Pristane誘導的系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型的研究進展①

沈立軍　孔 永　邱玉華

(蘇州大學基礎醫(yī)學與生物科學學院免疫學系，蘇州215123)

Pristane誘導的系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型的研究進展①

沈立軍孔 永②邱玉華

(蘇州大學基礎醫(yī)學與生物科學學院免疫學系，蘇州215123)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是由于機體免疫功能紊亂而導致的自身免疫性疾病[1]。在SLE患者的體內，細胞異常凋亡，細胞因子分泌失衡，T、B細胞過度活化，產(chǎn)生大量的自身抗體以及造成免疫復合物(Immune complex，IC)沉積，最終累及全身多器官系統(tǒng)造成損害[2-7]。雖然確切病因和發(fā)病機制仍不明確[8]，但一般認為SLE可由多種因素綜合作用而誘發(fā)，其中環(huán)境因素在SLE的發(fā)病過程中具有重要的作用。

Pristane(降植烷)化學名為2,6,10,14-四甲基十五烷(2,6,10,14-tetramethylpenta-decane，TMPD)，是一種可來源于植物、海洋生物以及石油的類異戊二烯烷烴類化合物，其為細胞膜激活劑，可與脂質雙分子和細胞膜結合，造成細胞毒性、導致細胞凋亡以及自身抗原的產(chǎn)生，進而打破機體免疫耐受及誘導自身免疫性疾病的發(fā)生[9]。1994年Satoh應用Pristane誘導BALB/c小鼠出現(xiàn)類似于人類SLE的癥狀，首次建立了Pristane誘導的狼瘡小鼠模型[10]。與自發(fā)性狼瘡小鼠模型所不同的是該模型側重于研究環(huán)境因素打破機體免疫耐受以及導致SLE的機制，為探究非遺傳因素在SLE發(fā)病過程中的作用，提供了有力的工具，現(xiàn)在也成為最常用的SLE小鼠模型之一[11，12]。本文就降植烷誘導的SLE小鼠模型作一綜述。

1Pristane誘導的狼瘡小鼠模型的制備及模型小鼠的癥狀表現(xiàn)

1.1Pristane誘導的狼瘡小鼠模型的制作方法多種品系小鼠均可經(jīng)一次性腹腔注射0.5 ml Pristane制備本模型[13]，使用該方法誘導狼瘡小鼠模型，技術簡便，但小鼠出現(xiàn)腎臟病變的時間較長，需要經(jīng)過6～7個月才能誘導小鼠狼瘡腎炎(Lupus nephritis，LN)的形成。

1.2Pristane誘導的狼瘡小鼠模型的癥狀表現(xiàn)[14，15]BALB/c小鼠在經(jīng)Pristane誘導2～4周后，出現(xiàn)抗ssDNA(single strand DNA)及抗組蛋白的IgM抗體，隨后2～6個月內出現(xiàn)抗Su以及抗Sm/RNP(ribonucleoprotein)的IgG抗體，在第4～6個月時出現(xiàn)抗dsDNA(double strand DNA)抗體，小鼠全血和腹腔中IFN-α分泌細胞(CD11b+Ly6Chigh)以及脾臟中活化B細胞的比例亦顯著高于對照組。模型小鼠在誘導后的第3個月時出現(xiàn)蛋白尿，6個月時尿蛋白程度1+～3+(30～300 mg/dl)；第3個月時開始出現(xiàn)關節(jié)滑膜增生，關節(jié)侵蝕性破壞等關節(jié)病變；第6個月時小鼠腹腔內脾臟、肝臟以及腸系膜等處出現(xiàn)數(shù)量、大小不等的脂肪肉芽腫(單核細胞、巨噬細胞吞噬Pristane油滴及淋巴細胞增殖聚集形成異位淋巴組織)[16]；6個月時小鼠腎臟出現(xiàn)節(jié)段性或彌漫性增生性腎小球病變：上皮和內皮細胞腫脹，系膜基質及系膜細胞增生，腎小球毛細血管袢增厚和單核細胞侵潤，基底膜不規(guī)則增厚，內皮足突消失，上皮下及系膜區(qū)電子致密物沉積，IgG、IgM及C3沉積于系膜和腎小球毛細血管[16-18]。

高增燕采用C57BL/6小鼠制備Pristane誘導的狼瘡小鼠模型，在誘導后第10天，發(fā)現(xiàn)小鼠脾臟中巨噬細胞、樹突狀細胞、粒細胞以及B細胞均出現(xiàn)顯著的活化，(B220+)B細胞表面CD21、CD86、MHCⅡ等分子的表達水平也出現(xiàn)不同程度上調；第3個月時在30%的小鼠血清中可以檢測到抗核抗體(Antinuclear antibodies，ANA)的表達；第4個月時ANA陽性率進一步升高(80%小鼠可檢測到其表達)，同時也檢測到抗dsDNA抗體的表達(陽性率達89%)；第7個月時78%的小鼠出現(xiàn)蛋白尿，腎臟病理檢查亦顯示腎小球腫脹，淋巴細胞浸潤以及IC沉積等典型的腎臟病變。

C57BL/10小鼠在經(jīng)Pristane誘導后出現(xiàn)肺毛細血管炎以及血管周圍巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞侵潤；模型鼠肺泡上皮損傷、血管及肺泡出現(xiàn)中到重度炎癥；從模型鼠氣管肺泡灌洗液中檢測出巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞，灌洗液中IL-6、IL-10的含量也顯著高于對照組；經(jīng)Pristane誘導后，在小鼠腹膜及腹腔實質器官可見脂肪肉芽腫；腎臟檢測顯示系膜基質和系膜細胞IgG和C3免疫復合物沉積[19]。

2Pristane誘導小鼠狼瘡產(chǎn)生的影響因素

2.1微生物Mizutani[20]對Pristane誘導的無菌和普通級BALB/c小鼠進行了研究，發(fā)現(xiàn)Pristane誘導后，無菌小鼠和普通級小鼠均可出現(xiàn)腹腔內脂肪肉芽腫、高丙種球血癥，血清中IgG2a/IgG1比率升高并出現(xiàn)抗Sm/RNP抗體(陽性率為40%)和抗Su(抗體陽性率43%)；同時也發(fā)現(xiàn)無菌小鼠和普通級小鼠腹腔細胞經(jīng)脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)體外刺激后，IL-6及IL-12表達水平與對照組相比均升高，腹腔細胞可以產(chǎn)生高水平的IFN-γ(添加抗CD3抗體培養(yǎng)或添加PHA/conA培養(yǎng))和IL-4(添加PHA/conA培養(yǎng))。這些結果表明Pristane誘導小鼠產(chǎn)生自身抗體及高種球蛋白血癥、分泌過量的細胞因子、形成腹腔炎癥(脂肪肉芽腫)并不需要特定的微生物環(huán)境。

Hamilton[21]采用Pristane誘導制備BALB/c狼瘡小鼠模型并比較了其在普通環(huán)境及SPF(Specific pathogen free)環(huán)境下的自身抗體生成表現(xiàn)，認為微生物環(huán)境可以協(xié)同Pristane刺激小鼠產(chǎn)生炎性環(huán)境/活化B細胞導致T細胞非依賴性的高丙種球蛋白血癥，但對T細胞依賴性的抗Sm/RNP和抗Su抗體的產(chǎn)生卻是非必需的。因此，采用Pristane誘導制備小鼠狼瘡模型時，普通環(huán)境下飼養(yǎng)動物即可滿足要求。

2.2小鼠品系目前建立Pristane誘導的狼瘡小鼠模型常采用的是BALB/c(H-2d)小鼠和C57BL/6(H-2b)小鼠，但是采用Pristane誘導小鼠產(chǎn)生自身抗體不需要限定品系，多種品系小鼠均可經(jīng)Pristane誘導產(chǎn)生自身抗體，但所產(chǎn)生抗體的種類、頻率以及滴度有所差別，受到H2連鎖基因和非H2基因的共同影響。Satoh研究了多種品系小鼠經(jīng)Pristane誘導后產(chǎn)生自身抗體的情況，檢測發(fā)現(xiàn)A.SW (H-2s)小鼠C57BL/B6(H-2b)小鼠、BALB/c ByJ(H-2d)小鼠和DBA/1(H-2q)小鼠可以產(chǎn)生抗Sm/RNP抗體和抗Su抗體；A.SW (H-2s)小鼠、C57BL/6 (H-2b)小鼠以及C3H(H2-2k)小鼠可產(chǎn)生抗Rib P(ribosomal protein)抗體，然而BALB/c(H-2d)小鼠、DBA/1(H-2q)小鼠以及H-2k品系小鼠B6.H2k和BALB/K并不產(chǎn)生此抗體；抗dsRNA抗體的產(chǎn)生限定于C57BL/B6(H-2b)小鼠和B10.S(H-2b)小鼠。

2.3性激素雌激素對SLE的發(fā)病具有多種促進作用：促進初始B細胞生存活化相關基因的表達上調，增強其抗凋亡的能力，增加生發(fā)中心邊緣區(qū)B細胞的數(shù)量以及保護自身反應性B細胞；促進T細胞、樹突狀細胞的活化成熟，降低外周血中單個核細胞的凋亡水平及TNF-α分泌，降低骨髓粒細胞-巨噬細胞克隆的數(shù)量[22]。

采用雌性小鼠建立Pristane誘導的小鼠狼瘡模型，更容易誘導出狼瘡病變，研究表明，采用Pristane誘導SJL/J小鼠建立狼瘡模型，雌性鼠較雄性鼠有更高的死亡率(80% vs 37.5%，35周時)和更早的死亡出現(xiàn)時間(16周vs 24周)，同時雌性模型鼠也表現(xiàn)出高于雄性模型鼠的自身抗體(ANA、抗dsDNA)水平和更嚴重的腎臟病變[23]。

3Pristane誘導的狼瘡小鼠模型的免疫病理機制

Pristane可以促進腹腔內巨噬細胞分泌IL-6等細胞因子，以及導致活性氧自由基、NO等活性中間體(可以導致細胞脂質、蛋白質及核酸的損傷)的產(chǎn)生，形成炎癥環(huán)境[24]，并可通過線粒體途徑誘導腹腔內細胞凋亡產(chǎn)生自身抗原，進而導致T、B細胞等異?；罨约爱a(chǎn)生自身抗體，最終出現(xiàn)組織器官的炎癥損傷[25]。

Ⅰ型干擾素(IFN標簽)與SLE自身抗體水平和疾病活動程度密切相關[26]，檢測表明，在Pristane誘導的狼瘡小鼠的體內Ⅰ型干擾素的表達水平存在明顯升高的現(xiàn)象[27]。IFN-α可由未成熟的Ly6Chigh單核細胞通過TLR7/MyD88信號通路介導所產(chǎn)生。自身抗原抗體復合物作為啟動物質誘導單核細胞表達IFN-α，IFN-α在相應趨化因子的參與下進一步可募集單核細胞并誘導其表達TLR7并反饋促進IFN-α的分泌；IFN-α可以促進DC成熟進而打破免疫耐受，致使自身反應性T、B細胞活化，增強CD8+T細胞的毒性作用并上調APC(Antigen presenting cell)表面共刺激分子的表達以及促進CD4+T細胞數(shù)量增加[28,29]。

Ⅰ型干擾素對于SLE的發(fā)病具有重要的作用，其對抗Sm/RNP等抗體的產(chǎn)生是必需的。研究顯示，Ⅰ型干擾素受體缺陷(Ifnar-/-)的129Sv小鼠給予Pristane誘導后，在外周血細胞中未檢測到Ⅰ干擾素刺激基因(type Ⅰ interferon stimulated genes，ISGs)的表達，盡管小鼠出現(xiàn)腎小球免疫復合物沉積，但并未出現(xiàn)狼瘡特異性的抗Sm/RNP抗體和抗dsDNA抗體，也未出現(xiàn)蛋白尿和腎小球內細胞數(shù)目增加[29]。

IL-6是一種多功能性細胞因子，其對于機體免疫調節(jié)和炎癥反應具有重要作用，在Pristane誘導的狼瘡小鼠體內，IL-6可由Pristane誘導的脂肪肉芽腫內巨噬細胞以及腹腔內巨噬細胞等分泌產(chǎn)生。IL-6與SLE疾病活動程度及抗DNA抗體的表達水平相關，可以促進B細胞分化為漿細胞并產(chǎn)生IgG抗體，其表達水平的提高可以促進B細胞的自身反應性增強及自身抗體的產(chǎn)生[30-31]。Richards研究了Pristane誘導的IL-6缺陷(IL-6-/-)BALB/c自身抗體表達的情況，結果表明抗ssDNA抗體、抗dsDNA抗體以及抗染色質抗體的產(chǎn)生均依賴于IL-6的作用。

IL-6通過增強T細胞分泌IL-2和誘導其表面IL-2受體的表達，促進T細胞增殖及分化為功能性T細胞；促進巨噬細胞、表皮細胞以及腎小球系膜細胞的增殖分化，介導形成組織損傷[32,33]。

IFN-γ是重要的Th1型細胞因子，其表達水平與系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動指數(shù)(SLE disease activity ind，SLEDAI)相關，IFN-γ可增強B細胞的自身反應性和自身抗體的分泌，可刺激腎小球系膜細胞CD40分子表達上調，活化單核細胞、巨噬細胞等促進炎癥反應，造成細胞介導的免疫損傷，導致增生性腎小球腎炎。研究表明，IFN-γ缺陷(IFN-γ-/-)的BALB/c小鼠經(jīng)Pristane誘導后，無免疫復合物沉積、腎小球腎炎以及蛋白尿出現(xiàn)，抗DNA/染色質IgG抗體表達水平也較對照組低，表明IFN-γ對Pristane誘導抗DNA/染色質抗體產(chǎn)生和狼瘡腎炎病變具有重要作用。

IL-12可由巨噬細胞、樹突狀細胞產(chǎn)生，是IFN-γ產(chǎn)生的關鍵刺激因子，其與IL-18、IL-2協(xié)同作用誘導IFN-γ的產(chǎn)生，促使初始T細胞分化為Th1細胞以及介導Th1型免疫反應[34]。研究發(fā)現(xiàn)[35]，IL-12缺陷(IL-12 p35-/-)的BALB/c小鼠經(jīng)Pristane誘導雖可以產(chǎn)生狼瘡抗體和免疫復合物沉積，但并不出現(xiàn)蛋白尿及腎臟病變，這說明了產(chǎn)生抗Sm/RNP抗體和免疫復合物沉積不依賴IL-12，但IL-12對腎臟結構的損傷及Pristane誘導小鼠狼瘡腎炎的形成是必需的。

4小結

采用非自身免疫性疾病易感鼠一次性腹腔注射降植烷的方式建立的誘導型SLE小鼠模型可表現(xiàn)出狼瘡抗體產(chǎn)生、免疫復合物沉積以及狼瘡腎炎等與人類SLE相似的癥狀。該模型制備方便，動物來源廣泛，技術簡單，易于實驗操作，經(jīng)濟實用，對于研究環(huán)境因素誘發(fā)SLE的機制具有較好的應用價值。

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[收稿2015-05-10修回2016-04-20]

(編輯張曉舟)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.030

作者簡介：沈立軍(1986年-)，男，碩士，初級研究員，主要從事分子免疫學研究，E-mail:junwuxiy@163.com。 通訊作者及指導教師：邱玉華(1957年- )，女，教授，博士生導師，主要從事抗體工程與腫瘤免疫學研究，E-mail: qyh820@126.com。

中圖分類號R593.24+1

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)06-0900-04

①本文為國家自然科學基金(No.81373236)。

②共同第一作者。