，已經(jīng)嚴(yán)重威脅了人類的健康。對于中晚期患者，指南上推薦以5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）為基礎(chǔ)的輔助化療可提高部分患者的生存期，然而腫瘤細(xì)胞耐藥是化療失敗并導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)的原因之一。目前大量研究表明許多因素可影響5-FU化療的敏感性，包括藥物的藥代動(dòng)力學(xué)、藥物的靶點(diǎn)發(fā)生變化、DNA損傷修復(fù)和凋亡抑制因子高表達(dá)等[1]，但其中確切的耐藥機(jī)制仍不明確。本課題組前期研究顯示大腸癌細(xì)胞株中SW480細(xì)胞株熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）27基因呈高表達(dá)，且表達(dá)水平與5-FU的敏感性呈負(fù)相關(guān)性；HSP27-siRNA可以通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)成功高效轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞并抑制HSP27表達(dá)[2]。所以本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步選擇SW480細(xì)胞株做為研究對象，通過RNA干擾技術(shù)抑制HSP27基因的表達(dá)，探討沉默該基因后對5-FU誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制，從而為大腸癌基因治療及逆轉(zhuǎn)化療藥物耐藥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株及主要材料 人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞購自中科院上海分院，我院實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存；5-FU干粉劑購自德國默克公司；RP-MI1640培養(yǎng)基、優(yōu)化培養(yǎng)基OPTI-MEMI、0.05%的胰酶購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；HSP27-siRNA由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；β-actin鼠抗人抗體、兔抗人HSP27抗體、兔抗人Active-caspase-3抗體、兔抗人Active-caspase-9抗體、兔抗人細(xì)胞色素C （Cytc）抗體購自英國Abcam公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司；CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自中國南京凱基生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，飽和濕度、37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至70%～90%的融合狀態(tài)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 藥物配制：將10 mg的5-FU干粉劑溶于1 mL 的37 ℃ PBS溶液中，配制成104μg/mL的母液，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；用不含血清的培養(yǎng)基稀釋母液，配制成終濃度為80 μg/mL的5-FU化療藥用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 siRNA的合成制備和細(xì)胞轉(zhuǎn)染：HSP27-siRNA由上海吉瑪制藥有限公司設(shè)計(jì)合成，陰性對照siRNA為上海吉瑪制藥有限公司提供的通用陰性對照siRNA。按照吉瑪公司提供的siRNA使用說明書及實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)進(jìn)行，先將HSP27-siRNA及陰性對照siRNA分別溶解于RNase-free ddH2O中，配成濃度為20 μmoL/L的母液，分裝于小EP管中，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?xì)胞轉(zhuǎn)染過程按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行[2]。

1.2.4 CCK-8法檢測靶向HSP27的siRNA聯(lián)合5-FU 對SW480細(xì)胞增殖的抑制作用：將SW480細(xì)胞接種于96孔板，分為正常對照組（Normal）、陰性siRNA轉(zhuǎn)染組（NC）、HSP27-siRNA轉(zhuǎn)染組（siRNA）、單純5-FU組（5-FU）、5-FU+陰性siRNA轉(zhuǎn)染組（NC+5-FU）、5-FU+HSP27-siRNA轉(zhuǎn)染組（siRNA+5-FU），每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后6 h換液，Normal組、NC組、siRNA組換為含10%胎牛血清RPM1 1640培養(yǎng)液，5-FU組、siRNA+5-FU組、NC+5-FU組換為終濃度為80 μg/mL 的5-FU含藥培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，每孔加入CCK-8試劑10 μL，培養(yǎng)1 h后用酶標(biāo)儀于450 nm波長測吸光度值（OD），以Normal組為參照組，細(xì)胞存活率為100%，計(jì)算抑制率（IR），細(xì)胞IR（%）=[1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對照組OD值）/（正常對照組OD值-空白對照組OD值）]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 靶向HSP27基因沉默對5-FU誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制：將SW480細(xì)胞接種于6孔板，分為Normal、NC、siRNA、5-FU、NC+5-FU和siRNA+5-FU處理組，轉(zhuǎn)染組按前述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后棄上清液，5-FU組加入終濃度為80 μg/mL的5-FU的含藥培養(yǎng)基，其余各組加入等量同種培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測早期凋亡和Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞早期凋亡：經(jīng)藥物處理24 h后，用不含EDTA的胰酶消化收集上述各處理組細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，離心棄上清液用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)1×105個(gè)細(xì)胞。按照Annexin V-FITC凋亡試劑盒說明書，對細(xì)胞進(jìn)行Annexin VFITC和碘化丙啶（propidiumiodide，PI）染色。避光10 min，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm），每份標(biāo)本收集10 000個(gè)細(xì)胞，Annexin V單陽性為早期凋亡細(xì)胞，分析軟件Cell Quest計(jì)算細(xì)胞早期凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 Western blot檢測Active-casepase-3、Ac-tive-casepase-9、Cytc蛋白表達(dá)：上述細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，經(jīng)胰酶消化收集細(xì)胞，離心棄上清，PBS漂冼2次，用含1% PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，BCA分析試劑測定樣品總蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度，煮沸變性10 min。每組各取100 μg總蛋白樣品，以12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS封閉2 h。兔抗人HSP27抗體、兔抗人Activecaspase-3抗體、兔抗人Active-caspase-9抗體、兔抗人Cytc抗體（1∶500稀釋）4 ℃孵育過夜，TBST洗膜15 min，洗2次后加HRP標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗小鼠IgG（1∶500稀釋），常溫孵育2 h，TBST洗膜15 min，洗2次。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，X線片曝光顯影。β-actin作為內(nèi)參照標(biāo)化蛋白質(zhì)表達(dá)。用Quantity One凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)。多組資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊者采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測靶向HSP27-siRNA和5-FU對大腸癌SW480細(xì)胞增殖的抑制作用 采用CCK-8法檢測SW480細(xì)胞增值，結(jié)果顯示，與Normal組比較，NC組作用24、48 h差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），表明陰性siRNA及轉(zhuǎn)染載體對細(xì)胞無明顯毒性作用；5-FU組、siRNA組、siRNA+5-FU組SW480細(xì)胞增殖抑制率高于同期Normal組和NC組（P＜0.05），其中siRNA+5-FU組抑制率明顯高于同期siRNA組和5-FU組（P＜0.05），表明HSP27-siRNA和5-FU聯(lián)合應(yīng)用其細(xì)胞抑制作用明顯增強(qiáng)，見表1。

表1 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率（±s，%）

表1 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率（±s，%）

與同一時(shí)間NC組比：aP＜0.05；與同一時(shí)間siRNA組和5-FU組比：bP＜0.05

2.2 HSP27-siRNA靶向干擾對5-FU誘導(dǎo)SW480細(xì)胞早期凋亡的影晌 與Normal組和NC組比較，siRNA組和5-FU組均可誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡（均P＜0.05）；二者聯(lián)合應(yīng)用，早期凋亡率明顯增加，且大于siRNA組和5-FU組（P＜0.05）；而siRNA組、5-FU組及NC+ 5-FU組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1-2。這些結(jié)果提示HSP27-siRNA可明顯增強(qiáng)5-FU對SW480細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用。

2.3 HSP27-siRNA聯(lián)合5-FU對細(xì)胞Activecasepase-3、Active-casepase-9、Cytc凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的作用 除外HSP27-siRNA轉(zhuǎn)染組Activecasepase-3的表達(dá)與Normal組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），siRNA和5-FU均可促進(jìn)細(xì)胞上述凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，與Normal組比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），且二者聯(lián)合應(yīng)用的表達(dá)量明顯增加，大于siRNA組和5-FU組（P＜0.05），提示二者具有協(xié)同作用。而NC組及NC+5-FU組與Normal組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3和表2。

3 討論

大腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全球各腫瘤中位居第三，且有逐年升高的趨勢[3]。5-FU是最早于1957年由Heidelberger等合成并廣泛應(yīng)用于中晚期大腸癌以及術(shù)后輔助化療的標(biāo)準(zhǔn)治療藥物，但臨床上只有部分病例對5-FU化療完全敏感，腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥是化療失敗或終止并導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因之一[4]。HSP27是小分子HSP家族中的重要一員，我們在前期課題研究中，已證實(shí)HSP27在結(jié)腸癌細(xì)胞及裸鼠皮下移植瘤組織中呈高表達(dá)[5-6]。最近的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[7]表明，HSP27在結(jié)直腸癌中的過表達(dá)與化療耐藥和預(yù)后不良存在必然聯(lián)系。

RNA干擾是指在真核細(xì)胞中引入雙鏈RNA分子從而導(dǎo)致具有序列同源性的基因產(chǎn)生特異性基因沉默的現(xiàn)象，國外文獻(xiàn)[8-9]相繼報(bào)道siRNA干擾能成功靶向抑制肺癌、卵巢癌的表達(dá)。我們在前期工作中已證實(shí)HSP27-siRNA可以通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)染大腸癌SW480細(xì)胞，Western blot檢測結(jié)果表明其在蛋白水平的抑制率達(dá)57.9%，本課題進(jìn)一步研究表明HSP27-siRNA轉(zhuǎn)染能抑制SW480細(xì)胞增殖，同時(shí)可增強(qiáng)5-FU對大腸癌SW480細(xì)胞增殖的抑制作用。

圖1 各組SW480細(xì)胞AilllexinV-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

圖2 各組SW480細(xì)胞的早期凋亡率比較

圖3 各組SW480細(xì)胞中Active-casepase-3、Active-casepase-9、Cytc蛋白的表達(dá)

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是大多數(shù)化療藥物（如5-FU）作用的主要機(jī)制[10]。Zhang等[11]研究報(bào)道腫瘤細(xì)胞的凋亡抵抗是化療藥耐藥的重要原因，而HSP27對腫瘤細(xì)胞的保護(hù)作用，目前普遍認(rèn)為是通過它的抗凋亡作用來實(shí)現(xiàn)的[12]。研究[13]表明Cytc的釋放是線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵因素，釋放到胞漿中的Cytc在dATP作用下與凋亡相關(guān)因子1（apoptosis related factor，Apaf-1）結(jié)合成復(fù)合體，并激活caspase-9酶，被激活的caspase-9又能激活其他caspase如caspase-3等，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Concannon等[14]研究表明HSP27可與Cytc相螯合，阻止了Cytc介導(dǎo)的Apaf-1與caspase-9酶原的作用，阻止了凋亡小體復(fù)合體的形成，從而干擾caspase依賴型細(xì)胞凋亡的線粒體通路。Rocchi等[15]應(yīng)用siRNA干擾前列腺癌細(xì)胞HSP27的表達(dá)可以抑制細(xì)胞的生長，并通過激活caspase-3酶進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為了探討HSP27-siRNA干擾聯(lián)合5-FU對SW480細(xì)胞凋亡的作用，我們采用了流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染靶向HSP27的siRNA組和5-FU組均可誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡，與Normal組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；二者聯(lián)合應(yīng)用，其早期凋亡率明顯增加，與單純應(yīng)用比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示HSP27-siRNA可明顯增強(qiáng)5-FU 對SW480細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用。為了進(jìn)一步研究其促凋亡機(jī)制，我們采用Western blot方法檢測凋亡相關(guān)蛋白Active-casepase-3、Active-caspase-9 及Cytc蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示除siRNA組Activecasepase-3的表達(dá)與Normal組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，siRNA組和5-FU組均可促進(jìn)細(xì)胞上述凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，且二者聯(lián)合應(yīng)用的表達(dá)量明顯增加，高于siRNA組和5-FU組，提示二者具有協(xié)同作用。表明靶向HSP27的siRNA干擾可通過抑制HSP27表達(dá)，減少與Cytc的結(jié)合，進(jìn)而增加Active-casepase-3、Active-caspase-9的活化，從而促進(jìn)5-FU誘導(dǎo)SW480細(xì)胞的凋亡，起到逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥的作用。

表2 各組SW480細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測結(jié)果（±s）

表2 各組SW480細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測結(jié)果（±s）

與Normal組比：aP＜0.05；與siRNA組、5-FU組、NC+5-FU組比：bP＜0.05

綜上所述，我們認(rèn)為HSP27蛋白在大腸癌SW480細(xì)胞中的高表達(dá)與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展及耐藥密切相關(guān)。靶向HSP27的siRNA能有效抑制大腸癌SW480細(xì)胞HSP27蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)5-FU化療藥物的敏感性，通過上調(diào)Active-casepase-3、Active-caspase-9、Cytc蛋白的表達(dá)，并促進(jìn)其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞生長的腫瘤抑制作用。本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞學(xué)水平上研究了靶向HSP27基因沉默對5-FU誘導(dǎo)大腸癌SW480細(xì)胞凋亡的影響，為今后在動(dòng)物水平研究及臨床治療提供理論依據(jù)。

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（本文編輯：趙翠翠）

Effect of HSP27 gene silencing on apoptosis of SW480 cells induced by 5-FU and its mechanism

HUANG Chongjie, LIU Changbao, HU Wanle, CAI Mao.
Department of Anorectal Surgery, the Second Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To explore the effect and mechanism of 5-FU-induced apoptosis of colon cancer SW480 cells with HSP27 silenced by siRNA interference.Methods: Six groups of cells were used in this part of research, including Normal control group (Normal group), negative siRNA group (NC group), HSP27 siRNA group (siRNA group), 5-FU group, 5-FU with negative siRNA group (NC+5-FU group), 5-FU with HSP27 siRNA group (siRNA+5-FU group).HSP27-siRNA was transfected into SW480 cells by lipofectamine 2000.CCK-8 method was used to detect the siRNA targeted on HSP27 and 5-FU’s inhibition effect on SW480 cell proliferation.Early apoptotic rate was measured with fl ow cytometry technique, and Western blot analysis was applied to detect the expression of apoptosis-related protein of Active-casepase-3, Active-caspase-9 and Cytc.Results: Result detected by CCK-8 showed that the cell proliferation inhibition rate of siRNA+5-FU group was obviously higher than that of 5-FU group, which indicated that combined use of 5-FU and siRNA could signifi cantly improve the inhibition rate (P＜0.05).Result detected with fl ow cytometry (FCM) showed that both siRNA group and 5-FU group could induce SW480 cell apoptosis, and the combined use of 5-FU and siRNA could greatly improve the early apoptotic rate.Comparing the siRNA and 5-FU group with Normal and NC group, the difference had statistically signifi cant (P＜0.05).Western blot analysis showed that the expression level of Active-casepase-3, Activecaspase-9 and Cytc in combination group were higher than that of siRNA group and 5-FU group, the difference had statistically signifi cant (P＜0.05).Conclusion: HSP27-siRNA can signifi cantly inhibit HSP27 expression in SW480 cells, and improve the expression of protein Active-casepase-3, Active-caspase-9 and Cytc, then enhance the apoptosis-inducing effect of 5-FU on SW480 cells, and reverse the drug resistance of SW480 cells to 5-FU.

colorectal neoplasm; heat shock protein-27; RNA interference; 5-fl uorouracil; apoptosis

R735.34

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2016.12.004

2016-05-04

溫州市科技局科研基金資助項(xiàng)目（Y20140107）。

黃崇杰（1987-），男，浙江溫州人，住院醫(yī)師，碩士。

劉長寶，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，Email：lcb@wzhealth.com。