TRF1、TRF2及POT1 mRNA在前列腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

王英磊 張瑩瑩 孟 琳 肖 琳 范成娟 李 磊 張任亞 趙戰(zhàn)魁

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科，山東 濟(jì)寧 272000)

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TRF1、TRF2及POT1 mRNA在前列腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

王英磊 張瑩瑩1孟 琳 肖 琳 范成娟 李 磊2張任亞2趙戰(zhàn)魁

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科，山東 濟(jì)寧 272000)

目的 探討端粒重復(fù)序列結(jié)合蛋白質(zhì)(TRF)1、TRF2和端粒保護(hù)蛋白1(POT1)mRNA在前列腺癌(PCa)組織中的表達(dá)及臨床意義。方法 選擇行尿道前列腺電切術(shù)切除的PCa患者中心組織標(biāo)本55例作為實(shí)驗(yàn)組；同期選擇55例前列腺增生(BPH)患者病理組織標(biāo)本作為對照組。通過免疫組化法測定PCa患者腫瘤組織中TRF1、TRF2和POT1 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組TRF1 mRNA明顯高于對照組(P<0.05)，兩組TRF2 mRNA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組POT1 mRNA明顯高于對照組(P<0.05)。結(jié)論 PCa患者組織中TRF1和POT1 mRNA表達(dá)上升，說明它們的高表達(dá)可能與PCa發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；而PCa患者組織中TRF2的mRNA表達(dá)并沒有發(fā)生明顯變化，其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

端粒重復(fù)序列結(jié)合蛋白質(zhì)1；端粒重復(fù)序列結(jié)合蛋白質(zhì)2；端粒保護(hù)蛋白1；前列腺癌

目前對于前列腺癌(PCa)的致病機(jī)制并未完全闡明，但研究發(fā)現(xiàn)端粒重復(fù)序列結(jié)合蛋白質(zhì)(TRF)1、TRF2和端粒保護(hù)蛋白(POT)1與顱內(nèi)腫瘤、胃癌等多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)〔1〕。本文通過測定PCa患者腫瘤組織中TRF1、TRF2和POT1的表達(dá)，分析其與PCa的關(guān)系，從而深入了解PCa的發(fā)病及轉(zhuǎn)移機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年9月至2015年3月我院行尿道前列腺電切術(shù)切除的PCa中心組織標(biāo)本55例作為實(shí)驗(yàn)組，年齡56～85〔平均(68.4±6.2)〕歲。所有患者均符合第28屆歐洲泌尿外科學(xué)會制定的《歐洲泌尿外科學(xué)會前列腺癌診療指南》〔2〕的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且術(shù)后病理組織切片確診為前列腺癌，術(shù)前均未進(jìn)行內(nèi)分泌治療、化療以及放療。同期選擇55例前列腺增生(BPH)患者病理組織標(biāo)本作為對照組，年齡53～82〔平均(66.9±5.7)〕歲。兩組患者年齡等基線資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。所有實(shí)驗(yàn)對象均知情同意，且經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要器材和試劑 Trizol(大連Takara工程有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；熒光定量PCR儀(瑞士羅氏lightCycler 96熒光定量PCR)；PCR試劑(2×Taq Mster Mix，金斯瑞生物科技有限公司)；超微量分光光度計(jì)(美國Thermo Scientific NanoDrop 2000)；凝膠成像儀(BIO-RAD)。

1.3 方法 (1)剪取100 mg病理組織于勻漿器中，加入1 ml Trizol試劑，在冰上做勻漿處理。然后將勻漿液轉(zhuǎn)入1.5 ml的EP管中，RNA溶于10 μl 0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水中，58℃助溶5 min。測定RNA濃度，然后用超微量分光光度計(jì)測定其A260/A280比值以及濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書步驟合成cDNA。(2)按照引物設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)TRF1、TRF2、POT1和β-actin引物，通過Blast軟件分析，去除與其他基因同源的系列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25 μl，反應(yīng)參數(shù)：2×Taq Mster Mix(12.5 μl)；上、下游引物各1 μl(0.25 μmol/L)；cDNA(2 μl)，ddH2O(8.5 μl)，共40個循環(huán)。PCR過程中加一個無模板空白對照組。所有檢測均由相關(guān)的專業(yè)人士嚴(yán)格按照試劑盒說明書的要求步驟進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 兩組的TRF1、TRF2和POT1的mRNA表達(dá)水平采用熒光定量PCR的CT值與β-actin mRNA的CT值之差(ΔCT)表示，采用SPSS19.0軟件行Shapiro-Wilk檢驗(yàn)其是否符合正態(tài)性：滿足正態(tài)性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不滿足正態(tài)性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者TRF1表達(dá)水平的比較 兩組病理組織TRF1的ΔCT值進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其均不滿足正態(tài)性(W=0.824,P=0.000；W=0.875，P=0.000)，對照組患者25%、50%和75%的ΔCT值分別為0.473、1.017、2.015；實(shí)驗(yàn)組分別為0.815、1.652、3.482。Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組TRF1的ΔCT明顯高于對照組(Z=3.413，P=0.001)。

2.2 兩組患者TRF2表達(dá)水平的比較 兩組病理組織TRF2的ΔCT值進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其均不滿足正態(tài)性(W=0.886,P=0.001；W=0.934，P=0.009)，對照組患者25%、50%和75%的ΔCT值分別為6.273、8.147、9.775；實(shí)驗(yàn)組分別為5.842、8.505、10.248。秩和檢驗(yàn)分析兩組患者ΔCT無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Z=1.726，P=0.091)。

2.3 兩組患者POT1表達(dá)水平比較 兩組病理組織POT1的ΔCT值進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其均不滿足正態(tài)性(W=0.956,P=0.061；W=0.962，P=0.168)，兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組POT1的ΔCT(4.598±1.157)明顯高于對照組(3.457±1.014)(t=3.491，P=0.001)。

3 討 論

端粒在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮十分重要的作用，主要通過端粒的縮短限制細(xì)胞的增殖從而抑制癌變，然而端粒的過分縮短又會導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，而增加細(xì)胞癌變概率，因此調(diào)節(jié)端粒功能是治療癌癥的一個新的研究方向〔3〕。TRF1和TRF2對端粒的結(jié)構(gòu)和功能起很大的作用，影響腫瘤細(xì)胞中端粒長度的維持和延長〔4〕；而POT1通過對端粒酶、端粒長度的調(diào)節(jié)等方式影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和細(xì)胞凋亡〔5〕。

TRF1與TRF2均為端粒DNA重復(fù)序列結(jié)合因子。其中TRF1通過二聚體的形式結(jié)合在T環(huán)上，通過控制在端粒DNA上結(jié)合的數(shù)量來調(diào)節(jié)端粒酶在端粒末端的作用。此次實(shí)驗(yàn)說明TRF1基因的過度表達(dá)可能會促進(jìn)PCa的發(fā)生和發(fā)展，這與Lee〔6〕研究發(fā)現(xiàn)TRF1基因在癌細(xì)胞中的表達(dá)高于正常細(xì)胞結(jié)果一致。而TRF2通過二聚體的形式結(jié)合在D環(huán)上，通過維持端粒功能性單鏈3'-G尾的穩(wěn)定來防止其自身融合，從而保護(hù)了染色體的完整性。本研究發(fā)現(xiàn)TRF2基因表達(dá)與PCa發(fā)生發(fā)展關(guān)系并不密切。這與全曉紅〔7〕研究發(fā)現(xiàn)TRF2在食管癌與正常組織中表達(dá)沒有差異相一致的，有待進(jìn)一步深入研究POT1可以和端粒DNA單鏈發(fā)生特異性結(jié)合，使端粒的3'端單鏈突出并折回，插入其內(nèi)部某一重復(fù)序列的區(qū)域，替換出自身鏈，然后形成穩(wěn)定T環(huán)結(jié)構(gòu)，覆蓋于端粒的末端，使其避免DNA修復(fù)酶降解以及末端融合，從而保護(hù)端粒的結(jié)構(gòu)和功能完整性。目前對于PCa組織中POT1表達(dá)的研究并不多見。本研究發(fā)現(xiàn)POT1 mRNA表達(dá)上升與PCa發(fā)生關(guān)系密切。這可能是POT1的mRNA表達(dá)增加后POT1蛋白表達(dá)減少，導(dǎo)致T-loop不穩(wěn)，引起DNA損傷修復(fù)過度活化，造成細(xì)胞染色體畸變，甚至癌基因激活促進(jìn)腫瘤的發(fā)生〔8〕。

綜上所述，PCa患者組織中TRF1和POT1 mRNA表達(dá)上升，說明它們的高表達(dá)可能與PCa發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；而PCa患者組織中TRF2 mRNA表達(dá)并沒有發(fā)生明顯變化。

1 張夢云,周京國,青玉鳳,等.端粒重復(fù)序列結(jié)合蛋白質(zhì)1與2在原發(fā)性干燥綜合征患者外周血單個核細(xì)胞中的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.中華臨床醫(yī)師雜志:電子版,2013;7(21):9485-8.

2 謝立平,陳 弘.2013年歐洲泌尿外科學(xué)會年會前列腺癌診斷治療進(jìn)展〔J〕.中華泌尿外科雜志,2013;34(10):727-31.

3 王英磊,逄淑超,張瑩瑩,等.TRF1、TRF2和POT1基因mRNA在前列腺癌組織中的表達(dá)〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015;15(23):4518-20,4524.

4 周建斌,胡 華,盛順良,等.端粒蛋白TRF1、TRF2和TIN2在宮頸鱗癌中的表達(dá)及意義〔J〕.中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志,2013;41(2):124-6.

5 席小英,張三元.醋酸丙氨瑞林對人子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤的作用以及端粒保護(hù)蛋白1表達(dá)的影響〔J〕.中華臨床醫(yī)師雜志:電子版,2015;9(7):1152-6.

6 Lee K.Abstract 579:The interaction of ZSCAN4 with TRF1:effects on regulation of telomere elongation in cancer cells〔J〕.Cancer Res,2013;73(6):579.

7 全曉紅.端粒重復(fù)序列結(jié)合因子1和2及端粒保護(hù)蛋白1基因在食管癌中的表達(dá)〔J〕.中國醫(yī)學(xué)工程,2014;22(2):60-1.

8 青玉鳳,周京國,邢 艷,等.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個核細(xì)胞端粒保護(hù)蛋白TPP1及POT1基因表達(dá)的研究〔J〕.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2010;14(1):56-9.

〔2015-12-18修回〕

(編輯 袁左鳴)

濟(jì)寧市科技計(jì)劃(醫(yī)療衛(wèi)生)項(xiàng)目(No.2014jnjc15)

孟 琳(1960-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事泌尿系腫瘤研究。

王英磊(1978-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事泌尿系腫瘤研究。

R739

A

1005-9202(2016)21-5234-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.008

1 濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科 2 濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科