蠶絲及其衍生材料在運動損傷修復中的應用

汪斯衡 蔣佳 陳世益

復旦大學附屬華山醫(yī)院運動醫(yī)學與關(guān)節(jié)鏡外科（上海 200040）

蠶絲及其衍生材料在運動損傷修復中的應用

汪斯衡 蔣佳 陳世益

復旦大學附屬華山醫(yī)院運動醫(yī)學與關(guān)節(jié)鏡外科（上海 200040）

蠶絲作為古老的生物材料，在紡織及醫(yī)學中已有廣泛應用，而近年來新技術(shù)新工藝的發(fā)展也為其在組織修復，尤其是運動損傷修復中的應用帶來新的可能，其強度和生物相容性也提示了其在硬組織修復中的可能性。本文綜述了蠶絲的生物特性及其分子生物學基礎(chǔ)，并總結(jié)了新工藝的產(chǎn)生為其在組織修補方面帶來的可能性。

蠶絲；組織修補；生物力學；生物相容性

蠶絲作為人類最早使用的自然高聚物，已經(jīng)有3.8億年左右的歷史。蠶絲長久以來就被用于服裝、紡織等各方面，由于其獨特的強度、疏水性以及色澤等，其織物一直深受歡迎。近來，不少研究注意到其在強度、親水性等各方面的獨特性質(zhì)并將其用于組織修復。在運動損傷的修復中，蠶絲及其衍生物的運用在近幾年取得了許多成果。本文著重說明蠶絲其特性在組織修復中的優(yōu)勢以及蠶絲和其衍生物在運動損傷修復中的新成果。

1 蠶絲的特性

蠶絲具有良好的延展力，也具有高度的抗張能力。以家蠶的蠶絲為例，受到張力時，其延展程度可以達到全長的18%，能夠承受的最大張力可以達到0.6 GPa，強度可達70 MJ·m-3[1]。同時具有如此大的延展性和抗張性是絕大多數(shù)人工合成材料無法達到的。其延展性目前比較公認的原理是其中納米纖絲的排列可在受力下發(fā)生改變，并且能夠在不受力時恢復原狀[2]。其力學強度目前比較公認的原理是絲素蛋白中大量存在的β片層二級結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)排列整齊，其間具有較強的相互作用[3]。

由于蠶絲蛋白固有的物理特性與其二級和三級結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，所以其制備也有一定的要求。人工生產(chǎn)蠶絲需要先將蠶絲溶解制備成水溶液，經(jīng)過脫水、酸化、結(jié)晶等工序完成。其中涉及到的一個重要步驟是如何使水溶液中具有α螺旋二級結(jié)構(gòu)的絲素蛋白結(jié)晶化（crystallize）形成β片層結(jié)構(gòu)。這涉及到晶核形成以及聚集生長兩個時相，一些金屬離子，如鉀離子和銅離子在這一過程中起到重要作用[4]。

自然的蠶絲產(chǎn)生過程存在兩個相間的轉(zhuǎn)變，第1個相是粘性水溶液相，此時的絲素蛋白處于從無序到有序變化的過程中，二級結(jié)構(gòu)以α螺旋為主。第2個時相為晶化相，其特點是晶格排列規(guī)整，具有疏水性，二級結(jié)構(gòu)以β片層為主[5]。由于兩個時相截然不同的物理性質(zhì)，其后的生物應用也受此啟發(fā)分為兩個不同的方向，一是運用晶化相為主的應用，主要利用其強度和延展性；二是運用水溶液相為主的應用，主要利用其親水性和生物相容性。

蠶絲在體內(nèi)的降解主要通過蛋白水解和長期逐漸吸收這兩個方式實現(xiàn)[6]。蠶絲在體內(nèi)降解所需時間超過60天，因此屬于非降解材料。據(jù)估計蠶絲纖維在體內(nèi)1年內(nèi)會喪失大部分抗張力，在體內(nèi)2年后就無法在原移植處檢測到。蠶絲在體內(nèi)的降解受到患者健康狀況、蠶絲類型，蠶絲直徑以及其二級結(jié)構(gòu)的影響。然而由于體內(nèi)實驗受倫理等多方面限制，這些因素對蠶絲降解的具體影響尚未完全闡明。Horan等[7]在體外運用蛋白酶XIV對家蠶絲進行70多天的降解實驗，發(fā)現(xiàn)酶可以降解溶于水里的絲素蛋白，但無法降解成片的絲素蛋白，這可能是由于二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)的折疊將酶切位點保護起來使其無法與酶接觸。這也解釋了蠶絲在體內(nèi)需要較長時間降解的原因。Liu等[8]發(fā)現(xiàn)蠶絲植入皮下7天后開始降解，而在145天后皮下植入處仍可發(fā)現(xiàn)未降解的蠶絲。

2 蠶絲及其衍生材料在運動損傷修復中的作用

蠶絲由于其良好的生物力學特性，在自然界的可得性以及可預測的較長的降解時間，在生物醫(yī)學應用方面已經(jīng)具有很長的歷史。多年來，家蠶絲已被成功用

作縫線，但是一直有報道這樣的縫線會造成由巨噬細胞引起的炎癥反應[9]。過去普遍認為蠶絲的絲膠會導致過敏反應[10]，而最近的研究則表明單獨的絲膠或絲素并不會引起過敏反應[11，12]，只有二者結(jié)合在一起時才會引起過敏反應。因此要避免過敏反應只需單獨應用其中一種組分即可。由于在結(jié)構(gòu)上絲素纖維是蠶絲的核心，且在蠶絲的力學性能中發(fā)揮了重要作用，而絲膠在蠶絲的力學性能中作用不大，所以通常將蠶絲脫膠后使用絲素蛋白，以獲得良好的生物相容性[13]。

2.1蠶絲直接用于組織修復

脫膠后的絲素蛋白單絲可制成多種扭曲的結(jié)構(gòu)，包括繩狀、纜狀，紡成紗狀用于組織修復[14]。Altman等[14]運用蠶絲脫膠得到的單絲，經(jīng)過編織纏繞構(gòu)建了人工前交叉韌帶，其在軸向上有一定的力學強度和延展性。Gellynck等[15]發(fā)現(xiàn)蠶繭直接進行脫膠處理后得到的基質(zhì)上有人軟骨細胞的長入，其長入率與孔隙的多少有關(guān)。Fan等[16]把兔骨髓間充質(zhì)來源干細胞（bone marrow derived stroma cells，BMSCs）種植在絲素支架上體外培養(yǎng)8 h后移植重建兔的ACL，術(shù)后8周、16周和24周時，大體觀察、組織學觀察和力學測試的結(jié)果均優(yōu)于無BMSCs的絲素支架對照組。隨后Fan等[17]在豬的ACL重建實驗中也得到了相似的結(jié)果。這些結(jié)果較為確切地證實了蠶絲良好的組織相容性。

2.2絲素蛋白膜

絲素蛋白膜可以通過多種工藝來制作，目的是為了改善其表面特性以及機械強度[18，19]。由于膜內(nèi)成骨是骨組織再生修復的重要方式之一，而絲素蛋白又具有一定的強度和生物相容性，不少研究嘗試利用絲素蛋白膜為較大骨組織缺損的修復提供支撐條件。Meinel等[20]制作了一種基于絲素蛋白的可植入片狀支架用以修復小鼠巨大顱骨缺損，結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后5周組織工程骨組（以絲素蛋白為支架，負載細胞因子以及人間充質(zhì)來源干細胞）的X線片出現(xiàn)較為明顯的礦化，相比之下單純絲素蛋白組未出現(xiàn)明顯礦化。這一結(jié)果也與組織切片的結(jié)果相符。他們認為單純的絲素蛋白膜支架只能提供一個宿主增殖的合適環(huán)境，長入的細胞缺少向成熟成骨細胞分化的傾向。與之相對，若干在兔顱骨缺損模型中的研究發(fā)現(xiàn)絲素蛋白膜能夠有效地促進骨缺損處的骨再生[21，22]。

在絲素蛋白膜促進骨質(zhì)再生模型中最有爭議的問題是絲素蛋白本身是否能夠促進成骨細胞分化信號的表達，這也是骨組織工程應用中的重要問題之一。Miyamoto等[23]的研究顯示，絲素蛋白可以觸發(fā)成骨細胞早期及晚期分化信號的表達。如成骨細胞在和絲素蛋白接觸后的前14天內(nèi)I型膠原蛋白基因（Col1a1）的表達水平升高，而在40天后骨鈣素（osteocalcin）以及骨調(diào)節(jié)素（osteomodulin）的mRNA水平增加。Jones等[24]也報道絲素蛋白能夠支持成骨細胞的粘附和增殖，同時也能促進破骨細胞的粘附和分化。雖然這些研究結(jié)果顯示絲素蛋白膜在骨組織工程應用中的潛力，但用礦化成分或其他高聚物對絲素蛋白進行改良應該能改善其成骨能力，有更廣的應用前景。

2.3水凝膠

絲素蛋白水凝膠是再生絲素蛋白溶液在酸性環(huán)境下，有脫水劑存在，具備一定的離子條件，經(jīng)聲學處理和凍干處理后經(jīng)由溶-膠轉(zhuǎn)變得到的[25，26]。這一過程可以通過提高蛋白濃度，提高溫度，添加鈣離子加快[27]。絲素蛋白水凝膠不溶于水，有著多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被廣泛用于生物醫(yī)學材料，如人工皮膚、接觸性鏡片、給藥系統(tǒng)等，是當前研究的熱點[28]。人造軟骨是絲素蛋白水凝膠的重要應用領(lǐng)域。經(jīng)水凝膠技術(shù)形成的絲蛋白支架相較膠原蛋白支架能使軟骨組織形成更穩(wěn)固、更同質(zhì)的結(jié)構(gòu)，相較膠原蛋白支架，其生物降解率更低，并且不需要其他有機溶劑就能被生產(chǎn)出來[29]。Chao等[30]觀察到絲素蛋白水凝膠基質(zhì)上形成的軟骨在機械特性和生物化學特性上都與瓊脂糖上形成的軟骨相似。這提示絲素蛋白水凝膠可作為一個可降解支架運用于組織修復。Hofmann等[31]將人類骨髓來源的間充質(zhì)干細胞種植于一系列支架上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)絲素蛋白水凝膠支架上的細胞增殖速率較膠原支架更高，同時絲素支架上軟骨粘多糖的沉積也更為均質(zhì)。Diab等[32]將靜電紡絲PCL納米纖維管和絲素蛋白水凝膠構(gòu)成一個給藥系統(tǒng)，用于大鼠股骨粉碎性骨折模型中骨成型蛋白-2（BMP-2）的給藥，給藥系統(tǒng)使模型取得了更好的成骨效果。Etienne等[33]也報道絲蛋白水凝膠上種植的成纖維細胞能夠增殖并且合成蛋白，組織分析顯示，將這一復合體植入皮下30天后可有血管長入。以上這些研究均提示，經(jīng)水凝膠技術(shù)處理的絲素蛋白具有良好的生物相容性，并且有助于細胞附著生長，是良好的組織修復材料。

2.4絲素蛋白支架

如前所述，將絲素蛋白制作成多孔海綿狀結(jié)構(gòu)是目前認為較好的生物材料結(jié)構(gòu)，因為這樣的結(jié)構(gòu)能夠較好地模仿體內(nèi)的微環(huán)境，有利于細胞附著生長[28，34]。形成這種多孔海綿狀結(jié)構(gòu)的方法有靜電紡絲[34]和水凝膠技術(shù)[22]等。

隨著絲素蛋白支架在骨和軟骨組織工程領(lǐng)域應用的增加，其機械強度成為人們關(guān)注的問題。為得到具有更好機械強度和生物結(jié)局的材料，人們常將無機[35，36]或有機[37]的填充物添加入材料制成混合絲蛋白3-D支架，以獲得更好的機械強度和生物相容性。通常填充物是在支架制作過程中添加以保證其同質(zhì)性，然而也有

在支架制作完成后加入填充物顆粒的報道[35]?；旌吓浞皆O(shè)計的難點在于兩種成分之間的相容性，否則會造成混合不均、相分離以及組織副反應等結(jié)局[38]。絲-絲混合支架是高強度絲蛋白3-D支架的代表之一，Rajkhowa等[39]將碾碎的絲蛋白顆粒混入多孔的絲蛋白海綿中，這一處理顯著地提升了材料的抗壓性，從不足50 kPa提升到了約2.2 MPa。作為改進，Mandal等[40]將長度為10～600 μm的絲素蛋白纖維添加入多孔3-D支架中加強其抗壓能力，使抗壓能力達到13 MPa。

在絲素蛋白支架中混入各種成分以改善其生物特性已成為近年研究的熱點。Chen等[41]將人類胚胎干細胞來源的間充質(zhì)干細胞（hESC-MSC）結(jié)合于絲蛋白-膠原蛋白海綿支架上，研究其促腱組織生長能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腱組織能夠均勻地長入支架中，并有一定的強度。Jiang等[36]用將羥基磷灰石添加入水凝膠的方法建立了再生絲素蛋白支架，證明支架能夠在體外增強骨髓來源的間充質(zhì)干細胞的成骨能力，為骨組織修復提供了依據(jù)。Fan等[42]用蠶絲纖維強化了明膠/絲素蛋白雜交支架，并且將間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)于其上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)種植于雜交支架上的MSC具有更高的增值率和DNA含量，MSC在支架上分布均勻，并且也可檢測出軟骨相關(guān)膠原蛋白的表達，證明MSC在支架上可以向成纖維細胞分化。

2.5絲素蛋白顆粒

再生絲素蛋白微?？梢詫⒔z素蛋白溶液經(jīng)多種工藝加工而成，如凍干粉碎技術(shù)、噴涂干燥技術(shù)、噴射粉碎技術(shù)、自組裝技術(shù)以及冷凍解凍技術(shù)等[18]。與之相對，碾磨絲素蛋白顆?？梢灾苯佑山z素蛋白纖維碾磨而成，不需要經(jīng)過化學溶劑處理[39]。由于得到的顆粒在顯微結(jié)構(gòu)上存在巨大的差別，因此碾磨得到的絲素蛋白顆粒主要用于填充3-D絲蛋白支架，以加強其機械強度，而通過再生技術(shù)得到的絲素蛋白微粒則常用于各種藥物或細胞因子的給藥[18，39]。因此，如能開發(fā)出一種絲素蛋白顆粒，既能加強支架的機械強度，又能達到給藥的目的，將給組織修復工程帶來很大的推進作用[18]。Saran等[43]用可塑性油灰和絲素蛋白顆粒負載羥基磷灰石、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2）等構(gòu)成了BMP-2緩釋系統(tǒng)，結(jié)果顯示這樣一個系統(tǒng)顯著增加了大鼠C2C12的成骨分化。Fei等[44]將絲素蛋白和銀納米顆粒復合成顆粒材料，具有有效的抗菌和破壞細菌生物膜的能力。Bai等[45]報道采用干燥再溶解工藝并且控制反應的溫度和濃度，可以有效地通過自組裝工藝，生產(chǎn)具有不同納米結(jié)構(gòu)的絲素蛋白顆粒，為這一材料的應用帶來新的啟示。

3 蠶絲用于運動損傷修復的優(yōu)劣

生物修補材料是自然產(chǎn)生或人工合成的一類材料，植入生物體后可通過機械支持，促進局部組織再生與修復。在考量生物修復材料的優(yōu)劣時，首先應考慮材料的組織相容性，此外還需考量材料的機械強度、可降解性等[6，28]。蠶絲及其衍生材料作為生物修補材料的優(yōu)劣如下。

就生物相容性而言，生絲的生物相容性并不理想。未脫膠或脫膠不完全的生絲用于人體時往往會引起以巨噬細胞增多為主要表現(xiàn)的炎癥反應，這樣的炎癥反應會導致傷口愈合減緩，造成并發(fā)癥增多等[46]。過去普遍認為蠶絲的絲膠會導致過敏反應[10]，而最近的研究則表明單獨的絲膠或絲素并不會引起過敏反應[11，12]，只有二者結(jié)合在一起時才會引起過敏反應。因此要避免過敏反應只需單獨應用其中一種組分即可。因此蠶絲用于組織工程前往往需要先經(jīng)過脫膠處理，常用的方法是在堿性的熱水中浸泡一定時間[47]。經(jīng)妥善脫膠處理后的絲素蛋白在體內(nèi)不呈現(xiàn)顯著的免疫原性，其抗原性與膠原蛋白相同[13]。

近年來發(fā)現(xiàn)對絲素蛋白進行進一步工藝上的處理能夠提高其促進局部組織再生的作用和生物相容性[18]。由此衍生出了多種再生絲素蛋白處理工藝，將蠶絲處理成水溶液后，經(jīng)過各種技術(shù)，如噴涂[19]、濕紡[48]、靜電紡絲[34]、凍干法[25]等，依據(jù)其生物效應的需要制成多種形態(tài)，如薄膜狀[49]、多孔支架狀[36]等，以達到不同的組織修復目的。將絲素蛋白制成薄膜狀或多孔支架狀能較好地增加材料的表面積，在材料本身生物相容性較好的情況下能夠加強組織細胞在材料表面的附著，促進組織修復[18]。此外靜電紡絲形成的多孔支架和凍干法形成的水凝膠具有與體內(nèi)細胞外基質(zhì)類似的微結(jié)構(gòu)[28]，多項研究也證明在這樣的支架上，干細胞能更好地分化為有功能的細胞，從而更好地與周圍組織融合[30-33，42]。

生物力學強度也是蠶絲作為組織修復材料的重要原因之一。蠶絲本身即具有良好的機械強度，能承受的最大張力可達0.6 GPa[1]，因此蠶絲最初的應用即被用作縫線。然而近年來，蠶絲不再主要以單絲或纖維形式用于組織修復，各種再生絲素蛋白材料逐漸成為研究的熱點[18]。由于骨和韌帶依然是絲素蛋白組織工程的重要研究領(lǐng)域，因此已有多項研究通過在支架中加入多種填充物[39，40]，或者改變制作工藝[48]以提高支架的機械性能。目前絲素蛋白支架已有一定的力學強度，但尚未達到完全承載骨或者腱負載所需強度，要做到強度和生物特性俱佳還有待更多研究。

蠶絲在體內(nèi)降解所需時間較長，蠶絲包埋于皮下后在1年內(nèi)會失去其力學強度，2年內(nèi)將無法在包埋處找到[6]，這一較長而又可預測的降解時間與骨及運動系統(tǒng)損傷愈合所需時間相匹配。因此將蠶絲用于運動系

統(tǒng)損傷的修復已經(jīng)引起人們的關(guān)注[14]。蠶絲降解速度如此之慢主要是由于其中的二級和三級結(jié)構(gòu)將酶切位點保護了起來[7]。然而目前常用的各種再生絲素蛋白材料的形成來自于絲素蛋白水溶液[18]，不具有蠶絲本身所具有的高度晶化的結(jié)構(gòu)，因此有可能會影響到其在體內(nèi)的降解速率，使其強度過早降低。再生絲素蛋白材料生產(chǎn)的工藝非常多，產(chǎn)出的材料由于結(jié)構(gòu)不同在體內(nèi)也有不同的降解速率，然而目前尚未見足夠的文獻說明各種不同的材料在體內(nèi)的降解速率。降解速率過快可能會影響對應材料在愈合期較長的組織損傷中的應用。

4 展望

目前蠶絲已被用于組織工程修復的多個方面，其生物相容性問題已在多代人的努力下得到了較好的解決。而新工藝下產(chǎn)生的多孔修復材料由于其對細胞生長的支持作用較好，已成為目前研究的熱點。然而生產(chǎn)出的多孔修復材料的生物力學強度是否足夠適用于受力部位的組織修復成為研究中遇到的新問題。目前已有一些研究改良了支架的機械特性，但仍不能完全滿足高負荷部位，如腱、骨以及關(guān)節(jié)等損傷的修復。如何提高這些材料的強度將是近期研究的一個方向。此外，多孔絲素蛋白材料的體內(nèi)降解速率尚未得到很好的闡明，對這些方面的進一步研究將有助于更有效地將基礎(chǔ)生物材料學的研究結(jié)果用于臨床。

[1]Gosline JM，Guerette PA，Ortlepp CS，et al.The mechanical design of spider silks：From fibroin sequence to mechanical function[J].J Exp Biol，1999，202（Pt 23）：3295-3303.

[2]Gould SA，Tran KT，Spagna JC，et al.Short and long range order of the morphology of silk from latrodectus hesperus（black widow）as characterized by atomic force microscopy [J].Int J Biol Macromol，1999，24（2-3）：151-157.

[3]Hayashi CY，Shipley NH，Lewis RV.Hypotheses that correlate the sequence，structure，and mechanical properties of spider silk proteins[J].Int J Biol Macromol，1999，24（2-3）：271-275.

[4]Zong XH，Zhou P，Shao ZZ，et al.Effect of ph and copper（ii）on the conformation transitions of silk fibroin based on epr，nmr，and raman spectroscopy[J].Biochemistry，2004，43（38）：11932-11941.

[5]Li G，Zhou P，Shao Z，et al.The natural silk spinning process. A nucleation-dependent aggregation mechanism?[J].Eur J Biochem，2001，268（24）：6600-6606.

[6]Altman GH，Diaz F，Jakuba C，et al.Silk-based biomaterials [J].Biomaterials，2003，24（3）：401-416.

[7]Horan RL，Antle K，Collette AL，et al.In vitro degradation of silk fibroin[J].Biomaterials，2005，26（17）：3385-3393.

[8]Liu B，Song YW，Jin L，et al.Silk structure and degradation [J].Colloids Surf B Biointerfaces，2015，131：122-128.

[9]Tajirian AL，Goldberg DJ.A review of sutures and other skin closure materials[J].J Cosmet Laser Ther，2010，12（6）：296-302.

[10]Zaoming W，Codina R，F(xiàn)ernandez-Caldas E，et al.Partial characterization of the silk allergens in mulberry silk extract [J].J Investig Allergol Clin Immunol，1996，6（4）：237-241.

[11]Aramwit P，Kanokpanont S，De-Eknamkul W，et al.Monitoring of inflammatory mediators induced by silk sericin[J].J Biosci Bioeng，2009，107（5）：556-561.

[12]Wang Z，Zhang Y，Zhang J，et al.Exploring natural silk protein sericin for regenerative medicine：An injectable，photoluminescent，cell-adhesive 3d hydrogel[J].Sci Rep，2014，4：7064.

[13]Meinel L，Hofmann S，Karageorgiou V，et al.The inflammatory responses to silk films in vitro and in vivo[J].Biomaterials，2005，26（2）：147-155.

[14]Altman GH，Horan RL，Lu HH，et al.Silk matrix for tissue engineered anterior cruciate ligaments[J].Biomaterials，2002，23（20）：4131-4141.

[15]Gellynck K，Verdonk PC，Van Nimmen E，et al.Silkworm and spider silk scaffolds for chondrocyte support[J].J Mater Sci Mater Med，2008，19（11）：3399-3409.

[16]Fan H，Liu H，Wong EJ，et al.In vivo study of anterior cruciate ligament regeneration using mesenchymal stem cells and silk scaffold[J].Biomaterials，2008，29（23）：3324-3337.

[17]Fan H，Liu H，Toh SL，et al.Anterior cruciate ligament regeneration using mesenchymal stem cells and silk scaffold in large animal model[J].Biomaterials，2009，30（28）：4967-4977.

[18]Kundu B，Rajkhowa R，Kundu SC，et al.Silk fibroin biomaterials for tissue regenerations[J].Adv Drug Del Rev，2013，65（4）：457-470.

[19]Wang X，Kim HJ，Xu P，et al.Biomaterial coatings by stepwise deposition of silk fibroin[J].Langmuir，2005，21（24）：11335-11341.

[20]Meinel L，F(xiàn)ajardo R，Hofmann S，et al.Silk implants for the healing of critical size bone defects[J].Bone，2005，37（5）：688-698.

[21]Song J-Y，Kim S-G，Lee J-W，et al.Accelerated healing with the use of a silk fibroin membrane for the guided bone regeneration technique[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2011，112（6）：e26-e33.

[22]Kim KH，Jeong L，Park HN，et al.Biological efficacy of silk fibroin nanofiber membranes for guided bone regeneration[J]. J Biotechnol，2005，120（3）：327-339.

[23]Miyamoto S，Koyanagi R，Nakazawa Y，et al.Bombyx mori silk fibroin scaffolds for bone regeneration studied by bone differentiation experiment[J].J Biosci Bioeng，2013，115（5）：

575-578.

[24]Jones GL，Motta A，Marshall MJ，et al.Osteoblast：Osteoclast co-cultures on silk fibroin，chitosan and plla films[J].Biomaterials，2009，30（29）：5376-5384.

[25]Motta A，Migliaresi C，F(xiàn)accioni F，et al.Fibroin hydrogels for biomedical applications：Preparation，characterization and in vitro cell culture studies[J].J Biomater Sci Polym Ed，2004，15（7）：851-864.

[26]Guziewicz N，Best A，Perez-Ramirez B，et al.Lyophilized silk fibroin hydrogels for the sustained local delivery of therapeutic monoclonal antibodies[J].Biomaterials，2011，32（10）：2642-2650.

[27]Kim UJ，Park J，Li C，et al.Structure and properties of silk hydrogels[J].Biomacromolecules，2004，5（3）：786-792.

[28]Wang HY，Zhang YQ.Processing silk hydrogel and its applications in biomedical materials[J].Biotechnol Prog，2015，31（3）：630-640.

[29]Kapoor S，Kundu SC.Silk protein-based hydrogels：Promising advanced materials for biomedical applications[J].Acta Biomater，2016，31：17-32.

[30]Chao PH，Yodmuang S，Wang X，et al.Silk hydrogel for cartilage tissue engineering[J].J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2010，95（1）：84-90.

[31]Hofmann S，Knecht S，Langer R，et al.Cartilage-like tissue engineering using silk scaffolds and mesenchymal stem cells [J].Tissue Eng，2006，12（10）：2729-2738.

[32]Diab T，Pritchard EM，Uhrig BA，et al.A silk hydrogel-based delivery system of bone morphogenetic protein for the treatment of large bone defects[J].J Mech Behav Bio Med，2012，11：123-131.

[33]Etienne O，Schneider A，Kluge JA，et al.Soft tissue augmentation using silk gels：An in vitro and in vivo study[J].J Periodontol，2009，80（11）：1852-1858.

[34]Zhang X，Reagan MR，Kaplan DL.Electrospun silk biomaterial scaffolds for regenerative medicine[J].Adv Drug Deliv Rev，2009，61（12）：988-1006.

[35]Seregin VV，Coffer JL.Biomineralization of calcium disilicide in porous polycaprolactone scaffolds[J].Biomaterials，2006，27（27）：4745-4754.

[36]Jiang J，Hao W，Li Y，et al.Hydroxyapatite/regenerated silk fibroin scaffold-enhanced osteoinductivity and osteoconduc-tivity of bone marrow-derived mesenchymal stromal cells[J]. Biotechnol Lett，2013，35（4）：657-661.

[37]Hokugo A，Takamoto T，Tabata Y.Preparation of hybrid scaffold from fibrin and biodegradable polymer fiber[J]. Biomaterials，2006，27（1）：61-67.

[38]Wang M.Developing bioactive composite materials for tissue replacement[J].Biomaterials，2003，24（13）：2133-2151.

[39]Rajkhowa R，Gil ES，Kluge J，et al.Reinforcing silk scaffolds with silk particles[J].Macromol Biosci，2010，10（6）：599-611.

[40]Mandal BB，Grinberg A，Gil ES，et al.High-strength silk protein scaffolds for bone repair[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109（20）：7699-7704.

[41]Chen JL，Yin Z，Shen WL，et al.Efficacy of hesc-mscs in knitted silk-collagen scaffold for tendon tissue engineering and their roles[J].Biomaterials，2010，31（36）：9438-9451.

[42]Fan H，Liu H，Toh SL，et al.Enhanced differentiation of mesenchymal stem cells co-cultured with ligament fibroblasts on gelatin/silk fibroin hybrid scaffold[J].Biomaterials，2008，29（8）：1017-1027.

[43]Saran K，Shi P，Ranjan S，et al.A moldable putty containing silk fibroin yolk shell particles for improved hemostasis and bone repair[J].Adv Healthc Mater，2015，4（3）：432-445.

[44]Fei X，Jia M，Du X，et al.Green synthesis of silk fibroinsilver nanoparticle composites with effective antibacterial and biofilm-disrupting properties[J].Biomacromolecules，2013，14（12）：4483-4488.

[45]Bai S，Liu S，Zhang C，et al.Controllable transition of silk fibroin nanostructures：An insight into in vitro silk selfassembly process[J].Acta Biomater，2013，9（8）：7806-7813.

[46]Furuzono T，Ishihara K，Nakabayashi N，et al.Chemical modification of silk fibroin with 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine.Ii.Graft-polymerization onto fabric through 2-methacryloyloxyethyl isocyanate and interaction between fabric and platelets[J].Biomaterials，2000，21（4）：327-333.

[47]Yamada H，Nakao H，Takasu Y，et al.Preparation of unde-graded native molecular fibroin solution from silkworm cocoons[J].Mater Sci Eng，C，2001，14（1-2）：41-46.

[48]Wu HY，Zhang F，Yue XX，et al.Wet-spun silk fibroin scaffold with hierarchical structure for ligament tissue engineering [J].Mater Lett，2014，135：63-66.

[49]Lee MC，Kim DK，Lee OJ，et al.Fabrication of silk fibroin film using centrifugal casting technique for corneal tissue engineering[J].J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2016，104（3）：508-514.

2015.10.25

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）資助（編號：2015AA033703），國家自然科學基金項目資助（編號：81271958，81370052，81572108），高等學校博士學科點專項科研基金博導類資助課題（編號：20120071110067）

陳世益，Email：cshiyi@163.com