一株豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌分離、鑒定及藥敏試驗

蔣增海，徐耀輝，王揚偉，盧建州（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物醫(yī)學系，河南鄭州450046；2.河南省豬病防控工程技術(shù)研究中心，河南鄭州450046）

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一株豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌分離、鑒定及藥敏試驗

蔣增海1，2，徐耀輝1，2，王揚偉1，2，盧建州1，2
（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物醫(yī)學系，河南鄭州450046；2.河南省豬病防控工程技術(shù)研究中心，河南鄭州450046）

產(chǎn)氣莢膜梭菌，根據(jù)產(chǎn)毒素能力分為A、B、C、D和E 5個血清型。一般認為C型菌株是導(dǎo)致2周齡內(nèi)仔豬腸毒血癥和壞死性腸炎的主要病原，而A型菌株則與哺乳及育肥豬腸道疾病有關(guān)[1]。因此，豬產(chǎn)氣莢膜梭菌病主要由A型、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起各種年齡階段的豬發(fā)生一種急性、致死性腸道傳染病。產(chǎn)氣莢膜梭菌除了引起1周齡仔豬發(fā)生的高度致死性、壞死性腸炎外，近年來，由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起育肥豬、后備種豬、懷孕母豬等猝死常有報道[2-4]。2014 年12月中旬，河南某規(guī)模化肥育豬場，從外地購買仔豬，飼養(yǎng)到體重25～40 kg階段，在較長一段時間內(nèi)，零星發(fā)病，表現(xiàn)為突然死亡，死后腹部膨大、臌氣，外觀整個身軀像一個圓形皮球，剖檢腸臌氣、膨大，外觀呈鮮紅色（見中插彩版圖1）。筆者根據(jù)流行特點、臨床癥狀和病理變化，初步診斷為豬產(chǎn)氣莢膜梭菌病，同時采集腸道內(nèi)容物和腸系膜淋巴結(jié)等病料，進行了病原分離、鑒定以及藥敏試驗，報告如下。

1　材料與方法

1.1培養(yǎng)基5%綿羊鮮血瓊脂平板，購自鄭州博賽生物技術(shù)服務(wù)有限公司；營養(yǎng)瓊脂粉、營養(yǎng)肉湯粉，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。

1.2藥敏紙片強力霉素、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、頭孢拉定、卡那霉素、新霉素、克林霉素、阿奇霉素、青霉素和磺胺類藥物等，均購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.3生化試驗試劑各種生化試管，購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.4健康小鼠由本校實驗動物中心提供。

1.5方法

1.5.1涂片鏡檢無菌采集腸系膜淋巴結(jié)、腸道內(nèi)容物，均勻涂抹于潔凈載玻片上，自然干燥，火焰固定后，分別進行瑞氏染色和革蘭染色。

1.5.2細菌分離、培養(yǎng)無菌采集腸系膜淋巴結(jié)、腸道內(nèi)容物，接種綿羊鮮血瓊脂平板，37℃、厭氧（密閉罐內(nèi)，蠟燭火焰燃法）培養(yǎng)12～24 h，根據(jù)細菌生長情況，再挑取溶血性菌落，進一步純化、傳代，接種營養(yǎng)瓊脂平板厭氧培養(yǎng)。

1.5.3生化試驗將所分離純培養(yǎng)物接種牛乳培養(yǎng)基和生化試驗管，37℃、厭氧培養(yǎng)，觀察其生化反應(yīng)特性。

1.5.4藥敏試驗挑取血瓊脂平板純化培養(yǎng)物，接種于滅菌營養(yǎng)肉湯，37℃、厭氧培養(yǎng)24 h后取出，生理鹽水稀釋0.5麥氏渾濁度，然后滅菌棉簽蘸取菌液，均勻涂抹于無菌普通營養(yǎng)瓊脂平板，貼上藥敏紙片，次日測定抑菌圈。

1.5.5致病性試驗挑取分離純化培養(yǎng)物，接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃、厭氧培養(yǎng)16 h，作為攻毒所用的菌液，同時平板培養(yǎng)計數(shù)。選取8只健康小鼠，隨機分為2組，每組4只，1組為試驗組，另外1組為對照組。試驗組，每只小鼠腹腔接種上述培養(yǎng)菌液0.1 mL；對照組，每只小鼠腹腔接種滅菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基0.1 mL。接種后，觀察1周。

2　結(jié)果

2.1細菌形態(tài)和培養(yǎng)特征病料、培養(yǎng)物染色鏡檢后，均可以觀察到革蘭陽性、兩端略微纖細、帶有莢膜的大桿菌，有的還可以觀察到芽孢，有的菌體略微彎曲，如圖2所示。接種病料后，37℃、厭氧培養(yǎng)，均可在血瓊脂平板、營養(yǎng)瓊脂平板生長，菌落呈“勛章樣”、“邊緣鋸齒狀”，血瓊脂平板溶血，如圖3，4所示。

2.2生化試驗葡萄糖、蔗糖、麥芽糖陽性；甘露醇、乳糖陰性；牛奶石蕊培養(yǎng)結(jié)果為酸化和凝固；明膠液化試驗為陽性。符合產(chǎn)氣莢膜梭菌的生化特征。

2.3藥敏試驗藥物抑菌圈結(jié)果如下，頭孢拉定：25 mm，多西環(huán)素：25 mm，氧氟沙星：23 mm，環(huán)丙沙星：23 mm，阿米卡星：23 mm，慶大霉素：22 mm，克林霉素：21 mm，阿奇霉素：19 mm，新霉素：19 mm，卡那霉素：20 mm，青霉素：0 mm，磺胺甲噁唑：0 mm。試驗結(jié)果表明，頭孢拉定、多西環(huán)素抑菌效果最好，而青霉素和磺胺甲噁唑完全耐藥。

2.4致病性試驗通過平板計數(shù)結(jié)果表明，試驗組每只小鼠接種細菌數(shù)為1.61×1011CPU。觀察1周后，對照組小鼠沒有任何臨床癥狀，全部健在，無死亡；試驗組小鼠，接種后24 h死亡1只，26 h死亡1只，兩只小鼠健在，死亡的兩只小鼠均為個體較大者，死亡后腹部膨大，腹腔積液。動物致病性試驗結(jié)果表明，分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌對小鼠具有一定的致病性。

3　分析與討論

3.1本次試驗從猝死保育仔豬分離一株帶有莢膜、革蘭陽性大桿菌，鑒定為產(chǎn)氣莢膜梭菌，但是還需進一步確定其血清型。該試驗結(jié)果表明，產(chǎn)氣莢膜梭菌病在豬場仍舊存在且零星發(fā)病，與文獻報道[2-4]一致，嚴重危害著豬群健康。

3.2由于產(chǎn)氣莢膜梭菌導(dǎo)致保育仔豬、后備母豬、懷孕母豬等猝死，來不及治療，平時應(yīng)該注意預(yù)防，不能隨意更換飼料、突然改變飼喂方式，或者飼喂過飽；一旦有病例出現(xiàn)，全群選擇敏感藥物進行拌料預(yù)防。

3.3本次藥敏試驗結(jié)果表明，分離菌株對青霉素和磺胺甲噁唑完全耐藥，不能作為本病治療的首選藥物，但是可以參考選擇頭孢拉定、強力霉素或者氧氟沙星等藥物治療該病。

3.4小鼠致病性試驗表明，分離純化培養(yǎng)物接種小鼠，可導(dǎo)致發(fā)病，但是感染個體較大者，死亡率為50%，與產(chǎn)氣莢膜梭菌病在豬場零星發(fā)病有某些相似之處。

參考文獻：

[1]陳溥言.獸醫(yī)傳染病學[M] . 5版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006：249-250.

[2]肖桂萍.豬產(chǎn)氣莢膜梭菌病的診斷及防治[J].中國畜牧獸醫(yī)，2008，35（11）：143-144.

[3]蔣增海，鄧同煒，唐光武.母豬魏氏梭菌病的診斷、防治及病因分析[J].畜牧與獸醫(yī)，2010，42（5）：112.

[4]王加利.后備種豬產(chǎn)氣莢膜梭菌病的診療[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘，2013，9（2）：176.

中圖分類號：S852.65+1

文獻標志碼：B

文章編號：0529-6005（2016）05-0080-01

收稿日期：2015-03-04

作者簡介：蔣增海（1976-），男，講師，碩士，主要從事豬病的教學、科研工作，E-mail：50242328@qq.com