卵胞漿內(nèi)單精子注射后多原核合子發(fā)生的相關(guān)研究進(jìn)展

韓瑞剛，朱　亮

(解放軍第306醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，北京 100101)

?

卵胞漿內(nèi)單精子注射后多原核合子發(fā)生的相關(guān)研究進(jìn)展

韓瑞剛，朱亮

(解放軍第306醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，北京 100101)

[摘要]多原核合子是常規(guī)體外受精-胚胎移植過程中的正?，F(xiàn)象，卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)避免了多精子受精造成的多原核合子，但仍有可能出現(xiàn)多原核合子。ICSI后多原核合子出現(xiàn)主要是由于第二極體排出異常造成，卵母細(xì)胞質(zhì)量、男方精液情況以及ICSI操作技術(shù)本身都是多原核合子形成的影響因素。該文針對ICSI后多原核合子的產(chǎn)生機(jī)制、影響因素、妊娠結(jié)局及相應(yīng)處理措施進(jìn)行綜述。

[關(guān)鍵詞]卵胞漿內(nèi)單精子注射；多原核；極體；進(jìn)展

多原核合子是常規(guī)體外受精-胚胎移植(in-vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)過程中的正?，F(xiàn)象，其發(fā)生率為 2%～10%[1]。卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracyto￣plasmic sperm in-jection，ICSI)多原核的發(fā)生率為3.7%，多見3原核(pronucleus PN)[2]。ICSI后4原核的受精卵極為罕見，張媛媛等于2012年研究發(fā)現(xiàn)ICSI后4PN形成率僅為0.2%。多原核合子的增加直接導(dǎo)致可利用的胚胎數(shù)減少，若誤將多原核胚胎用來移植又可導(dǎo)致流產(chǎn)、多倍體畸形兒及葡萄胎的發(fā)生[3]。

1卵胞漿內(nèi)單精子注射后發(fā)生多原核合子的機(jī)制

常規(guī) IVF 中3原核發(fā)生最主要的原因是多精受精。而在ICSI過程中只有一個精子被注入卵細(xì)胞漿，排除了多精受精的可能。Rosenbusch[4]收集了一系列ICSI異常受精合子(3～5PN，1～2個polar body, PB)，合子在含鬼臼毒素和長春堿的培養(yǎng)液中過夜孵育，低滲及固定后吉姆薩染色進(jìn)行核型分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了ICSI后多原核存在多種形式，包括二倍體、亞三倍體、三倍體等。推測多原核合子可能有以下7種形式：①三倍體合子(n=69)，3PN，1PB(極體)。一般均為第2PB未排出。3PN中每個PN含有1套單倍體(n=23)，則DNA復(fù)制后，PN膜融合，會形成1個三倍體合子；②三倍體合子(n=69)，3PN，1PB。第2PB未排出，且2個雌原核染色單體分離不均，出現(xiàn)1個PN染色單體不足(n-α)，另一個PN染色單體增加(n+α)。文獻(xiàn)報道所涉及的異常染色體一般在1～3條之間(α=1～3)。這樣的合子均為三倍體；③亞三倍體合子(n=56～59)，3PN，2PB。第2PB排出不完全，一部分染色單體滯留在卵胞質(zhì)中，形成一個額外的雌原核，合子為亞三倍體(n=56～59)。這類合子的PN大小相似或者為2大1?。虎芏扼w合子(n=46)，3PN，2PB。第2PB完全排出(n=23)，而剩余的卵子染色單體發(fā)生了分裂，形成2個雌原核，均為亞單倍體(n-α, α)。這種情況可能卵子本身為非整倍體；⑤三倍體合子(n=69)，4PN，1PB。第2PB未排出，而2個母本染色單體中的1個發(fā)生了分裂。即形成了3個雌原核(n, -α, α)；⑥亞三倍體合子(n=53～55)，4PN,2PB。第2PB排出不完全，而原本的卵原核也發(fā)生了異常分離，形成了共3個雌原核(n-α, α, n-b),第二PB(n=b)；⑦三倍體合子(n=69)，5PN，1PB。第2PB未排出，原本的第2PB和卵原核均發(fā)生分裂，形成4個亞單倍體的雌原核(n-α, α, n-b, b)。

就PN和PB數(shù)目而言，以上是ICSI后出現(xiàn)異常PN的大部分情況。由此可提出3種機(jī)制來解釋ICSI多原核合子的起源：①第2PB整個未排出，造成一個額外的單倍體雌原核。這樣的合子為三倍體合子；②第2PB不完全排出(母本染色體分離不徹底)，多余一個亞單倍體雌原核。這樣的合子為亞三倍體；③第2PB排出，而原本的卵原核發(fā)生了分裂，形成2個亞單倍體雌原核。這樣的合子為二倍體。3種機(jī)制均可發(fā)生，形成多原核不同倍性的合子。

2卵胞漿內(nèi)單精子注射后多原核合子發(fā)生的相關(guān)因素

2.1卵母細(xì)胞因素

ICSI 周期中異常受精的發(fā)生與卵母細(xì)胞、精子及 ICSI 操作技術(shù)有關(guān)。在有活動精子及成熟的ICSI 操作技術(shù)情況下，卵母細(xì)胞質(zhì)量是決定受精成敗的最關(guān)鍵因素，任何影響卵母細(xì)胞質(zhì)量的因素都會影響其受精情況[5]。趙志明等發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)3PN合子的患者對Gn刺激反應(yīng)高，認(rèn)為3PN合子的產(chǎn)生可能與其對Gn刺激的高反應(yīng)有關(guān)。這種高反應(yīng)表現(xiàn)為對促排卵的敏感性強(qiáng)，即同樣促排劑量，獲得更多的卵母細(xì)胞。但這種高反應(yīng)可能在某種程度上影響卵子的質(zhì)量和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，可導(dǎo)致卵母細(xì)胞代謝異常、三磷酸腺苷含量下降、轉(zhuǎn)錄異常、不同步的核/質(zhì)成熟、微管混亂、卵原性多倍體形成。卵巢對Gn 刺激的反應(yīng)高可能加重了卵母細(xì)胞這些異常的發(fā)生，最終導(dǎo)致異常受精的發(fā)生。

有學(xué)者認(rèn)為[1]，多原核形成與卵母細(xì)胞紡錘體微管缺陷有關(guān)，如紡錘體不能結(jié)合到染色體著絲粒而導(dǎo)致染色體偏離赤道板，這些分離的染色體片段，被核膜包裹而獨立形成原核。紡錘體極體微管組織中心的微核活性發(fā)生改變，可形成多極紡錘體，使染色體發(fā)生多極分離，最終導(dǎo)致多原核受精卵的產(chǎn)生。

也有研究 提示，大于38歲女性患者卵母細(xì)胞核非整倍體的發(fā)生率為38.3%，認(rèn)為其與年齡相關(guān)[6]。女方年齡較大時， 細(xì)胞內(nèi)積聚的過氧化物等對處于第1次減數(shù)分裂靜止期的卵子破壞增加，引起卵子非整倍體的概率相應(yīng)增加，多原核孕卵發(fā)生率增高。此外，多倍體卵母細(xì)胞或卵母細(xì)胞第1、第2次減數(shù)分裂錯誤都會造成多原核的發(fā)生。

2.2精子因素

ICSI周期不會發(fā)生多精受精，但有研究發(fā)現(xiàn)，對于嚴(yán)重少、弱精子癥患者，二倍體精子發(fā)生率為2.2%，其二倍體發(fā)生率遠(yuǎn)高于正常精液精子[7]。因此，ICSI后二倍體精子可以多形成一個原核。Negri等[8]研究ICSI射精精子、新鮮附睪精子、凍融附睪精子或睪丸精子，發(fā)現(xiàn)3PN的發(fā)生在新鮮附睪精子最低，凍融附睪精子最高。趙志明研究發(fā)現(xiàn)精子來源(射精與附睪、睪丸相比)和精子質(zhì)量(正常與差相比)對ICSI后3PN的產(chǎn)生及隨后的妊娠率均無影響。 因此，精子因素對ICSI后多原核的發(fā)生還需進(jìn)一步研究。

2.3卵胞漿內(nèi)單精子注射操作技術(shù)本身因素

ICSI操作過程中可能損傷了赤道板區(qū)域，分裂中期的細(xì)胞受損；第1次減數(shù)分裂紡錘體再定位或者是顯微注射中對卵母細(xì)胞骨架的破壞造成第2次減數(shù)裂紡錘體的錯誤定位[9]。這些都可能造成第2PB不排出。而這種染色體不平衡可能與顯微注射的延遲有關(guān)。張文紅等觀察發(fā)現(xiàn)ICSI多原核胚胎停育率明顯高于IVF多原核胚胎(39.3% vs 10.2%)，表明ICSI操作技術(shù)對卵母細(xì)胞可能產(chǎn)生機(jī)械損傷，產(chǎn)生機(jī)械損傷，使細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致染色體分裂紊亂，進(jìn)一步影響胚胎繼續(xù)分裂，致使發(fā)育停滯。此外，多原核胚胎自身基因的缺陷也是阻礙胚胎進(jìn)一步發(fā)育的重要原因。

3卵胞漿內(nèi)單精子注射后多原核合子發(fā)生與妊娠結(jié)局

張媛媛等研究認(rèn)為，與對照組相比，ICSI 后多原核合子組優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率組間無統(tǒng)計學(xué)差異。這表明異常受精的發(fā)生并不代表較差的妊娠結(jié)局。但Figueira等報道[10]，當(dāng) 3PN 率≤25% 時，妊娠結(jié)局不受影響，3PN率>25% 時，其結(jié)局將大大受損。

有研究用 FISH 技術(shù)檢測ICSI 受精卵，36% 的3PN 受精卵實為二倍體受精卵，3PN 中 1 個原核為單倍體，而另外 2 個PN 的染色體加在一起為單倍體[11]。張文紅等將 ICSI來源的2個4PN受精卵培養(yǎng)到囊胚階段，對囊胚細(xì)胞進(jìn)行DNA短串聯(lián)重復(fù)序列基因座多態(tài)性分析，結(jié)果顯示它們均為二倍體核型。有研究提出胚胎本身具有自我修復(fù)能力，在患者 ICSI后無2PN胚胎時，可考慮利用植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)選擇正常核型的 3PN 胚胎進(jìn)行移植[12]。也有研究通過去除IVF來源3PN受精卵中一個原核并繼續(xù)培養(yǎng)，從而獲得正常人類胚胎干細(xì)胞[13]。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Kim Y J,Ku S Y,Jee B C,etal.Increased responsiveness may be associated with tripronuclear embryos in both conventional in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection cycles using gonadotropin-releasing hormone agonist long protocols:a self-matched observational study[J].J Obstet Gynaecol Res,2011,37(1):37-44.

[2]Figueira R C,Setti A S,Braga D P,etal.Prognostic value of triploid zygotes on intracytoplasmic sperm injection outcomes[J].J Assist Reprod Genet,2011,28(10):879-883.

[3]Weinerman R S,Fino M E,Kramer Y,etal.Phenotypic outcomes of tripronuclear (3PN) zygotes resulting from intracytoplasmic sperm injection (ICSI) vs. conventional insemination (INSEM) using time-lapse microscopy (TLM)[J].Fertil Steril,2011,96(3):S242.

[4]Rosenbusch B E.A preliminary concept,deduced from cytogenetic analyses,for explaining different types of multipronuclear oocytes obtained after intracytoplasmic sperm injection[J].Fertil Steril,2010,94(6):2479-2481.

[5]Miyara F,Aubriot F X,Glissant A,etal.Multiparameter analysis of human oocytes at metaphase II stage after IVF failure in non-male infertility[J].Hum Reprod,2003,18(7):1494-1503.

[6]Kurahashi H,Tsutsumi M,Nishiyama S,etal.Molecular basis of maternal age-related increase in oocyte aneuploidy[J].Congenit Anom (Kyoto),2012,52(1):8-15.

[7]Savage P,Sebire N,Dalton T,etal. Partial molar pregnancy after intracytoplasmic sperm injection occurring as a result of diploid sperm usage[J]. J Assist Reprod Genet,2013,30(6):761-764

[8]Negri L,Patrizio P,Albani E,etal.ICSI outcome is significantly better with testicular spermatozoa in patients with necrozoospermia: a retrospective study[J].Gynecol Endocrin, 2014, 30(1): 48-52.

[9]Babayev S N,Park C W,Bukulmez O.Intracytoplasmic sperm injection indications: how rigorous?[J].Semin Reprod Med,2014,32(4):283-290.

[10]Figueira R C,Setti A S,Braga D P,etal.Prognostic value of triploid zygotes on intracytoplasmic sperm injection outcomes[J].J Assist Reprod Genet,2011,28(10):879-883.

[11]Reichman D E,Jackson K V,Racowsky C.Incidence and development of zygotes exhibiting abnormal pronuclear disposition after identification of two pronuclei at the fertilization check[J].Fertil Steril,2010,94(3):965-970.

[12]Grau N,Escrich L,Martín J,etal. Self-correction in tripronucleated human embryos[J].Fertil Steril,2011,96(4): 951-956

[13]Jiang C Y,Cai L B,Huang B X,etal.Normal human embryonic stem cell lines were derived from microsurgical enucleated tripronuclear zygotes[J].J Cell Biochem,2013,114(9):2016-2023.

[專業(yè)責(zé)任編輯：呂淑蘭]

Related study progression of multipronuclear zygotes after intracytoplasmic sperm injection

HAN Rui-gang, ZHU Liang

(Assisted Reproductive Medical Center, the 306thHospital of PLA, Beijing 100101, China)

[Key words]intracytoplasmic sperm injection (ICSI); multipronuclear; polar body; progression

[Abstract]Multipronuclear zygotes are common after conventional in-vitro fertilization and embryo transfer (IVF-ET). There are still some multipronuclear zygotes after intracytoplasmic sperm injection (ICSI), although this technique can avoid polyspermous fertilization. The cause might be the abnormal extrusion of the second polar body. The related influencing factors on multipronuclear zygotes after ICSI include quality of oocytes and sperms, as well as ICSI operation technique itself. This article summarized the mechanism, influencing factors, pregnancy outcomes and corresponding measures of multipronuclear zygotes after ICSI.

[收稿日期]2015-01-06

[作者簡介]韓瑞剛(1975-)，男，主管技師，主要從事輔助生殖實驗室工作。

[通訊作者]朱亮，副主任醫(yī)師。

doi:10.3969/j.issn.1673-5293.2016.05.040

[中圖分類號]R711.6

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1673-5293(2016)05-0667-03

【生殖健康研究】