不同強度不同時間耐力訓(xùn)練對于大鼠心肌細(xì)胞自噬發(fā)生程度的影響

馬曉雯常蕓王世強王菲

1國家體育總局體育科學(xué)研究所（北京100061）

2上海體育學(xué)院

不同強度不同時間耐力訓(xùn)練對于大鼠心肌細(xì)胞自噬發(fā)生程度的影響

馬曉雯1，2常蕓1王世強2王菲1

1國家體育總局體育科學(xué)研究所（北京100061）

2上海體育學(xué)院

目的：探討不同強度不同時間耐力訓(xùn)練對大鼠心肌細(xì)胞自噬程度的影響，為運動強度和時間對心肌細(xì)胞自噬發(fā)生機制的探討提供依據(jù)。方法：選用48只健康成年雄性SD大鼠，隨機分為安靜對照組、中等強度訓(xùn)練組和大強度訓(xùn)練組，每組16只。分別以15.2 m/min速度5°坡度和28 m/min速度10°坡度進行跑臺訓(xùn)練，每周訓(xùn)練5天，每次訓(xùn)練1小時。于第8周和16周分別取各組大鼠8只進行體重稱量、超聲心動圖檢測，計算心臟重量指數(shù)（HWI）；取左心室壁用于HE染色，觀察心肌組織形態(tài)；制備超薄切片進行透射電鏡觀察，檢測自噬發(fā)生程度。結(jié)果：運動訓(xùn)練16周后，大強度組HWI顯著低于同期對照組及同組訓(xùn)練8周后（P＜0.05）。超聲心動圖顯示，訓(xùn)練8周后，中等強度組EF值顯著高于同期對照組（P＜0.05）；訓(xùn)練16周后，中等強度組LVPWD、LVPWS、EF均顯著高于同組訓(xùn)練8周后，大強度組EF值顯著低于同期對照組（P＜0.05）。HE染色結(jié)果顯示，大強度組心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重。透射電鏡檢測顯示，長時間大強度耐力訓(xùn)練使自噬小體增多，自噬程度增加。結(jié)論：耐力訓(xùn)練可引起心肌組織細(xì)胞良好的適應(yīng)性重塑，但大強度長時間耐力訓(xùn)練會導(dǎo)致心肌纖維形態(tài)異常，線粒體損傷聚變，自噬體增多等病理現(xiàn)象，構(gòu)成心肌損傷的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

運動強度；心肌細(xì)胞；自噬；耐力訓(xùn)練

自噬（autophagosome）概念提出以來，細(xì)胞自噬在不同細(xì)胞活動中的作用引起學(xué)者廣泛重視［1］。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在受到營養(yǎng)缺乏、氧化應(yīng)激、運動刺激、高溫、損傷等信號刺激時，由來源不明的游離雙層膜包裹衰老的蛋白質(zhì)或損傷細(xì)胞器形成自噬體，并與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，將內(nèi)容物降解為氨基酸、核苷酸、游離脂肪酸，合成新的大分子和ATP，從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)效益［2，3］。機體的細(xì)胞自噬一般處于一個較低的水平，但受到外界刺激時細(xì)胞自噬可能被激活。有研究顯示，適度的運動可以激活細(xì)胞自噬［4］。

心肌細(xì)胞是一種高度分化的終末細(xì)胞，可通過自噬提供能量，促進物質(zhì)循環(huán)以及細(xì)胞的自我更新，維持心臟功能和細(xì)胞存活［5］。正常、適度應(yīng)激的心肌細(xì)胞，自噬通過降解失活蛋白質(zhì)，產(chǎn)生氨基酸，為心肌發(fā)育、存活提供物質(zhì)基礎(chǔ)［6］，但自噬不足或過度會引起細(xì)胞功能異常［7］。

訓(xùn)練時間與強度對心肌細(xì)胞自噬影響鮮見報道。本研究在建立不同時間、強度訓(xùn)練的實驗動物模型基礎(chǔ)上，觀察心肌細(xì)胞形態(tài)和自噬現(xiàn)象，為運動強度和時間對心肌細(xì)胞影響機制的探討提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

8周齡SPF級健康雄性SD大鼠60只，體重為220 ±8 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXX（京）2012-0001。所有大鼠均在國家體育總局體育科學(xué)研究所ABSL-3級動物房飼養(yǎng)，大鼠常規(guī)分籠生活（4只/籠），飼喂標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料（由北京維通利華生物公司提供），自由飲食，室溫為22± 2℃，空氣濕度為45%～55%，每天光照12小時。

1.2 分組和訓(xùn)練方案

適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，所有大鼠進行7天適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練，訓(xùn)練方案：每天15 min、速度為15 m/min、坡度為0°。適應(yīng)性訓(xùn)練后，選取適應(yīng)跑臺訓(xùn)練的大鼠48只，隨機分為3組：安靜對照組、中等強度組和大強度組，每組16只。訓(xùn)練方案參照Bedford研究［8］：中等強度組跑臺速度為15.2 m/min，坡度為5°（攝氧量約58.4%±1.7% VO2max）；大強度組跑臺速度為28 m/min，坡度為10°（攝氧量約81.00%±3.5%VO2max），先以15 m/min速度跑5 min，隨后在5 min內(nèi)逐漸增至28 m/min，維持直至訓(xùn)練結(jié)束。每天14：00～17：00之間進行訓(xùn)練，每周訓(xùn)練5天，每天1小時。

1.3 超聲心動圖（ultrasonic cardiogram graph，UCG）測定

分別在8周和16周，每組各取大鼠8只稱重，腹腔注射10%水合氯醛（40 mg/100 g體重）麻醉后仰臥位固定，胸部備皮，小動物超聲探頭置于大鼠左前胸，連接超聲檢查儀（SXTCH2.0-1005.0592）進行超聲檢查。測量左心室后壁舒張期厚度（LVPWD）、左心室后壁收縮期厚度（LVPWS）、射血分?jǐn)?shù)（EF）。

1.4 取材與樣本制備

超聲心動圖檢測后，開胸迅速摘取心臟，經(jīng)滅菌生理鹽水清洗后，濾紙吸干并稱重，計算心臟重量指數(shù)（心臟重量/體重）。取心尖處1 mm3小塊放入固定液，用于電鏡檢測。切取左心室壁，經(jīng)多聚甲醛固定、石蠟包埋后，于石蠟切片機切取6 μm厚的石蠟切片待用。

1.4.1 心肌組織學(xué)樣本制備

將大鼠心室肌組織石蠟切片依次脫蠟、水化、蘇木素染色、分化、反藍(lán)、伊紅染色、脫水、透明、封片，制成HE染色切片。置于光學(xué)顯微鏡下觀察、采圖。

1.4.2 心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)樣本制備

大鼠左心室心尖部組織于4℃戊二醛磷酸緩沖液固定液固定24 h。常規(guī)脫水、浸透、包埋、染色后制成50～70 nm的超薄切片，透射電鏡（HITACHIH-7650）下觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)變化及自噬體的形成。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理，每組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用多因素方差分析法比較組間差異。

2 結(jié)果

2.1 心臟重量指數(shù)（Heart Weight Index，HWI）

由圖1可見，訓(xùn)練16周后，大強度組HWI顯著低于同期對照組及同組訓(xùn)練8周后（P＜0.05），中等強度組HWI略低于同期對照組，但不具有顯著性差異。

2.2 大鼠超聲心動圖結(jié)果（表1）

8周跑臺訓(xùn)練后，除中等強度組EF值顯著高于對照組外（P＜0.05），3組間LVPWD、LVPWS、EF無顯著性差異；16周跑臺訓(xùn)練后，除大強度組EF值顯著低于對照組外（P＜0.05），3組間LVPWD、LVPWS、EF無顯著性差異，中等強度組LVPWD、LVPWS、EF均顯著高于同組8周訓(xùn)練后（P＜0.05），大強度組、對照組LVPWD、LVPWS、EF與同組訓(xùn)練8周后相比無顯著變化。

2.3 心肌組織的形態(tài)（圖3）

無論訓(xùn)練8周還是16周后，對照組心肌細(xì)胞均排列整齊、橫紋清晰、細(xì)胞外間質(zhì)較少；中等強度組訓(xùn)練8周后心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞間隙正常，橫紋清晰，而16周后，心肌細(xì)胞體積稍增大，橫紋消失，細(xì)胞間隙變寬，部分肌纖維斷裂；大強度組訓(xùn)練8周和16周后心肌細(xì)胞均肥大、排列紊亂、細(xì)胞核增大、細(xì)胞間隙增大、橫紋消失、肌纖維斷裂，且16周肌纖維受損更為嚴(yán)重。

2.4 心肌細(xì)胞的形態(tài)（圖4、圖5）

8周的訓(xùn)練后，對照組心肌細(xì)胞排列整齊、明暗帶清晰、Z線完整、閏盤連接緊密、可見橋粒；中等強度組心肌細(xì)胞排列稍紊亂、線粒體代償性增生、偶見雙層膜結(jié)構(gòu)；大強度組肌纖維斷裂缺失、線粒體增多聚集、形態(tài)變異、線粒體嵴消失、電子密度增加、雙層膜結(jié)構(gòu)聚集增加、自噬程度增強。16周后各組變化趨勢與8周相同，中等強度組線粒體增生程度比8周高，自噬水平無顯著性差異；大強度組心肌細(xì)胞膜局部缺失，線粒體聚變，嵴斷裂，電子密度增高，自噬體增多，自噬程度更強（圖5箭頭所指處）。

3 討論

3.1 不同強度不同時間訓(xùn)練后心臟大體結(jié)構(gòu)與功能的改變

HWI是評價左心功能不全嚴(yán)重程度較有價值的指標(biāo)，比單純的體重更能反映心臟功能的改變［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠經(jīng)過16周大強度訓(xùn)練后，HWI不僅顯著低于對照組，也顯著低于其訓(xùn)練8周后（P＜0.05）。提示長時期大強度運動可能導(dǎo)致心臟供血功能下降。

UCG是臨床檢測心功能最常用的無創(chuàng)性技術(shù)，通過UCG中的LVPWD、LVPWS、EF，可以定量檢測心臟結(jié)構(gòu)功能狀態(tài)［10］。

8周跑臺訓(xùn)練后，不同強度組LVPWD、LVPWS無顯著性差異，表明8周的訓(xùn)練時間太短，不足以引起心臟結(jié)構(gòu)重塑、改變心臟供血能力；中等強度組EF值顯著高于對照組。Babette等［11］研究發(fā)現(xiàn)，長期運動訓(xùn)練導(dǎo)致運動員心臟做功效率高，功能儲備強，一般安靜時EF較普通人大，這與本實驗結(jié)果一致。原因可能是中等強度運動對大鼠左心室供血能力改善屬于適宜刺激強度，8周的中等跑臺訓(xùn)練增強了左心室射血能力，保障肌體供血充足。16周大強度跑臺訓(xùn)練后，EF值顯著低于對照組，可能與長時間大強度的訓(xùn)練造成心肌組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷有關(guān)，導(dǎo)致心肌射血功能下降。

運動員心臟的特征主要表現(xiàn)在形態(tài)與機能兩個方面，其中，運動性心臟肥大是運動員心臟主要形態(tài)變化，以左心室肥大為主，其肥大程度與運動強度和運動持續(xù)時間呈正相關(guān)［12］。本研究大鼠進行中等強度訓(xùn)練，16周后LVPWD、LVPWS和EF值顯著高于8周，提示伴隨著中等強度訓(xùn)練時間的延長，左心室壁厚度增加，心肌功能得到進一步改善，這與運動心臟的基本改變一致［12］。

3.2 不同強度不同時間訓(xùn)練后心肌細(xì)胞形態(tài)的改變

本研究對左心室壁進行HE染色，經(jīng)過16周訓(xùn)練，對照組心肌細(xì)胞排列整齊致密、結(jié)構(gòu)清晰、細(xì)胞外間質(zhì)較少；中等強度組心肌細(xì)胞排列稍紊亂、細(xì)胞間隙微量增大、橫紋模糊、有少量的肌纖維缺失；大強度組心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂、細(xì)胞間隙增大、肌纖維斷裂。這與李奕等［13］研究大鼠經(jīng)過7周的遞增負(fù)荷訓(xùn)練后心肌纖維形態(tài)的結(jié)果相似。

中等強度訓(xùn)練8周后心肌細(xì)胞排列整齊、細(xì)胞間隙正常、橫紋清晰，16周后心肌細(xì)胞肥大、間隙變寬、部分肌纖維斷裂或溶解。大強度訓(xùn)練8周后組織中存在少量空泡且細(xì)胞排列間隙增大，16周后出現(xiàn)紅細(xì)胞滲出現(xiàn)象、細(xì)胞核淺且不清楚，提示大鼠心肌出現(xiàn)了損傷。這可能是因為長期的大強度的訓(xùn)練造成心肌反復(fù)缺血缺氧，導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生病理性改變。劉澤廣等［14］類似的比較研究也指出運動組大鼠心肌纖維可見形態(tài)異常，著色不均勻，細(xì)胞邊界模糊不清，細(xì)胞排列不整齊。

3.3 不同強度不同時間訓(xùn)練后心肌細(xì)胞形態(tài)與自噬發(fā)生程度改變

細(xì)胞自噬屬于II型程序性細(xì)胞死亡，以自噬小體的形式呈現(xiàn)，溶酶體消化并形成自噬體，為其他細(xì)胞的生存與發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)。細(xì)胞自噬作為細(xì)胞內(nèi)的主要降解途徑，不僅清除代謝廢物，還作為一種動力循環(huán)系統(tǒng)，生成細(xì)胞更新和動態(tài)平衡所需的能量和物質(zhì)［15］。大量研究結(jié)果已證實細(xì)胞自噬是心肌對抗損傷、緩解細(xì)胞死亡的一種重要調(diào)節(jié)方式［16］，心肌細(xì)胞分化再生能力非常有限，自噬對于維持心臟功能和活力具有重要的作用［17］。適宜強度的運動訓(xùn)練可通過提高細(xì)胞自噬的激活而預(yù)防或緩解各種心臟疾病［18］。目前，應(yīng)用透射電鏡動態(tài)觀察自噬體的形成是檢測自噬發(fā)生的金標(biāo)準(zhǔn)［19］。因此，本研究利用透射電鏡觀察不同訓(xùn)練強度、時間大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)：

8周的訓(xùn)練后，對照組心肌細(xì)胞排列整齊致密、結(jié)構(gòu)清晰、閏盤連續(xù)、橋粒連接可見；中等強度組心肌細(xì)胞排列稍紊亂、有少量的肌纖維缺失、線粒體代償性增生、偶見自噬體雙層膜結(jié)構(gòu)；大強度組細(xì)胞膜破裂溶解、肌纖維紊亂、肌絲缺失、線粒體代償性增生、線粒體嵴消失、自噬體呈團分布。16周后各組呈現(xiàn)與8周相同的變化趨勢。適宜強度的運動訓(xùn)練可以上調(diào)細(xì)胞自噬水平，從而降解細(xì)胞內(nèi)的代謝廢物，維持細(xì)胞自身穩(wěn)態(tài)［20］。本研究大強度組自噬程度的變化趨勢與Campos［21］研究結(jié)果基本一致，可能是過量的大強度運動使機體自由基生成增多，線粒體氧化磷酸化水平降低，線粒體代償性增加，引起過度自噬，從而損害心肌結(jié)構(gòu)及心臟功能。

中等強度訓(xùn)練8周后心肌細(xì)胞排列整齊、肌小節(jié)完整、Z線清晰，16周后細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，線粒體大量增生，部分肌纖維斷裂或溶解，自噬體聚集出現(xiàn)。大強度訓(xùn)練16周后大鼠心肌細(xì)胞膜局部缺失、線粒體聚變、嵴斷裂、電子密度增高、線粒體被細(xì)胞膜包裹形成雙層膜結(jié)構(gòu)、形成自噬體增多。賈紹輝等［22］研究發(fā)現(xiàn)，短期運動在導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的同時可以激活心肌細(xì)胞的自噬，長期運動會降低心肌細(xì)胞凋亡，增強自噬的激活。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)與對照組相比，中等強度長期訓(xùn)練能有效地提高心肌線粒體數(shù)量與質(zhì)量，減少衰老或受損線粒體的數(shù)量，滿足運動時心輸出量的要求，形成運動性心臟重塑［23］，增強了心肌功能，有利于心臟供血供氧。

4 結(jié)論

中等強度耐力訓(xùn)練可引起心肌組織細(xì)胞良好的適應(yīng)性重塑，促進細(xì)胞自噬，增加心肌收縮功能，對于心肌纖維起到一定保護作用。但是大強度長時間耐力訓(xùn)練可以導(dǎo)致心肌纖維排列紊亂、斷裂，線粒體損傷、聚變，自噬體形成增多，構(gòu)成心肌損傷發(fā)生的病理基礎(chǔ)。實驗觀察到訓(xùn)練時間和訓(xùn)練強度可以影響心肌細(xì)胞自噬的發(fā)生過程，但是對于心肌細(xì)胞自噬發(fā)生的機制，我們將后續(xù)研究報道。

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Effects of Endurance Training on the Cardiomyocyte Autophagy in Rats

Ma Xiaowen1，2，Chang Yun1，Wang Shiqiang2，Wang Fei1
1 China Institute of Sport Science，Beijing，China 100061
2 Shanghai University of Sport，Shanghai，China 200438

Chang Yun，Email：changyun@ciss.cn

Objective To investigate the effects of endurance training with different intensity and duration on the cardiomyocyte autophagy of rats.Methods 48 SD rats were randomly divided into sedentary control group，moderate intensity exercise group and high intensity exercise group.Rats in the two exercise groups performed treadmill training 5 days per week，1 hour per day respectively for 8 weeks and 16 weeks at the speed and slope of 15.2m/min and 5°.The echocardiography was carried out for the rats respectively after 8 and 16 weeks of experiment and the heart weight index（HWI）was calculated according to echocardiogram and body weight.The histology of left ventricular wall was observed microscopically and the level of autophagy was determined by transmission electron microscope.Results The HWI in high intensity exercise group after 16 weeks of training was significantly lower than in sedentary control group（P＜0.05）and high intensity exercise group after 8 weeks of training（P＜0.05）.The LVPWD，LVPWS and EF in moderate intensity exercise group after 16 weeks of training were significantly greater than that in moderate intensity exercise group after 8 weeks of training，and in moderate intensity exercise group after 8 weeks of training were significantly greater than that in sedentary control group（P＜0.05）.The LVPWD，LVPWS and EF in high intensity exercise groupafter 16 weeks of training were significantly smaller than that in sedentary control group（P＜0.05）.The degree of autophagy exacerbated with the increasing of duration and intensity of endurance training.Conclusion Though the endurance training can well remodel the myocardial structure，however，long-term high intensity endurance training can cause the appearance of abnormal myocardial fiber and mitochondrial damaging fusion，and increase in level of autophagy.

endurance exercise，intensity，duration，myocardial autophagy

2015.04.03

國家體育總局體育科學(xué)研究所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費資助項目（14-01）

常蕓，Email：changyun@ciss.cn