多花勾兒茶中兒茶素的提取分離與HPLC測定

姚姝鳳，唐克華，劉小攀，成　江，董愛文

(吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室，湖南 張家界 427000)

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多花勾兒茶中兒茶素的提取分離與HPLC測定

姚姝鳳，唐克華，劉小攀，成江，董愛文

(吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室，湖南 張家界 427000)

摘要：以多花勾兒茶果實、葉及自制綠茶為原料，采用水浴法提取兒茶素，研究其最佳提取工藝.提取液經(jīng)石油醚脫脂溶性色素后，采用大孔吸附樹脂D941進行吸附分離，靜態(tài)吸附和解析條件研究得出純凈水洗脫效果較好.多花勾兒茶果實、葉及自制綠茶吸附分離的純化液，用色譜柱:Boston Green ODS PC18(4.6×250 mm，5 μm)，檢測波長279 nm，流動相乙腈-0.4%磷酸(w(乙腈)∶w(0.4%磷酸)=13∶87)，柱溫35 ℃，流速1 mL/min，一次進樣10 μL來進行高效液相色譜(HPLC)檢測，其結(jié)果顯示，多花勾兒茶果實中兒茶素含量最低，自制綠茶中的兒茶素含量最高.

關(guān)鍵詞：多花勾兒茶；兒茶素；大孔吸附樹脂；高效液相色譜法

多花勾兒茶(BerchemiafloribundaBrongn)為鼠李科勾兒茶屬植物，本屬一些種類的根莖葉可供藥用.迄今為止，從該屬植物中獲得的天然活性成分有黃酮類、苷類、木脂素類、醌類、萜類等[1].在武陵山區(qū)民間用其葉及果實制茶，是良好的保健品，有“觀音茶”的美譽.茶多酚(Tea￣Polyphenols，TP)是茶葉中3大功效成分之一[2]，主要由兒茶素類、黃酮醇及黃酮類等組成[3]，具有抗癌、抗衰老、抗輻射、清除人體自由基，降低血糖、血脂、血壓，以及抑制突變等藥理功能[4]，兒茶素是其特征性成分[5]，具有清除人體自由基，抗輻射[6]、預(yù)防癌癥等多種功能[7]，其提取及分離純化參考文獻[9-14].多花勾兒茶作為武陵山區(qū)民間保健茶，未見兒茶素等功效成分的報道，因此本文以兒茶素這一茶葉功效成分為目標，探究多花勾兒茶果實、葉中兒茶素提取分離純化工藝，用高效液相色譜法檢測其兒茶素的含量與自制綠茶的相比較，為多花勾兒茶合理開發(fā)提供科學(xué)依據(jù).

1實驗材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 實驗材料多花勾兒茶材料采自張家界市永定區(qū)崇山，50 ℃烘干，粉碎過30目篩，密封備用.

1.1.2 試劑與藥品(1)標準品.兒茶素(質(zhì)量分數(shù)97.2%)中國食品藥品鑒定研究院(ID:7AMA-RUQS).(2)試劑.纖維素果膠復(fù)合酶、濃鹽酸、甲醇、無水乙醇、氫氧化鈉、磷酸(以上試劑為國產(chǎn)分析純)；甲醇、乙腈(為色譜純).(3)大孔樹脂.D941，LX-28，LSA-7，LX-17，XDA-8(西安藍曉樹脂科技有限公司)；D101，AB-8(安徽三星樹脂科技有限公司)

1.1.3 儀器AEG-220電子分析天平SHIMADZU(日本)，KQ-250E超聲波清洗器(超聲儀器有限公司)，PE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，U-3900紫外分光光度計(日本日立)，DF42恒溫干燥箱(日本雅馬拓)，LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司).

1.2 標準溶液與標準曲線

1.2.1 兒茶素標準溶液配制精密稱取兒茶素標準品2.00 mg，用乙醇-水(v(乙醇)∶v(水)=1∶1，下同)溶解定容于100 mL容量瓶中，制成質(zhì)量濃度為20 mg/L標準溶液.

1.2.2 兒茶素紫外吸收波長測定取兒茶素標準溶液5 mL，在800~200 nm范圍內(nèi)掃描，得兒茶素的吸收圖譜，由于兒茶素在279 nm處有最大紫外吸收，因此確定兒茶素的紫外檢測波長為279 nm.

1.2.3 兒茶素紫外檢測標準曲線的繪制取2，4，6，8，10 mL質(zhì)量濃度為20 mg/L的兒茶素標準溶液加乙醇-水(1∶1)定容至20 mL，測定279 nm的下吸光值.以紫外吸光值為縱坐標，溶液質(zhì)量分數(shù)為橫坐標，繪制回歸曲線.

1.2.4 兒茶素HPLC標準曲線及檢測圖譜色譜柱：Boston Green ODS PC18(4.6×250 mm，5 μm)，檢測波長279 nm，流動相乙腈-0.4%磷酸(w(乙腈)∶w(0.4%磷酸)=13∶87)，柱溫35 ℃，流速1 mL/min，一次進樣10 μL.按1.2.3節(jié)方法梯度稀釋標準品液，依次進樣，每個樣測定3次，取峰面積的平均值，以質(zhì)量分數(shù)為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線.

1.3 提取條件優(yōu)化

1.3.1 兒茶素提取溶劑體積分數(shù)的選擇綠茶中兒茶素用一定體積分數(shù)的乙醇水浴加熱提取.稱取多花勾兒茶果實、葉0.500 g(各6份)于三角瓶中，分別加入體育分數(shù)30%，40%，50%，60%，70%，80%，95%的乙醇-水溶液，液料比20∶1(mL/g，下同)，于40 ℃下恒溫水浴提取60 min，抽濾，得果實和葉子兒茶素提取液.

1.3.2 單因素試驗準確稱取多花勾兒茶果實與葉1.00 g，置50 mL錐形瓶中(平行3份)，以乙醇體積分數(shù)、溫度、液料比和水浴時間作為考察因素.乙醇體積分數(shù)30%，40%，50%，60%，70%，80%，95%，溫度30，40，50，60，70，80，90 ℃，液料比10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，35∶1，水浴提取時間20，40，60，80，100，120 min.

1.3.3 正交試驗結(jié)合單因素試驗，以溶劑體積分數(shù)、溫度、料液比、提取時間為影響因素，以兒茶素紫外吸光值為指標，采用 L16(44)正交試驗確定各因素對兒茶素提取率的影響，優(yōu)化提取工藝條件.

1.3.4 供試液制備稱取多花勾兒茶果實、葉及自制綠茶各15.00 g，置250 mL具塞錐形瓶中，用正交優(yōu)化的條件(綠茶按葉優(yōu)化條件提取)制備，過濾，減壓濃縮，乙醇定容至500 mL，制成兒茶素供試液，避光、冷藏.

1.4 兒茶素的大孔吸附樹脂分離純化

1.4.1 大孔吸附樹脂預(yù)處理使用前將7種大孔吸附樹脂以體積分數(shù)95%乙醇浸泡24 h，充分溶脹后再用蒸餾水洗滌至無白色渾濁現(xiàn)象，再用蒸餾水洗至無醇.然后依次用質(zhì)量分數(shù)4%NaOH，4%HCl 浸泡4 h，用蒸餾水洗至中性備用.

1.4.2 靜態(tài)吸附及解吸稱取預(yù)處理的7種大孔樹脂各0.500 g(濕樹脂)于三角瓶中，加入兒茶素標液40 mL(兒茶素含量對樹脂過量)，密封并置空氣浴搖床上振蕩，溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速100 r/min，振蕩24 h充分吸附后過濾，取5 mL濾液測其紫外吸光值，按下式計算各樹脂的吸附量及吸附率.飽和吸附的樹脂濾干吸附液后，加體積分數(shù)70%乙醇50 mL洗脫，選出最優(yōu)吸附樹脂，解吸率計算方法如下：

在充分吸附兒茶素標準溶液的D941等大孔樹脂，分別加入50mL純凈水，體積分數(shù)10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，95% 的乙醇溶液，在30 ℃的振蕩水浴鍋中振蕩24h，過濾，各取5mL濾液測兒茶素的紫外吸光值，計算各樹脂的解吸率.

1.4.3 兒茶素的大孔吸附樹脂分離與純化用1.3.4節(jié)制備的供試液，以1BV/h的流速過D941大孔吸附樹脂柱，吸附床體積為50mL.相同的1BV/h流速解吸，收集洗脫液用于HPLC檢測.

2結(jié)果與討論

2.1 紫外可見光吸收波長的確定及標準曲線繪制

兒茶素紫外可見光吸收光譜如圖1所示.由圖1可知，兒茶素在279nm處具有最大紫外吸收峰，故選擇279nm作為兒茶素提取液的紫外檢測波長.計算得到回歸方程y = 97.009x+0.005 8，該方程線性良好(r=0.999 9)，表明兒茶素在2～20mg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系.

圖1　兒茶素紫外吸收光譜

2.2 單因素試驗結(jié)果

將不同體積分數(shù)提取的果實液稀釋10倍，葉子提取液稀釋50倍，取5 mL溶液測定其提取液中兒茶素的吸光值，測定結(jié)果如圖2，3所示.

圖2　乙醇體積分數(shù)對果實中兒茶素提取率的影響

圖3　乙醇體積分數(shù)對葉子中兒茶素提取率的影響

由圖2，3可知，6個乙醇體積分數(shù)50%~60%提取果實中兒茶素較好，乙醇體積分數(shù)50%~70%提取葉子中兒茶素效果較好，故選擇體積分數(shù)60%乙醇提取材料中兒茶素.

2.2.1 液料比對兒茶素提取的影響取不同料液比的提取液，抽濾，將果實提取液稀釋10倍、葉子提取液稀釋50倍后各取5 mL，在279 nm處測其紫外吸光值，測定結(jié)果見圖4，5.

圖4　液料比對果實中兒茶素提取率的影響

圖5　液料比對葉子中兒茶素提取率的影響

從圖4，5看出，果實在液料比達到10∶1時提取率趨于穩(wěn)定，葉子在20∶1時提取率趨于穩(wěn)定，故正交試驗選用液料比10∶1，15∶1，20∶1，25∶1作為4個因素水平.

2.2.2 提取時間對兒茶素提取的影響取不同提取時間下的提取液，抽濾，在279 nm處測其紫外吸光值，結(jié)果見圖6，7.

圖6　提取時間對果實中兒茶素提取率的影響

圖7　提取時間對葉子中兒茶素提取率的影響

由圖6，7可知，果實和葉中兒茶素提取率在60 min后趨于穩(wěn)定，因此選用50，60，70，80 min作為正交試驗提取時間的4個因素水平.

2.2.3 提取溫度對兒茶素提取的影響取不同溫度下的提取液，抽濾，在279 nm處測其提取液的吸光值，結(jié)果見圖8，9.

圖8　提取溫度對果實中兒茶素提取率的影響

圖9　提取溫度對葉中兒茶素提取率的影響

由圖8，9可知，果實和葉中兒茶素在50 ℃后提取率上升趨勢有所變緩.文獻[8]表明，兒茶素由于自身的酚性羥基結(jié)構(gòu)，受高溫影響極易發(fā)生氧化與聚合，90 ℃的高溫可能改變兒茶素的結(jié)構(gòu).未見文獻報道兒茶素提取中溫度用90 ℃的.實驗結(jié)果顯示90 ℃時在279 nm處紫外吸光值驟然上升，是否改變了兒茶素的結(jié)構(gòu)有待進一步研究.因此，選用50，60，70，80 ℃作為正交試驗的4個因素水平.

2.3 正交試驗

根據(jù)單因素試驗所選乙醇體積分數(shù)、液料比、水浴提取時間、提取溫度等4個因素水平，進行L16(44)的正交實驗，實驗結(jié)果見表1—3.

表1　正交實驗因素水平

表2　正交試驗方差分析(果實)

表3　正交試驗方差分析(葉)

通過正交實驗因素表和方差分析發(fā)現(xiàn)：各因素對果實中兒茶素提取的影響由大到小依次為料液比、溫度、提取時間、乙醇體積分數(shù)；對葉中兒茶素提取率的影響由大到小依次為料液比、提取時間、乙醇體積分數(shù)、溫度，即果實中兒茶素最優(yōu)條件為A3B4C3D2(溶劑體積分數(shù)50%、溫度 80 ℃、提取時間60 min和料液比1∶20)，葉中兒茶素最優(yōu)條件為A3B1C4D3(溶劑體積分數(shù)50%、溫度50 ℃、提取時間70 min和料液比1∶25).根據(jù)方差分析表明，只有料液比對葉中兒茶素提取影響顯著.

2.4 精密度檢測

精密量取兒茶素標準溶液5 mL，分置50 mL容量瓶中用乙醇-水定容.取5 mL在279 nm處測兒茶素標液的吸光值，重復(fù)6次，計算得到相對標準偏差(RSD)為0.08%，結(jié)果表明精密度良好.

2.5 穩(wěn)定性試驗

取標準溶液2 mL，用體積分數(shù)50%乙醇在40 mL容量瓶中定容，分別在0，1，2，4，6，8 h，取5 mL在279 nm處測紫外吸光值，計算得到相對標準偏差(RSD)為0.21%，說明兒茶素在溶液中8 h內(nèi)是穩(wěn)定的.

2.6 加樣回收試驗

稱取同一批果實和葉樣品0.500 g 各9份，其中6份分別加入10 mL兒茶素質(zhì)量濃為50 mg/L的標準溶液，另3份加入10 mL質(zhì)量分數(shù)50%乙醇溶液在80 ℃下水浴提取50 min，抽濾得到提取液，取5 mL在279 nm處測紫外吸光值，計算回收率，果實的平均回收率92.4%(n=6)，相對標準偏差為0.78%，葉的平均回收率91.9%(n=6)，相對標準偏差為0.56%.

2.7 大孔吸附樹脂分離純化

2.7.1大孔吸附樹脂篩選試驗結(jié)果從樹脂篩選結(jié)果(表4)可看出，7種大孔吸附樹脂只有D941吸附較好.綜合考慮吸附率和解吸率，選擇D941為本實驗分離純化的大孔吸附樹脂，它對兒茶素的吸附率和解吸率分別為84.46%和40.09%.故選擇D941進行多花勾兒茶果實中兒茶素的分離純化工作，而使用體積分數(shù)70%乙醇為洗脫劑時洗脫率太低，還須進一步選擇.

表4　不同大孔吸附樹脂對兒茶素的純化效果對比

2.7.2 洗脫液體積分數(shù)的試驗結(jié)果選取不同體積分數(shù)的乙醇及純凈水對已飽和吸附兒茶素的D941大孔樹脂進行解吸，解吸率與乙醇體積分數(shù)的關(guān)系見圖10.由圖10可知，隨著乙醇體積分數(shù)升高，解吸效果明顯減小，但當乙醇體積分數(shù)超過60%時，解吸率有上升趨勢.因此，從解吸效果及經(jīng)濟角度考慮，選用純凈水進行解吸.

2.8 HPLC標準曲線及3種供試液兒茶素的檢測

兒茶素標準溶液的HPLC標準曲線見圖11，兒茶素標準溶液的HPLC色譜圖見圖12，葉子和果實純化液的HPLC色譜圖見圖13，14，自制綠茶純化液HPLC色譜圖見圖15.

圖10　洗脫劑體積分數(shù)對提取率的影響

圖11　兒茶素HPLC標準曲線

圖12　兒茶素標準溶液的HPLC色譜圖

圖13　葉子純化液的HPLC色譜圖

圖14　果實純化液的HPLC色譜圖

圖15　自制綠茶純化液的HPLC色譜圖

3結(jié)語

以多花勾兒茶果、葉及同山自采自制的綠茶為材料，通過單因素及正交試驗探索提取多花勾兒茶果實與葉中兒茶素的最佳工藝.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，果實兒茶素提取最佳工藝參數(shù)是提取溶劑體積分數(shù)50%、溫度80 ℃、提取時間60 min和料液比1∶20；葉的兒茶素提取最佳工藝參數(shù)是提取溶劑體積分數(shù)為50%，溫度50 ℃、提取時間70 min和料液比1∶25.從7種大孔吸附樹脂中篩選出D941樹脂對兒茶素提取液進行分離純化，通過靜態(tài)吸附和解析研究得出純凈水為最適洗脫液.用HPLC分別對兒茶素的標準液、果實、葉及自制綠茶經(jīng)純化的兒茶素制備液進行檢測，發(fā)現(xiàn)多花勾兒茶的葉片兒茶素含量明顯高于果實的，但低于自制綠茶的.兒茶素作為茶多酚的主體成分，是茶的3大功效成分之一，多花勾兒茶果實和葉中均已檢測出來且含量適中，為武陵山區(qū)民間將其制作成“觀音茶”提供科學(xué)依據(jù)，有必要對其果實、葉中其有效成分做進一步分析與檢測.

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(責(zé)任編輯陳炳權(quán))

Separation and Characterization of Catechin in man￣Made Green Tea,

the Fruits and Leaves of Berchemia Floribunda with

Macroporous Resin and HPLC

YAO Shufeng，TANG Kehua,LIU Xiaopan,CHENG Jiang，DONG Aiwen

(Key Laboratory of Forest Products and Chemical Engineering of Hunan Province,Jishou University,Zhangjiajie 427000,Hunan China)

Abstract:In this study,the extraction process of catechins was investigated with a certain concentration of ethanol as solvent from man￣made green tea，fruits and leaves of Berchemia floribunda,using the method of waterbath.After the fat soluble pigment was removed by petroleum ether from extracting solution,the catechins was purified by porous resin adsorption method.The static adsorption and desorption tests of catechin with macroporous resin showed that D941 was the optimal resin for purification and the pure water was the optimum eluant.Purified liquid of fruit,leaves and home￣made green tea extracts were detected by HPLC.The catechins was separated on PC18 chromatographic column (4.6×250 mm,5 μm) at 35 ℃,with nitrile￣0.4% phosphoric acid (13∶87) as mobile phase at a flow rate of 1 mL/min,and detected at the wavelength of 279 nm (UV scan).The results showed that the catechin content of fruit was the lowest,while the content of man￣made green tea was significantly higher than that of both the fruit and leaves through the optimized extraction processes.

Key words:Berchemia floribunda；catechin；macroporous resin；HPLC

作者簡介：姚姝鳳(1991—)，女，山西大同人，吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室碩士研究生，主要從事林產(chǎn)化學(xué)與加工研究通信作者：董愛文(1967—)，男，湖南桃源人，吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室研究員，主要從事植物活性成分研究.

基金項目：湖南省科技計劃資助項目(2013JT2012)；張家界市科技計劃資助項目(2014ZK01)；生態(tài)旅游湖南省重點實驗室開放基金資助項目(JDSTLY1403)；林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室開放基金資助項目(JDZ201404)

收稿日期：2015-03-23

中圖分類號：R286.02

文獻標志碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1007-2985.2015.03.018

文章編號：1007-2985(2015)03-0082-08