重組人對氧磷酶K192亞型對毒死蜱中毒所致肺損傷的保護作用

張　娜，韓新飛，張　帆，張鵬思，趙　敏*

重組人對氧磷酶K192亞型對毒死蜱中毒所致肺損傷的保護作用

張娜a，韓新飛a，張帆a，張鵬思b，趙敏a*

[摘要]目的探討重組人對氧磷酶K192亞型(rHuPON1K192)是否對毒死蜱(CPF)中毒所致Sprague-Dalwey(SD)大鼠急性肺損傷具有保護作用。方法將健康成年SD雄性大鼠30只隨機分為對照組、染毒組、預(yù)處理組，每組10只。染毒組大鼠應(yīng)用毒死蜱以330 mg/kg(2倍LD50)灌胃進行染毒，建立有機磷中毒模型；對照組灌胃等量生理鹽水；預(yù)處理組于染毒前30 min尾靜脈注射rHuPON1K192(9 000 U/kg)進行預(yù)處理。在造模后8 h處死大鼠，采血清和肺組織標(biāo)本進行檢測，測定血清核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的濃度、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、肺系數(shù)，并觀察肺組織病理及電鏡變化。結(jié)果預(yù)處理組與染毒組相比，血清中SOD活力增強，MDA含量減低，肺組織NF-κB活性降低。光鏡和電鏡下可見對照組大鼠肺組織表現(xiàn)正常。染毒組光鏡下可見肺組織出現(xiàn)較重程度粒細(xì)胞浸潤，肺水腫、肺泡間隔增厚，肺泡內(nèi)有紅細(xì)胞聚集，電鏡下可見上皮細(xì)胞胞質(zhì)腫脹、鼓泡、破裂，核染色質(zhì)凝固、碎裂。預(yù)處理組大鼠上述改變較輕。結(jié)論rHuPON1K192可以減輕毒死蜱急性中毒大鼠的肺損傷，對肺損傷具有保護作用。

[關(guān)鍵詞]有機磷中毒；毒死蜱；重組人對氧磷酶；急性肺損傷；NF-κB

[Abstract]ObjectiveTo explore whether the recombinant human paraoxonase K192(rHuPON1K192)can protect acute lung injury in Sprague-Dalwey(SD)rats induced by chlorpyrifos(CPF) poisoning.MethodsThirty healthy male adult SD rats were randomly divided into control group,infected group and pretreatment group,10 rats in each group.Rats in infected group were given chlorpyrifos by gavage 330 mg/kg(2 LD50) to establish the organophosphate poisoning model,rats in control group received normal saline,and pretreatment group was given caudal intravenously rHuPON1K192(9 000 U/kg) at 30 min before exposure to chlorpyrifos.The blood and lung tissue samples were collected for testing at 8 h after pretreatment.The serum levels of nuclear factor-Kappa B(NF-κB),Super Oxide Dismutase(SOD),malonaldehyde(MDA) and pulmonary coefficient were determined,and the changes of the lung histopathology and electron microscopy were observed.ResultsCompared with infected group,the SOD activity in pretreatment group increased,the MDA content in serum and the NF-κB activity of lung tissue decreased.The lung tissue in control group was normal under light microscope and electron microscope,while the tissue appeared heavier degree of neutrophil infiltration,lung edema,alveolar septal thickening and erythrocyte aggregation in alveolar in infected group under light microscope,with swelling,bubbling,cracking of the cytoplasm of the epithelial cells,chromatin coagulation and fragmentation under electron microscopy.The above changes in rats of pretreatment group was lighter.ConclusionrHuPON1K192can relieve the lung injury of rats with acute chlorpyrifos poisoning,with protective effect on lung injury.

收稿日期：2015-08-28

基金項目：沈陽市科學(xué)技術(shù)計劃項目(F10-205-1-76)

通信作者*

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201512004

Protective effect of recombinant human paraoxonase K192(rHuPON1K192) on lung injury induced by chlorpyrifos(CPF) poisoningZHANG Naa,HAN Xin-feia,ZHANG Fana,ZHANG Peng-sib,ZHAO Mina*(a.Department of Emergency,b.Local Service Section,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Key words：Organophosphate poisoning;Chlorpyrifos;Recombinant human paraoxonase;Acute lung injury;NF-κB

0引言

有機磷中毒是全球主要的健康問題，據(jù)估計每年有超過300萬例的有機磷中毒患者，其中有超過25萬例的中毒原因為自殺，占全球自殺人數(shù)的30%[1]。急性有機磷農(nóng)藥中毒(AOPP)患者發(fā)病急驟，常并發(fā)肺損傷，呼吸衰竭是重度AOPP 患者最常見的并發(fā)癥[2]，也是重度 AOPP患者最重要的死亡原因。對氧磷酶1(Paraoxonase 1,PON1)是一種重要的參與有機磷農(nóng)藥解毒的羧基酯酶,能催化磷酸酯鍵的水解,在有機磷代謝中起重要作用。本實驗采用對SD大鼠進行急性毒死蜱染毒和rHuPON1K192預(yù)處理的方法，測定各組MDA、SOD、肺組織 NF-κB的表達、肺系數(shù)及病理、電鏡變化，探討rHuPON1K192亞型對有機磷中毒所致肺損傷的保護作用。

1材料與方法

1.1實驗對象選擇健康雄性清潔級SD大鼠30只，體重250～350 g，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2主要材料及儀器實驗試劑與藥品：rHuPON1K192(自行制備)，45%毒死蜱乳液購自天津漢邦植物保護劑有限責(zé)任公司，MDA、SOD試劑盒購自南京建成生物工程研究所，兔抗NF-κB試劑盒購自英國abcam公司，羊抗兔二抗試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，其他試劑均由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院中心實驗室提供。實驗儀器均由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院中心實驗室提供：Mutifuge 3SR+高速低溫離心機購自美國Thermo公司，E800型生物光學(xué)顯微鏡照相機購自Nikon公司，F(xiàn)D-1冷凍干燥機購自北京博醫(yī)康技術(shù)公司，HH-2數(shù)顯恒溫水浴箱購自國華電器有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1動物分組及模型制備將30只成年雄性SD大鼠隨機分為3組，對照組、染毒組及預(yù)處理組,每組10只。染毒組以330 mg/kg灌胃毒死蜱染毒建立急性AOPP 模型。對照組給予等量生理鹽水，預(yù)處理組灌胃前予大鼠9 000 U/kg尾靜脈注射rHuPON1K192。在造模后8 h即開始取材，剔除死亡個體。

1.3.2留取標(biāo)本于造模后8 h將各組大鼠分別采血1 mL及肺組織。10%水合氯醛3 mL/kg大鼠腹腔注射麻醉，打開腹腔直接從腹主動脈采血，1 500 r/min離心10 min，提取上清放置 -80 ℃冰箱內(nèi)備用；另取右上肺組織用中性甲醛及戊二醛浸泡固定，以備組織學(xué)光鏡及電鏡檢查。用生理鹽水沖去表面血跡后用濾紙擦干并稱質(zhì)量,計算肺系數(shù)。對照組行同樣處理。每次測定標(biāo)本均在取樣當(dāng)日或次日，成批檢測以減少操作誤差。

1.4檢測指標(biāo)

1.4.1測試公式計算肺系數(shù)。肺系數(shù)=肺重量(g)/體重(kg)×100%。

1.4.2MDA、SOD濃度測定應(yīng)用TBA法測定各組大鼠血清中MDA濃度，應(yīng)用羥胺法測定各組大鼠血清中SOD活性，操作均按照試劑盒說明書要求進行。

1.4.3免疫組化用免疫組織化學(xué)法測肺組織 NF-κB 水平，用NIS-Elements F 3.0圖像采集軟件照相并分析。

1.4.4光學(xué)顯微鏡下觀察取右上肺組織，經(jīng)甲醛固定、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片后，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肺組織病理變化。

1.4.5透射電鏡下觀察取肺尖部組織切成小塊，戊二醛及鋨酸固定，磷酸鹽緩沖液漂洗，梯度乙醇、環(huán)氧丙烷順序脫水后包埋，超薄切片；醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染后透射電鏡下觀察。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用 SPSS 17.0 軟件。計量資料采用±s表示，各組數(shù)據(jù)首先進行方差齊性檢驗，然后進行獨立樣本t檢驗，比較兩組大鼠的血清 MDA、SOD濃度，肺NF-κB 水平，肺系數(shù)的差異水平，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1灌胃后三組大鼠的反應(yīng)對照組大鼠在整個實驗過程中無異常反應(yīng)。染毒組大鼠在毒死蜱灌胃后0.5~4 h開始出現(xiàn)有機磷殺蟲劑中毒癥狀：流涎，肌肉顫動，呼吸急促，步態(tài)不穩(wěn)。染毒組共死亡大鼠6只，死亡大鼠視為造模不成功，剔除實驗，隨后再補充6只大鼠。預(yù)處理組大鼠有機磷中毒癥狀程度較染毒組輕。

2.2肺系數(shù)水平的變化預(yù)處理組肺系數(shù)高于對照組，并且低于染毒組。各組大鼠肺系數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 見表1。

表1　各組大鼠肺系數(shù)

注：#與對照組比較,P<0.05;*與預(yù)處理組比較,P<0.05

2.3各組血清MDA、SOD濃度變化預(yù)處理組血清MDA水平高于對照組，并且低于染毒組；預(yù)處理組血清SOD水平低于對照組，并且高于染毒組。各組大鼠SOD、MDA比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 見表2。

2.4各組肺組織NF-κB 水平變化每組選取10張切片，每張切片隨機選取5個視界，于 400 倍光學(xué)顯微鏡下拍照，棕黃色代表NF-κB，主要位于細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)中也有少量表達，肺組織中 NF-κB 越高，著色越深。預(yù)處理組肺組織NF-κB水平高于對照組，并且低于染毒組。各組大鼠肺組織NF-κB比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表2　各組大鼠MDA、SOD水平

注：#與對照組比較,P<0.05;*與預(yù)處理組比較,P<0.05

2.5肺組織光學(xué)顯微鏡下的病理改變對照組大鼠肺組織切片(圖1a)正常，光鏡下肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔內(nèi)干凈，間隔無增厚，無紅細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管無擴張及充血。染毒組大鼠肺組織(圖1b)肺泡間隔增厚、水腫，肺泡腔內(nèi)可見紅細(xì)胞聚集，肺泡壁毛細(xì)血管充血，伴炎性細(xì)胞浸潤。預(yù)處理組動物(圖1c)肺水腫、肺泡間隔腫脹減輕，炎性細(xì)胞浸潤程度減輕，可見完整的肺泡腔，腔內(nèi)可見少量紅細(xì)胞。

表3　急性毒死蜱中毒大鼠肺組織NF-κB 水平變化

注：#與對照組比較,P<0.05;*與預(yù)處理組比較,P<0.05

圖1各組大鼠光鏡下病理改變(HE×400)

2.6肺組織電鏡下的病理改變對照組(圖2a)肺泡壁完整，Ⅰ型、Ⅱ型上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，未見明顯改變，肺泡上皮細(xì)胞之間緊密連接均保持完好。染毒組(圖2b)肺泡壁完整結(jié)構(gòu)被破壞，Ⅰ型上皮細(xì)胞胞質(zhì)腫脹、鼓泡、破裂，甚至可以見到細(xì)胞碎裂脫落，基底膜暴露；Ⅱ型上皮細(xì)胞中可見胞質(zhì)減少呈空泡變、微毛減少等現(xiàn)象。預(yù)處理組(圖2c)肺泡壁和細(xì)胞上述改變減輕，Ⅰ型上皮細(xì)胞胞質(zhì)腫脹減輕，Ⅱ型上皮細(xì)胞空泡變現(xiàn)象減少。

圖2各組大鼠電鏡下病理改變(×4 000)

3討論

有機磷殺蟲劑可以對各個器官造成損害，肺是最早接觸吸入有毒化學(xué)物質(zhì)的器官。有機磷可導(dǎo)致廣泛的肺損傷，如肺泡充血、出血，中性粒細(xì)胞浸潤及肺氣腫、肺水腫等變化[3-5]。近年來，許多文獻都強調(diào)氧化應(yīng)激在有機磷中毒中的作用[6-8]，認(rèn)為其是引起有機磷中毒的主要原因[9-10]。毒死蜱是一種親脂性的中度毒類有機磷，可以很容易地通過細(xì)胞膜，引起機體的損害程度很高[11]。以往的調(diào)查結(jié)果表明，毒死蜱可誘導(dǎo)不同組織中的氧化應(yīng)激以及組織病理學(xué)變化[12-13]。

MDA是一種多不飽和脂肪酸過氧化的主要產(chǎn)物，其含量的增加是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的重要指標(biāo)[14]。SOD是體內(nèi)唯一直接清除氧自由基的酶，若其活性不足或大量消耗可降低組織的抗氧化能力[15]。本實驗采用毒死蜱灌胃建立AOPP動物模型，發(fā)現(xiàn)染毒組大鼠肺系數(shù)、MDA較對照組升高，SOD降低，說明細(xì)胞的抗氧化能力下降，脂質(zhì)過氧化作用增強，造成大鼠肺的氧化損傷，從而驗證了氧化應(yīng)激在毒死蜱致肺損傷中的作用。

NF-κB是參與急性肺損傷進展的一個關(guān)鍵因素[16-18]，當(dāng)機體受到外傷、休克、病毒或細(xì)菌等因素刺激時，NF-κB的信號通路被激活，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞隨后被觸發(fā)，IL-1β和TNF-α等炎癥介質(zhì)釋放，促進氧化應(yīng)激反應(yīng)[19-20]。本實驗發(fā)現(xiàn)染毒組大鼠NF-κB水平較對照組升高，驗證了急性肺損傷中NF-κB的作用。

血清PON1是肝臟分泌的一種能夠水解多種有機磷的鈣離子依賴性酯酶,具有重要的解毒作用[21]，可在某些有機磷農(nóng)藥抑制膽堿酯酶之前將其水解，從而預(yù)防有機磷中毒[22]。PON1在血液中結(jié)合 ApoAⅠ而緊密固定在高密度脂蛋白顆粒上發(fā)揮抗氧化作用，抑制低密度脂蛋白氧化修飾以及水解溶血磷酯等具有生物活性的脂質(zhì)過氧化物，是重要的抗氧化酶[23]，可降低機體的氧化應(yīng)激狀態(tài)和脂質(zhì)過氧化[24]。近年來，許多文獻研究了PON1對有機磷中毒的保護作用[25-26]。本實驗應(yīng)用rHuPON1K192預(yù)處理大鼠，發(fā)現(xiàn)預(yù)處理組大鼠肺系數(shù)、MDA及NF-κB較染毒組降低，SOD較染毒組升高。結(jié)果提示rHuPON1K192可以減輕毒死蜱急性中毒大鼠的肺組織損傷，對肺損傷具有保護作用，也驗證了抗氧化劑在有機磷中毒中的保護作用[27-28]。

本實驗僅為rHuPON1K192對有機磷中毒的肺保護作用提供了實驗依據(jù)，但是其所需要的最佳劑量仍需要進一步研究。

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作者單位：中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽 110004