蓋他病毒的診斷及研究進(jìn)展

鄒云婧，梁中銀，張 姍，鄭英帥，袁萬(wàn)哲,4,5*，孫繼國(guó),4,5*

（1．河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001；2．河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071001；3．天津市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，天津 300211；4．河北省獸醫(yī)生物技術(shù)工程技術(shù)研究中心， 河北 保定 071001；5．農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病病原生物學(xué)華北區(qū)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，河北 保定 071001）

蓋他病毒的診斷及研究進(jìn)展

鄒云婧1，梁中銀2，張 姍1，鄭英帥3，袁萬(wàn)哲1,4,5*，孫繼國(guó)1,4,5*

（1．河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001；2．河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071001；3．天津市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，天津 300211；4．河北省獸醫(yī)生物技術(shù)工程技術(shù)研究中心， 河北 保定 071001；5．農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病病原生物學(xué)華北區(qū)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，河北 保定 071001）

蓋他?。℅etah，GET）是由披膜病毒科甲病毒屬的蓋他病毒（Getah virus，GETV）引起的主要侵害豬和馬的一種蟲媒傳染病。蓋他病毒可引起母豬繁殖障礙，導(dǎo)致妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或弱仔。該病毒在亞洲地區(qū)、澳大利亞北太平洋沿岸地區(qū)分布廣泛，給家畜和養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了一定威脅。目前，針對(duì)蓋他病毒的研究還較少，為此，筆者概述了蓋他病毒的發(fā)現(xiàn)和分類、分子生物學(xué)特征、流行病學(xué)及臨床癥狀、診斷技術(shù)等，擬為該病的深入研究提供相關(guān)的理論參考。

蓋他病毒；分子生物學(xué)特性；流行病學(xué)及臨床癥狀；診斷技術(shù)

蓋他病毒為單鏈線形RNA，是披膜病毒科甲病毒屬的一個(gè)重要成員。蓋他病是由蓋他病毒引起的一種蟲媒傳染病，與人畜關(guān)系密切。病毒可通過(guò)蚊子傳播感染脊椎動(dòng)物，主要侵害豬和馬，如造成母豬繁殖障礙，妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或弱仔，并能引起馬的發(fā)熱、皮疹、后腿浮腫、淋巴結(jié)腫大等，同時(shí)還可感染鳥(niǎo)類、鼠類、爬行和兩棲動(dòng)物。該病毒廣泛分布于亞洲和北太平洋沿岸地區(qū)，如馬來(lái)西亞、中國(guó)、日本、韓國(guó)、菲律賓、泰國(guó)、澳大利亞等[1-3]，被列為重要的動(dòng)物源性病原體[4-6]。但目前，針對(duì)蓋他病毒的研究在國(guó)內(nèi)還較少，很多機(jī)理也有待于進(jìn)一步探索。為了更好地了解和掌握蓋他病毒相關(guān)知識(shí)，本文對(duì)該病毒的發(fā)現(xiàn)及分類、分子生物學(xué)特性、流行病學(xué)及臨床癥狀、診斷技術(shù)等方面加以綜述，以為今后對(duì)蓋他病毒的進(jìn)一步研究和完善人畜共患病公共衛(wèi)生體系及預(yù)警機(jī)制提供一定理論參考。

1 病毒的發(fā)現(xiàn)及分類

蓋他病毒于1956年首次在馬來(lái)西亞從雪背庫(kù)蚊（C.gelidus）體內(nèi)分離到，命名為Getah virus，原型株為MM2021[7]。此后，在日本、前蘇聯(lián)東部、東南亞及澳大利亞也相繼分離到此病毒[8]。自病毒被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其對(duì)人和動(dòng)物的傳染性與致病性引起了諸多學(xué)者的關(guān)注。研究顯示，在我國(guó)很多地區(qū)也有蓋他病毒的分布[9]。目前，我國(guó)已經(jīng)分離到的蓋他病毒病原體有10株，分別為：1964年，在海南省捕捉的庫(kù)蚊中分離到1株病毒，命名為M1，經(jīng)鑒定為GETV[10]；王煥琴等在對(duì)河北省蚊蟲進(jìn)行病毒分離鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)2個(gè)毒株屬于甲病毒屬成員，用甲病毒屬特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果呈陽(yáng)性，經(jīng)核酸序列測(cè)定證實(shí)從河北省蚊蟲標(biāo)本中分離到GETV（HB0234，HB0215），這也是首次在我國(guó)內(nèi)陸地區(qū)分離到該病毒[11]；2005年，從云南省分離到GETV 2株（YN0540，YN0542）；同年，在上海分離到GETV 4株(SH05-5、SH05-15、SH05-16、SH05-17)[9]；2006年，翟友剛等在甘肅省吸血蚊蟲中分離到1株GETV（GS10-2）[12]。近年來(lái)，在我國(guó)多數(shù)地區(qū)，豬蓋他病毒抗體陽(yáng)性率水平呈持續(xù)上升趨勢(shì)，夏季尤為嚴(yán)重[13]。

2 病毒的分子生物學(xué)特征

2．1 形態(tài)結(jié)構(gòu)與理化特性

蓋他病毒為單鏈線形RNA，病毒顆粒呈球形，直徑為60～70 nm，具有囊膜和纖突，有典型的甲病毒屬基因組結(jié)構(gòu)，包括糖蛋白外殼、雙層類脂膜及含有RNA的核心3個(gè)基本組成成分[8]。病毒對(duì)酸（pH3.0）、堿及有機(jī)溶劑（乙醚、氯仿等）敏感[14]；在1 mol/L的MgCI2狀態(tài)下，對(duì)50 ℃以上溫度敏感性較強(qiáng)，病毒在10 ℃環(huán)境中可存活3個(gè)月，4 ℃時(shí)毒力可保留6個(gè)月。GETV對(duì)4日齡以下的小白鼠具有病原性，病毒可在各種脊椎動(dòng)物和節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi)增殖，且能凝集鵝、雞、馬、鼠、兔等動(dòng)物的紅細(xì)胞。對(duì)Vero、BHK-21等細(xì)胞系易感。

2．2 基因組與編碼蛋白

病毒的基因組為單鏈線形RNA，長(zhǎng)度在11～12 kb之間，具有5' 帽子結(jié)構(gòu)和3' 多聚腺苷酸（Poly A）尾。其中，3' Poly（A）尾的存在與其RNA具有感染性直接相關(guān)?；蚪M可分為兩個(gè)不同的區(qū)段，包括非結(jié)構(gòu)區(qū)和結(jié)構(gòu)區(qū)。前者位于基因組5’端前2/3部分， 含有7 600個(gè)核苷酸，負(fù)責(zé)編碼nsP1、nsP2、nsP3和nsP4 4種非結(jié)構(gòu)蛋白，主要為病毒自身復(fù)制酶，與病毒自身轉(zhuǎn)錄和復(fù)制有關(guān)；后者位于基因組3’末端后1/3部分，含有4 100個(gè)核苷酸，用于編碼多種結(jié)構(gòu)蛋白如衣殼蛋白C、外膜糖蛋白E1、E2、E3和6K蛋白等[8,15-16]，3’UTR末端19 nt保守序列與病毒的復(fù)制和存活密切相關(guān)，為病毒存活所必需[17]。

2．3 保守區(qū)核苷酸序列

在甲病毒基因組核苷酸序列中均具有4個(gè)完全相同的序列區(qū)，稱序列保守區(qū)[18]。通常來(lái)說(shuō)，序列越保守，功能就相對(duì)越重要?；蚪M5’端帽子結(jié)構(gòu)后44個(gè)核苷酸圍成一個(gè)帶柄的環(huán)帶，稱為第一保守區(qū)，具有啟動(dòng)子的功能，負(fù)責(zé)在病毒基因組復(fù)制過(guò)程中負(fù)鏈RNA的合成；緊連第1保守區(qū)為第2保守區(qū)，由51個(gè)核苷酸組成，這些核苷酸形成與第1保守區(qū)相似的柄狀環(huán)，功能尚不清楚；在基因組49S與26SmRNA的接合部，由24個(gè)核苷酸組成第3保守區(qū)（連接部位保守序列）；第4保守區(qū)位于基因組3’末端，其后為 Poly（A）尾，由 19 個(gè)核苷酸組成，因而也稱19 核苷酸保守區(qū)。到目前為止，由于以上4個(gè)保守區(qū)序列僅在甲病毒基因組中被發(fā)現(xiàn)，與其他種屬病毒的保守序列無(wú)交叉，因此，這些保守區(qū)核苷酸序列成為鑒定甲病毒的有力的依據(jù)和指標(biāo)。

3 流行病學(xué)及臨床癥狀

蓋他病毒可對(duì)多種動(dòng)物造成良性耐受且具有自我限制性的疾病。傳播媒介隨氣候和地理的變化而改變，蚊類尤其是刺擾伊蚊（Aedes vexans）和三帶喙庫(kù)蚊（Culex tritaeniorh ynchus）為其主要傳播媒介[3]。病毒能在媒介昆蟲體內(nèi)或培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞中增殖，在自然宿主中主要表現(xiàn)為高滴度病毒血癥或無(wú)任何癥狀，但經(jīng)蚊蟲傳播給人或動(dòng)物后，可引起病毒病的流行。豬和馬是其主要宿主，且豬更為易感。豬感染該病具有明顯的季節(jié)性，主要以2-10月多發(fā)，4月份陽(yáng)性率開(kāi)始上升，在病毒蚊蟲媒介較多的7-9月達(dá)到高峰。GETV具有垂直傳播的特性，可經(jīng)胎盤感染傳遞給子代，因此，本病毒是導(dǎo)致初生仔豬死亡的重要原因之一。

GETV可引起豬的疾病，病豬癥狀表現(xiàn)為精神不振、食欲減退或消失、全身震顫、體溫升高、腹瀉、體表發(fā)紅、共濟(jì)失調(diào)等，嚴(yán)重者還可出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，甚至衰竭死亡。懷孕母豬感染蓋他病毒后一般不出現(xiàn)臨床癥狀，但會(huì)引起繁殖障礙，導(dǎo)致胚胎死亡并被吸收，從而降低母豬產(chǎn)仔數(shù)；妊娠前期感染該病毒可導(dǎo)致胚胎死亡，母豬返情，產(chǎn)死胎等。對(duì)腦、肺、腎、腸等病變組織進(jìn)行病毒分離及血清學(xué)鑒定，結(jié)果為GETV陽(yáng)性，并能在ESK細(xì)胞中出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）作用，對(duì)無(wú)菌豬肌肉注射，其人工感染結(jié)果與自然發(fā)病病例相同，證明本病毒對(duì)豬具有感染性和致病性。

4 診斷方法

4．1 血清學(xué)檢驗(yàn)

血清學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)，包括酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）、血凝抑制、血清中和試驗(yàn)(NT)、免疫熒光技術(shù)等多種血清學(xué)試驗(yàn)均可對(duì)GETV的抗原及抗體進(jìn)行鑒定及診斷[15]。該檢測(cè)方法靈活性大，在快速鑒定應(yīng)用等方面優(yōu)勢(shì)較明顯。

4.1.1 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù) 酶聯(lián)免

疫吸附技術(shù)（ELISA）是一種用酶標(biāo)記抗原或抗體的方法，即將抗原、抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用原理有機(jī)地結(jié)合起來(lái)的技術(shù)，可敏感地檢測(cè)體液中微量的特異性抗原或抗體，具有靈敏、快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢(shì)，尤其適用于大批量樣品檢測(cè)，是應(yīng)用最廣的免疫學(xué)技術(shù)。

4.1.2 間接血凝抑制試驗(yàn) 隨著我國(guó)規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，人們對(duì)GETV的診斷提出了更高的要求，但由于客觀條件所限，一些對(duì)于技術(shù)要求較高的診斷方法還較難普及運(yùn)用，相比之下，血凝抑制試驗(yàn)具有方便、快捷的特點(diǎn)，實(shí)用性較高。

4.1.3 血清中和試驗(yàn) 中和試驗(yàn)(NT)是將抗體與毒素或病毒相結(jié)合，從而導(dǎo)致毒素失去毒性或者病毒失去傳染力的一種免疫學(xué)試驗(yàn)。試驗(yàn)多采用細(xì)胞培養(yǎng)，具有方便、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)。中和抗體具有高特異性，且可維持較長(zhǎng)時(shí)間。目前，應(yīng)用最廣泛的是免疫熒光中和試驗(yàn)，具體操作是在定量病毒中加入不同稀釋度的血清。

4.1.4 免疫熒光技術(shù) 免疫熒光技術(shù)包括直接免疫熒光和間接免疫熒光2種方法。該方法優(yōu)點(diǎn)是快速、敏感、特異，與放射免疫法相比，熒光免疫法無(wú)放射性污染，并且易于操作，便于推廣；缺點(diǎn)是成本較高。

4.1.5 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)為可溶性抗原與相應(yīng)抗體在含有電解質(zhì)的半固體凝膠(瓊脂或瓊脂糖)中進(jìn)行的一種沉淀試驗(yàn)，即可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合，兩者在比例適當(dāng)并有電解質(zhì)存在及一定的溫度條件下，經(jīng)一定的時(shí)間，可形成肉眼可見(jiàn)的沉淀物。該法操作簡(jiǎn)單，但敏感性較差。

4．2 分子生物學(xué)技術(shù)

4.2.1 RT-PCR技術(shù) RT-PCR又稱逆轉(zhuǎn)錄PCR，是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄（RT）與cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。其原理是根據(jù)病毒DNA序列，設(shè)計(jì)特異性引物來(lái)擴(kuò)增樣品中待檢測(cè)病毒的DNA片段，再通過(guò)電泳、染色把它顯示出來(lái)。RTPCR技術(shù)高效、靈敏、特異，用途廣泛。該方法可用于檢測(cè)細(xì)胞/組織中基因表達(dá)水平、細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。

4.2.2 用熒光蛋白基因構(gòu)建復(fù)制子缺損的表達(dá)載體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)分析梁國(guó)棟[19]等利用此法，通過(guò)構(gòu)建出的的質(zhì)粒來(lái)對(duì)用來(lái)蓋他病毒進(jìn)行定性或定量檢測(cè)分析[20]。

5 展望

目前，對(duì)蓋他病毒的研究仍較有限，很多機(jī)制機(jī)理尚不清楚，其危害及影響程度亦不可預(yù)知。而近年來(lái)，在我國(guó)多數(shù)地區(qū)的蚊蟲中相繼分離到GETV，因此，有必要對(duì)GETV加強(qiáng)研究力度，明確其發(fā)病機(jī)理，診治及防控方法，同時(shí)建立完善的GETV乃至其他蟲媒病毒的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，加強(qiáng)對(duì)GETV的分離、基因特性及毒株抗原性研究，以便制備有效疫苗，對(duì)其危害作出評(píng)估，為科學(xué)防控GET提供依據(jù)。

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鄒云婧（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)，E-mail:yunjingzouz@163.com

袁萬(wàn)哲（1978-），男，副教授，博士，E-mail: yuanwanzhe@126.com

孫繼國(guó)（1956-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，E-mail: vaccine2000@126.com