環(huán)氧化酶5a在神經(jīng)疾病治療中的研究進展

李登賀 金 華 李艷華

(昆明理工大學醫(yī)學院，云南 昆明 650500)

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環(huán)氧化酶5a在神經(jīng)疾病治療中的研究進展

李登賀 金 華1李艷華1

(昆明理工大學醫(yī)學院，云南 昆明 650500)

Cox5a；神經(jīng)疾病

神經(jīng)疾病是指一組由慢性進行性的中樞神經(jīng)組織退行性變性而產(chǎn)生的疾病的總稱，如運動失調(diào)的帕金森疾病(PD)、老年性癡呆的阿爾茨海默病(AD)、亨廷頓病(HD)、肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)等。本文對環(huán)氧化酶(Cox)5a在神經(jīng)疾病治療中的研究進展作一綜述。

1 Cox5a的分子生物學

Cox5a(Va)是Cox的一個亞型，Cox5a和Cox5b共同組成亞基Cox5，參與組裝Cox〔1〕。Cox是線粒體呼吸鏈氧化磷酸化過程的限速酶，直接參與線粒體氧的利用和能量產(chǎn)生，它位于線粒體內(nèi)膜上，有多個亞基組成的酶分子，其中包括3個大亞基Cox1、Cox2、Cox3,它們由線粒體DNA編碼，構(gòu)成級聯(lián)反應的核心，序列高度保守,而Cox5a不同于Cox1、Cox2、Cox3,它和其余9個小亞基共同由核DNA編碼，基因分別定位于9條不同的染色體上，在胞質(zhì)內(nèi)翻譯后轉(zhuǎn)運到線粒體參與裝配，具有明顯的器官和種族差異〔2〕,小鼠的Cox5a基因約11 196 bp,人的Cox5a基因約17 880 bp,而酵母的Cox5a基因約462 bp。

早期人們對Cox5a基因的研究是在酵母中，Cox5a是細胞色素C氧化酶亞基Ⅴ的一個編碼基因，它與Cox5b分別形成細胞色素C的兩種不同的形式。運用單克隆技術(shù)揭示了Cox5a基因編碼的蛋白質(zhì)有153個氨基酸，通過分析Cox5a基因的編碼區(qū)域序列，顯示了一個獨立的不間斷開放的153個密碼子結(jié)構(gòu)，由于已斷定氨基(NH2)末端的成熟亞基Ⅴa的序列氨基酸，因此預測到有一個分子量為17 139的初級翻譯產(chǎn)物亞基Ⅴa前體。另外，Cox5a和Cox5b的編碼序列雖然有67%的核苷酸和66%的蛋白質(zhì)同源〔3〕，但是，利用基因重新組合的實驗技術(shù)，發(fā)現(xiàn)Cox5a在全酶基因的組裝和功能方面做出的貢獻比Cox5b更大更有效〔4〕，在突變亞基Ⅴ中插入Cox5a基因能夠補償突變并能夠恢復細胞色素C氧化酶的活性〔5〕。值得注意的是，Cox5a基因的表達受氧濃度的調(diào)控，氧濃度達到0.5 μmol/L時，Cox5a得以表達，而 Cox5b則在氧濃度小于0.5 μmol/L的情況下才能表達，是厭氧基因。Cox的活性是由Cox5a和Cox5b的量、比例和Cox的分子量來決定的〔6〕，在呼吸作用中，氧正常的情況下，Cox5a表現(xiàn)出比Cox5b更有效地增加Cox的活性〔7〕。在哺乳動物細胞中，Cox復合物組裝的第一步是Cox1膜的融合，接著耦聯(lián)Cox4-Cox5a異源雙核體，亞基Cox5a直接結(jié)合亞基Cox1，在研究人類Cox復合物的組成和功能中，得知低量的Cox5a導致Cox的活性降低、需氧酶的親和力降低、Cox二聚物水平降低、Cox的子復體的積累增加和呼吸鏈的超復體的格局改變增高。Cox的缺陷歸咎于Cox5a和Cox6a1缺乏，影響呼吸鏈超復體的形成〔8〕。氧化磷酸化是哺乳細胞重要的代謝途徑，神經(jīng)細胞完全依靠氧化磷酸化合成三磷酸腺苷(ATP)，Cox的損傷將直接影響能量代謝，導致能量產(chǎn)生受阻、呼吸鏈大量產(chǎn)生自由基，而作為Cox的成分Cox5a參與形成氧化磷酸化的全酶〔9，10〕，因此Cox5a的失調(diào)將對神經(jīng)系統(tǒng)疾病造成一定威脅。

2 Cox5a與神經(jīng)疾病

線粒體能量代謝障礙在缺血、神經(jīng)毒性物質(zhì)等引起的急性腦損傷及AD、PD、HD等慢性神經(jīng)退行性疾病的病理過程中都扮演著至關(guān)重要的角色。引起線粒體能量代謝的因素有很多，其中Cox功能失調(diào)是引起了許多與能量相關(guān)的疾病的基礎(chǔ)缺陷，大量顯著的Cox缺陷經(jīng)常與其他呼吸鏈酶缺乏有關(guān)，這都有利于線粒體DNA突變，盡管如此，在早期的疾病中，線粒體DNA的突變并不普遍，家譜分析和細胞融合實驗表明核基因參與一些早期事件的發(fā)生〔11〕，典型的Leigh綜合征就是有核DNA突變引起的一種先天能量代謝錯誤的神經(jīng)變性失調(diào)的亞急性壞死腦脊髓炎疾病，在這個疾病中Cox5a參與調(diào)解，然而Cox5a的相關(guān)機制并不是很清楚〔12〕。但是，在多年來的研究〔2〕中，許多神經(jīng)疾病都伴隨有Cox5a的變化，可推想Cox5a在神經(jīng)疾病中起到的作用應該是舉足輕重的。

2.1 神經(jīng)疾病中Cox5a的表達下調(diào) Cox是一種內(nèi)源性代謝物標志物，Cox5a作為Cox組裝成分，也經(jīng)常在研究神經(jīng)疾病的能量代謝中作為參考，它與腦神經(jīng)元能量代謝有著密切關(guān)系。正常情況下Cox5a的表達與神經(jīng)元的功能水平相一致，并隨著神經(jīng)元功能狀態(tài)的改變而發(fā)生變化，可以作為細胞和整體水平研究腦功能的重要指標。很多的研究〔9,10,13〕報道指出多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病均顯示出Cox5a表達的下調(diào)，進而引起能量調(diào)節(jié)失衡，以至于神經(jīng)元能量無法滿足而導致疾病產(chǎn)生。

在研究凝溶膠蛋白的表達對AD患者的線粒體呼吸鏈活性影響中，Antequera等〔14〕以Cox復合物Ⅳ和Cox5a的表達作為判斷線粒體呼吸鏈活性的指標。分別對4個淀粉樣前體蛋白(APP)/早老素(Ps)1小鼠的大腦皮質(zhì)組織進行處理，分為空白對照組、注射有獲得性免疫缺陷綜合征病毒攜帶(HIV-vv)組、注射攜帶凝膠蛋白的獲得性免疫缺陷綜合征病毒(HIV-gel)和注射空載凝膠蛋白的獲得性免疫缺陷綜合征病毒(HIV-sigel)組，采用非變形聚丙烯酰胺凝膠EP跡和條形圖分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIV-凝溶膠蛋白處理組復合物Ⅳ活性增加、Cox5a表達增加，干擾組Cox5a卻減少。凝溶膠蛋白使AD患者中的Aβ減少，而Aβ是導致AD的禍首，在此疾病中，Cox5a表達下調(diào)，使Cox的活性降低，從而導致線粒體呼吸鏈活性失調(diào)。而在正常的腦老化和AD疾病患者的細胞自噬調(diào)節(jié)機制中，研究人員通過實驗分析和對照，證明在AD患者中，Cox5a 的下調(diào)導致活性氧(ROS)積累，從而誘導細胞自噬異常，導致正常的細胞自噬功能紊亂〔15〕。無論其作用機制如何，這兩項研究都說明在AD中，Cox5a的表達下調(diào)。

同樣，Yin等〔16〕在研究中藥對急性心肌梗死的治療過程中，選中線粒體氧化磷酸化作為目標路徑。并且，兩個與能量代謝有關(guān)的基因,Cox5a和ATP5e,被選為靶基因，可見Cox5a在急性心肌梗死患者中的變化是比較顯著的，采用實時定量基因擴增熒光檢測系統(tǒng)(Q-PCR)檢測目的基因Cox5a mRNA的改變，通過比色實驗測得相關(guān)酶的活性，結(jié)果表明在急性心肌梗死模型中，也有Cox5a表達下調(diào)現(xiàn)象，Cox5a的下調(diào)表達誘導刺激局部缺血性心肌細胞凋亡，而通過藥物處理后，Cox5a表達上調(diào)，實驗表明藥物通過上調(diào)Cox5a的表達水平和細胞色素C氧化酶的活性來減弱線粒體鈣離子的過量，達到治療急性心肌梗死的目的，從側(cè)面也說明了在急性心肌梗死疾病中Cox5a的表達是下調(diào)的。在PD中，Cox5a的表達同樣表現(xiàn)為下調(diào)趨勢〔17〕，Lu等〔18〕在研究糖尿病的蛋白質(zhì)組學時也表現(xiàn)與能量相關(guān)的Cox5a的表達下調(diào)。由此可見，在神經(jīng)疾病的發(fā)生過程中，Cox5a下調(diào)導致Cox活性降低，從而引起神經(jīng)疾病的發(fā)生，所以上調(diào)Cox5a基因的表達成為治療神經(jīng)疾病的一個手段。

2.2 在神經(jīng)疾病中Cox5a的作用 Cox5a構(gòu)成了Cox的催化中心，參與線粒體氧化磷酸化途徑，Cox5a的調(diào)節(jié)直接影響整個呼吸鏈的功能作用。腦老化是一種學習能力逐漸下降與部分記憶的漸漸喪失的過程，期間伴隨著Cox5a的下調(diào)，其朝著惡性方向發(fā)展的一定階段，可能會演變成一些常見而棘手的疾病，如AD、PD及其他一系列老化相關(guān)的疾病。神經(jīng)疾病中Cox5a的表達是下調(diào)的，眾多的研究〔15，17〕表明增加Cox5a的表達對于神經(jīng)修復的調(diào)節(jié)具有一定的積極意義。

魏宏亮〔19〕建立SD大鼠部分去背根神經(jīng)可塑性模型，利用降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)標記脊髓Ⅱ板層神經(jīng)膨體，計數(shù)CGRP陽性神經(jīng)膨體數(shù)量變化，并利用對照實驗，免疫熒光組化技術(shù)，同時進行壓爪甩尾痛覺檢測，通過Cox5a干擾前后對比，結(jié)果表明Cox5a干擾前，通過電針刺治療在28 d的時間痛溫覺傳導通路接近于正常水平，而Cox5a干擾后，其痛覺閾值增高，體內(nèi)的神經(jīng)修復困難，影響感覺傳導通路的再建立。而此實驗間接地說明，當機體受到傷害性損傷或刺激時，損傷區(qū)細胞的能量代謝增強，使Cox5a表達增多，增多的Cox5a使局部ATP產(chǎn)生增多，增多的ATP對神經(jīng)修復具有促進作用，再者，增多的Cox5a可以使脊髓Ⅱ板層中的CGRP出芽增多，而增多的CGRP對脊髓損傷后神經(jīng)的可塑性具有促進作用，而當Cox5a被干擾后，CGRP出芽減少，表明Cox5a在脊髓損傷神經(jīng)修復的過程中是通過調(diào)節(jié)CGRP的合成來實現(xiàn)的。

與此同時，在習楊彥彬〔20〕研究Cox5a及其關(guān)聯(lián)的電壓門控鈉通道(SCN)2B在小鼠腦老化中的作用及其相關(guān)機制的過程中，了解到Cox5a在腦老化過程中，對于學習記憶能力的調(diào)節(jié)都發(fā)揮著重要作用。采用全身過表達Cox5a轉(zhuǎn)基因小鼠，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡法的方法，利用水迷宮檢測學習記憶能力，用神經(jīng)電生理技術(shù)檢測海馬長時程增強(LTP)，進行Cox5a免疫組織化學染色。結(jié)果顯示，Cox5a上調(diào)至正常的58%時就可以明顯改善轉(zhuǎn)基因小鼠的學習記憶能力，其機制可能在于Cox5a的表達增加促進海馬神經(jīng)元的突觸興奮性，增加海馬神經(jīng)元樹突的密度，代償腦老化過程中神經(jīng)營養(yǎng)因子及其下游信號分子的缺失或線粒體功能缺陷，與此同時還發(fā)現(xiàn)，當Cox5a上調(diào)時，SCN2B下調(diào)，而SCN2B在腦老化引起的認知功能的減退過程中具有促進作用，可見Cox5a可以抑制認知功能的減退。在Cox5a轉(zhuǎn)基因小鼠中，過表達的Cox5a小鼠中局部腦區(qū)的上調(diào)保護性因子類胰島素生長因子(IGF)-1的水平顯著上調(diào)，而糖原合成酶激酶(GSK)-3β明顯下調(diào)，推測Cox5a可能通過上調(diào)IGF-1的水平來發(fā)揮其神經(jīng)保護作用，同時降低GSK-3β的基因表達水平，改善記憶能力。在AD中，Cox5a的過表達降低海馬中堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的表達、代償神經(jīng)元線粒體的功能障礙、改善學習記憶能力。

無論是在脊髓損傷的修復還是在調(diào)節(jié)腦神經(jīng)元的功能上，都有說明Cox5a在能量代謝上發(fā)揮著一定的作用。在黑質(zhì)紋狀體多巴胺神經(jīng)元退化導致紋狀體多巴胺缺陷的PD中，Agrawal等〔21〕在蛋白組學上，就氯氰菊酯改變其線粒體功能的研究過程中，報道Cox5a的增加對于調(diào)節(jié)能量代謝具有很大的作用，Cox5a的異常調(diào)節(jié)導致ATP消耗、無用的激進分子增加和細胞凋亡，使用藥物治療后檢測到Cox5a增加，說明Cox5a的調(diào)節(jié)可能對于神經(jīng)功能的恢復是必不可少的一個因子，但它是否真的在PD的治療中起到內(nèi)在直接作用，目前并沒有相關(guān)可靠的證據(jù)。

很多研究〔13～16〕表明在神經(jīng)疾病中Cox5a基因確實是表達下調(diào)，也有研究〔18～21〕表明能夠通過上調(diào)Cox5a來修復神經(jīng)元，在神經(jīng)疾病中起到一定積極的作用，但Cox5a的表達調(diào)控機制仍需要研究。伴隨著Cox5a檢測方法和實驗技術(shù)的提升，可能發(fā)現(xiàn)更多的神經(jīng)疾病中更詳細的Cox5a的信息，為Cox5a 基因作為治療神經(jīng)疾病的理想靶點提供更有利證據(jù)。

1 Allen LA,Zhao XJ,Caughey W,etal.Isoforms of yeast cytochrome c oxidase subunit Ⅴ affect the binuclear reaction center and after the kinetics of interation with the isoforms of yeast cytochrome c〔J〕.J Biologl Chem,1995;270(1):110-8.

2 李 梨,劉智敏.細胞色素C氧化酶與神經(jīng)疾病研究現(xiàn)狀〔J〕.中國老年學雜志,2010;30(21)：3217-9.

3 Cumsky MG,Truebloood CE,Ko C,etal.Structural analysis of two genes encoding divergent forms of yeast cytochrome c oxidase subunit V〔J〕.Mol Cell Biol,1987;7(10):3511-9.

4 Trueblood CE,Poyton RO.Differential effectiveness of yeast cytochrome c oxidase subunit V genes results from differences in expression not function〔J〕.Mol Cell Biol,1987;7(10):3520-6.

5 Cumsky MG,Ko C,Trueblod CE,etal.Two nonidentical forms of subunit V are functional in yeast cytochrome c oxidase〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,1985;82(8):2235-9.

6 胡 珅,楊謙和,劉志華.球毛殼菌Cox5a基因克隆及特性分析〔J〕.東北林業(yè)大學學報，2007;35(4):36-40.

7 Castello PR,Woo DK,Ball K,etal.Oxygen-regulated isoforms of cytochrome c oxidase have differential effects on its nitric oxide production and on hypoxic signaling〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2008;105(24):8203-8.

8 Fornuskova D,Stiburek L,Wenchich L,etal.Novel insights intothe assembly and function of human nuclear-encoded cytochrome c oxidase subunits 4,5a,6a,7a and 7b〔J〕.Biochem J,2010;428(3):363-74.

9 Ongwijitwat S,Wong-Riley MT.Is nuclear respiratory factor 2 a master transcriptional coordinator for all ten nuclear-encoded cytochrome coxidase subunits in neurons〔J〕?Gene,2005;360(1):65-77.

10 Liang HL,Ongwijitwat S,Wong-riley MT.Bigenomic functional regulation of all 13 cytochrome c oxidase subunit transcripts in rat neurons in vitro and in vivo〔J〕.Neuroscience,2006;140(1):177-90.

11 Taanman JW.Human cytochrome c oxidase:structure,function,and deficiency〔J〕.J Bioenerg Biomembr,1997;29(2):152-63.

12 Kovárová N,Cizkova Vrbacka A,Pecina P,etal.Adaptation of respiratory chain biogenesis to cytochrome c oxidase deficiency caused by SURF1 gene mutations〔J〕.Biochim Biophys Acta,2012;1822(7):1114-24.

13 Callahan LA,Supinski GS.Downregulation of diaphragm electron transport chain and glycolytic enzyme gene expression in sepsis〔J〕.J Appl Physiol,2005;99(3):1120-6.

14 Antequera D,Vargas T,Ugalde C,etal.Cytoplasmic gelsolin increases mitochondrial activity and reduces Aβ burden in a mouse model of Alzheimer's disease〔J〕.Neurobiol Dis,2009;36(1):42-50.

15 Lipinski MM,Zheng B,Lu T,etal.Genome-wide analysis reveals mechanisms modulating autophagy in normal brain aging and in Alzheimer’s disease〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2010;107(32):14164-9.

16 Yin HJ,Guo CY,Shi DZ.Effects of Chinese herbs capable of replenishing qi,nourishing yin and activating blood circulation and their compatibility on differentially expressed genes of ischemic myocardium〔J〕.Chinese Sci Bull,2009;54(18):3278-82.

17 Sun XJ,Wang JF,Tseng M,etal.Downregulation in components of the mitochondrial electron transport chain in the postmortem frontal cortex of subjects with bipolar disorder〔J〕.J Psychiatry Neurosci,2006;31(3):189-96.

18 Lu HF,Yang Y,Allister EM,etal.The identification of potential factors associated with the development of type 2 diabetes a quantiative proteomics approach〔J〕.Mol Cell Prot,2008;7(8):1434-51.

19 魏宏亮.Cox5a在去背根大鼠神經(jīng)可塑性及其針刺中的作用〔D〕.昆明：昆明醫(yī)科大學,2012.

20 習楊彥彬.Cox5a及其關(guān)聯(lián)SCN2B在小鼠腦老化中的作用及相關(guān)機制的研究〔D〕.昆明：昆明醫(yī)科大學，2013.

21 Agrawal S,Singh A,Tripathi P,etal.Cypermethrin-induced nigrostriatal dopaminergic neurodegeneration alters the mitochondrial function:a proteomics study〔J〕.Mol Neurobiol,2015;51(2):448-65.

〔2015-09-17修回〕

(編輯 苑云杰/王一涵)

云南省科學技術(shù)聯(lián)合專項(2013FZ298)

李艷華(1966-)，女，教授，碩士生導師，主要從事神經(jīng)生物學研究。

李登賀(1989-)，女，在讀碩士，主要從事神經(jīng)生物學研究。

R741.05

A

1005-9202(2016)21-5463-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.112

1 云南省第一人民醫(yī)院麻醉科