甘露聚糖結(jié)合凝集素相關(guān)蛋白19(MAp19)的研究現(xiàn)狀①

李　婷　李　萍

(河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院病原生物與免疫學(xué)研究所，張家口075000)

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·專(zhuān)題綜述·

甘露聚糖結(jié)合凝集素相關(guān)蛋白19(MAp19)的研究現(xiàn)狀①

李婷李萍

(河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院病原生物與免疫學(xué)研究所，張家口075000)

補(bǔ)體系統(tǒng)是機(jī)體固有免疫的重要組成部分，可通過(guò)經(jīng)典途徑、凝集素途徑和替代途徑而被激活，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[1,2]。啟動(dòng)凝集素途徑活化的第一個(gè)補(bǔ)體組分是甘露糖結(jié)合凝集素(Mannan-binding lection，MBL)/纖維膠原素(Ficolin，F(xiàn)CN)與MBL-相關(guān)絲氨酸蛋白酶(Mannose-binding lectin associated serine protease，MASP)結(jié)合形成的復(fù)合物。MASP家族由MASP-1、MASP-2、MASP-3絲氨酸蛋白酶及MAp19和MAp44非酶蛋白組成，其中MASP-2是參與凝集素途徑活化的重要組分。MAp19是MASP-2的剪切體，其氨基酸序列分析顯示僅比MASP-2羧基端前兩個(gè)功能區(qū)多四個(gè)氨基酸殘基。MAp19能與MBL結(jié)合，但無(wú)催化功能，它是否與MASP-2存在競(jìng)爭(zhēng)抑制作用尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。此外發(fā)現(xiàn)MAp19與腎病、骨髓瘤以及SARS等疾病存在一定相關(guān)性。

1MASP基因及其編碼產(chǎn)物

人MASP-1、MASP-3和MAp44基因位于染色體3q27上，由18個(gè)外顯子組成：其中外顯子1～8、10～11編碼MASP-1/3的N端非催化結(jié)構(gòu)域(即信號(hào)肽-CUB1-EGF-CUB2-CCP1- CCP2)；外顯子13～18和外顯子12分別編碼MASP-1和MASP-3的肽激活區(qū)，即連接區(qū)(Link region)SP結(jié)構(gòu)域和C末端mRNA非翻譯區(qū)[3]。MAp44則是由MASP-1/3N端非催化結(jié)構(gòu)域(即信號(hào)肽-CUB1-EGF-CUB2-CCP1-CCP2)和外顯子9編碼的17個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成[4]。人MASP-2和MAp19基因位于染色體1p36上，由12個(gè)外顯子組成：其中顯子1和部分外顯子2編碼一段由15個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的信號(hào)肽，外顯子3和其余外顯子2編碼CUB1結(jié)構(gòu)域，外顯子4編碼EGF結(jié)構(gòu)域，外顯子6、7編碼CUB2結(jié)構(gòu)域，外顯子8～11編碼CCP1和CCP2結(jié)構(gòu)域，外顯子12編碼MASP-2的肽激活區(qū)，即SP結(jié)構(gòu)域和C末端mRNA非翻譯區(qū)[5]。MASP-2由686個(gè)氨基酸殘基組成；MAp19是由185個(gè)氨基酸殘基組成的MASP-2剪接體，包括MASP-2N端CUB1、EGF結(jié)構(gòu)域及C末端4個(gè)由外顯子5編碼的氨基酸殘基(即EQSL：谷氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、精氨酸)和mRNA非編碼區(qū)[6]。此外采用qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：編碼MASP-2的mRNA只在肝臟中表達(dá)；而編碼MAp19的mRNA除在肝臟中高表達(dá)外，在腎臟和甲狀腺中也有表達(dá)。免疫組化檢測(cè)也證實(shí)MAp19在肝臟中高表達(dá)，在腎臟和甲狀腺中低表達(dá)[7]。

2MAp19的主要生物學(xué)特性

MAp19是MASP家族成員之一，它也能與MBL/FCN結(jié)合形成大分子復(fù)合物。但上述大分子復(fù)合物沒(méi)有酶活性，不能啟動(dòng)凝集素途徑活化。在MAp19基因敲除小鼠中研究發(fā)現(xiàn)：外顯子MAp19可以通過(guò)與小鼠MASP-2 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合MBL的方式，使凝集素途徑的活化下調(diào)或減弱[8]。但在人體正常生理水平下，MAp19對(duì)凝集素途徑的活化沒(méi)有減弱或抑制作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)：血漿中絕大多數(shù)MASP-2以MBL/FCN-MASP-2復(fù)合物形式存在；而血漿中80%的MAp19以游離二聚體或四聚體形式存在，只有20%的MAp19能與MBL/FCN結(jié)合形成大分子復(fù)合物[10]。在MASP家族五個(gè)成員中，MAp19與MBL/FCN之間結(jié)合的親和力最低，這可能與其缺少CUB2結(jié)構(gòu)域有關(guān)[11]。目前認(rèn)為，能夠通過(guò)與MASP-2競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合MBL抑制凝集素途徑活化的MASP家族成員，可能是MAp44而不是MAp19[12,13]。

3MAp19在血、尿液中含量變化及其與疾病的關(guān)系

3.1MAp19在血、尿液中含量變化Seyfarth等[14]檢測(cè)了104例丹麥人血漿MAp19的含量，平均水平為217 ng/ml(26～675 ng/ml)，而同批次樣本中MASP-2的含量是(534±213)ng/ml。若以質(zhì)量為計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)，MAp19(平均217 ng/ml)比MASP-2(平均534 ng/ml)低。當(dāng)轉(zhuǎn)換為摩爾濃度時(shí)，MAp19(19.1 kD)為11 nmol/L，MASP-2(74.2 kD)為7 nmol/L。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)MASP -2的水平呈對(duì)數(shù)正態(tài)分布，而MAp19的水平既不呈正態(tài)分布也不呈對(duì)數(shù)正態(tài)分布，以上證實(shí)MAp19和MASP-2水平無(wú)相關(guān)性。比較同一樣本的血清和血漿，發(fā)現(xiàn)血漿中MAp19的含量略微高于血清(平均值分別為258 ng/ml與205 ng/ml)，且兩者的值呈高度的相關(guān)性(r2=0.88)。

MAp19的分子量很小，理論上即使是二聚體的形式也可以被腎小球?yàn)V過(guò)。對(duì)5個(gè)丹麥男性血漿和尿液樣本中MAp19的含量分析發(fā)現(xiàn)[15]：血漿中MAp19的平均值為204 ng/ml，24 h尿液中MAp19的平均值為63 ng/ml；而同一批樣本血液中MASP-2的平均含量是390 ng/ml，而尿液中MASP-2的平均含量小于1 ng/ml，低于檢測(cè)下限。但在同一人中，血液和尿液中MAp19的含量沒(méi)有相關(guān)性。根據(jù)人總的尿液排出體積計(jì)算MAp19在24 h排出量的平均值約為127 μg，總的排出量與血漿中的濃度也沒(méi)有相關(guān)性。進(jìn)一步通過(guò)蛋白印跡發(fā)現(xiàn)尿液中的MAp19被部分降解，且降解的片段來(lái)源于N端。這說(shuō)明MAp19并非全部直接從腎小球?yàn)V過(guò)到尿液當(dāng)中，有可能存在未知的代謝機(jī)制。

3.2MAp19與疾病的關(guān)系

3.2.1MAp19與腎病Musante等[16]通過(guò)色譜結(jié)合二維電泳的方法分離局灶節(jié)段性腎小球硬化(Focal segmental glomurular sclerosis，F(xiàn)SGS)患兒中的血清蛋白，復(fù)性后通過(guò)大鼠腎小球生物濾過(guò)法從幾百種蛋白中獲得十種蛋白，進(jìn)一步通過(guò)質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)其中有6種蛋白會(huì)影響腎小球的通透性，MAp19是其中之一。

Kang等[17]發(fā)現(xiàn)腎細(xì)胞癌患者尿液中MAp19要明顯高于健康人。用EDTA預(yù)處理尿透析液，發(fā)現(xiàn)可以增加MAp19的復(fù)性，表明MAp19是一種鈣結(jié)合蛋白。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)重組MAp19對(duì)草酸鈣結(jié)晶的形成有強(qiáng)烈的抑制作用，且呈濃度依賴(lài)性。原因可能是MAp19羧基端富含酸性氨基酸的區(qū)域(天冬氨酸和谷氨酸)可以為與鈣離子的結(jié)合提供理想的靜電環(huán)境。因而推測(cè)存在于尿液中的MAp19可通過(guò)阻止草酸鈣在尿液中產(chǎn)生的作用方式，抑制腎結(jié)石的形成。

Aregger等[18]采用差異熒光凝膠電泳和蛋白質(zhì)譜分析行心肺旁路手術(shù)患者術(shù)后的尿液樣本，比較差異調(diào)節(jié)蛋白發(fā)現(xiàn)：術(shù)后患者尿液中MAp19的含量呈約3倍上調(diào)。

3.2.2MAp19與多發(fā)性骨髓瘤房亞哲等[19]應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)患者尿液中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。經(jīng)過(guò)三氯乙酸沉淀法提取尿液蛋白質(zhì)后進(jìn)行雙向凝膠電泳，結(jié)果篩選出57個(gè)差異蛋白點(diǎn)，43個(gè)在MM組上調(diào)，14個(gè)下調(diào)。對(duì)其中30個(gè)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，鑒定出MAp19是MM患者尿液中的差異蛋白質(zhì)，且為上調(diào)蛋白。這提示MAp19可能在MM患者的免疫防御及免疫監(jiān)視中起重要作用。

3.2.3MAp19與SARS劉俊麗等[20]以全長(zhǎng)SARS-CoVN為誘餌蛋白從人胎肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選相互作用的分子，發(fā)現(xiàn)SARS-CoVN蛋白與MAp19相互作用，進(jìn)一步利用免疫共沉淀試驗(yàn)驗(yàn)證二者間的關(guān)系。用Western blot 檢測(cè)SARS-CoV N蛋白對(duì)MAp19表達(dá)量的影響。證實(shí)SARS-CoV N蛋白與MAp19的確能夠在細(xì)胞內(nèi)相互作用形成復(fù)合物，且SARS-CoV N能夠顯著提高M(jìn)Ap19的表達(dá)量，進(jìn)而推測(cè)MAp19可能與SARS(Severe Acute Respiratory Syndromes)的發(fā)病有一定的相關(guān)性。

3.2.4MAp19與麻風(fēng)病Boldt等[21]通過(guò)分析219例巴西麻風(fēng)患者和495例健康志愿者血中MASP-2和MAp19的含量，并與之前報(bào)道的丹麥健康志愿者血中MASP-2和MAp19對(duì)比發(fā)現(xiàn)，血漿MASP-2水平的相對(duì)降低和MAp19水平的相對(duì)升高會(huì)增加人對(duì)麻風(fēng)病的易感性，尤其是瘤型麻風(fēng)病。因此MASP-2的基因型和血漿MASP-2、MAp19的水平有可能作為預(yù)測(cè)麻風(fēng)病進(jìn)展的生物學(xué)標(biāo)志物之一。

4總結(jié)

MAp19是MASPS家族成員之一，起始于補(bǔ)體的活化研究。MAp19主要表達(dá)于肝臟，在腎臟中也可少量表達(dá)，但在尿液中的含量較高。已有研究發(fā)現(xiàn)MAp19與一些疾病相關(guān)，分析血液和尿液中MAp19的含量可以為臨床多種疾病的診斷提供參考依據(jù)。MAp19生物學(xué)功能如何？是簡(jiǎn)單的腎小球?yàn)V過(guò)還是有其他的通過(guò)機(jī)制？是否具有調(diào)節(jié)和維持鈣離子體內(nèi)平衡的生理功能等仍需澄清。目前對(duì)其研究十分有限，更沒(méi)有可靠的分析評(píng)價(jià)MAp19的方法。建立行之有效的檢測(cè)方法，進(jìn)一步分析MAp19的作用及其含量變化與臨床相關(guān)疾病的關(guān)系，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值和良好的市場(chǎng)前景。

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[收稿2015-05-16修回2015-07-20]

(編輯許四平)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.030

作者簡(jiǎn)介：李婷(1987年-)，女，碩士，主要從事固有免疫分子的檢測(cè)與臨床方面的研究，E-mail：m15350739758@163.com。 通訊作者及指導(dǎo)教師：李萍(1968年-)，女，碩士，教授，主要從事固有免疫分子的檢測(cè)與臨床方面的研究，E-mail：zjkliping@163.com。

中圖分類(lèi)號(hào)R392.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)07-1062-03

①本文為河北北方學(xué)院校級(jí)重大課題(ZD201313)。