哮喘動(dòng)物模型建立的思考與體會(huì)*

譚杰軍　王甜甜　劉志偉　曲婉瑩　景偉超　施國善　李志軍△王有鵬△（.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 50040；.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 5000）

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哮喘動(dòng)物模型建立的思考與體會(huì)*

譚杰軍1王甜甜1劉志偉1曲婉瑩1景偉超2施國善1李志軍2△王有鵬2△
（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150001）

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立對于哮喘病因、病機(jī)及防治方面的研究至關(guān)重要。筆者基于對國內(nèi)外諸多哮喘實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立方法與相關(guān)知識(shí)的學(xué)習(xí)和思考，結(jié)合自身實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，提出幾點(diǎn)心得和體會(huì)，以資與同道互相探討學(xué)習(xí)。

支氣管哮喘動(dòng)物模型思考體會(huì)

【Abstract】The establishment of experimental animal model for the etiology，mechanism and prevention of asthma is of crucial importance.The author puts forward several ideas and experience to discuss with fellows and learn from each other，based on the study and thinking of the methods of the establishment of experimental animal model of asthma home and abroad and the related knowledge.

【Key words】Bronchial asthma；Animal models；Thinking；Experience

支氣管哮喘（簡稱哮喘）作為嚴(yán)重危害人體健康的常見疾病，其預(yù)防、控制和治療已成為全球性的健康難題。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立對于哮喘病因、病機(jī)及防治方面的研究至關(guān)重要。遺憾的是，由于各研究者所在實(shí)驗(yàn)室條件高低參差不同，文獻(xiàn)中的模型建立方法在國內(nèi)經(jīng)常不能成功復(fù)制，或出現(xiàn)諸多問題，影響實(shí)驗(yàn)的正常進(jìn)行和研究的順利開展?；趯鴥?nèi)外諸多哮喘實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立方法［1-7］與相關(guān)知識(shí)的學(xué)習(xí)和思考，筆者將結(jié)合自身實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，就實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及條件控制、致敏劑與致敏方法以及模型判定等幾方面加以探討闡述，提出幾點(diǎn)心得和體會(huì)，以資與同道互相探討學(xué)習(xí)，期望能對普通實(shí)驗(yàn)條件下哮喘動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的開展，有所借鑒幫助。

1　建立哮喘動(dòng)物模型的必要性

鑒于人體研究的局制以及倫理學(xué)的嚴(yán)格限制，哮喘的研究需要通過建立動(dòng)物模型來進(jìn)行，這是研究成功的關(guān)鍵。研究者可以通過動(dòng)物模型把人體中類似的復(fù)雜情形復(fù)制出來，通過嚴(yán)格控制條件，排除各種干擾因素，對疾病加以研究。此外，還可采用某些在人體研究中不宜使用的方法和手段。但考慮到動(dòng)物的氣道結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)不如人類復(fù)雜，加之哮喘病因病機(jī)錯(cuò)綜萬千，受多種因素影響，如遺傳背景、過敏原、環(huán)境因素等，一種動(dòng)物模型無法完全復(fù)制出人類哮喘的整個(gè)病理生理過程，而只能重現(xiàn)哮喘生理病理變化的某些特定階段。因此，選擇并建立合適的動(dòng)物模型非常重要。毋庸置疑，盡管其存在一定的不足，但通過動(dòng)物模型我們得到大量有效信息，對人類哮喘有了深刻透徹的認(rèn)識(shí)。

2　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

建立哮喘動(dòng)物模型，是利用所選品系的物種更好地模仿哮喘的過程與特征。兔、貓、犬、羊及靈長類不能自發(fā)哮喘，且一般需人工誘發(fā)，都不是理想的選擇對象。綿羊及靈長類雖可模擬人類對藥物的反應(yīng)，但價(jià)格昂貴，可能發(fā)生微生物的亞臨床感染，不予選擇。目前制作哮喘模型多選用豚鼠、大鼠與小鼠。

2.1豚鼠豚鼠易被致敏，且反應(yīng)的靶器官為肺臟，接觸致敏原后產(chǎn)生Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，程度較大鼠、小鼠強(qiáng)，且霧化激發(fā)后能產(chǎn)生速發(fā)相與遲發(fā)相兩種哮喘反應(yīng)，因而應(yīng)用廣泛。但豚鼠個(gè)體差異大，致敏過程中個(gè)別不出現(xiàn)反應(yīng)，而其他個(gè)體卻出現(xiàn)種群依賴性的夸大反應(yīng)，如過敏性休克等。從免疫學(xué)方面講，與人類變態(tài)反應(yīng)主要由IgE介導(dǎo)不同，豚鼠的主要由IgG1介導(dǎo)。此外，豚鼠繁殖率較低，缺乏基因型明確的種系，相關(guān)的免疫學(xué)與分子生物學(xué)試劑相對不足，盡管能發(fā)生很好的氣道炎癥，但要進(jìn)一步深入研究遺傳與免疫機(jī)制則比較困難［8］。由于上述原因，其應(yīng)用受到一定限制。

2.2大鼠近年來，大鼠模型使用逐漸增多，國外多用Brown-Norway大鼠，易受國際醫(yī)學(xué)雜志認(rèn)可。其優(yōu)點(diǎn)在于能夠產(chǎn)生針對過敏原的特異性IgE抗體，而且更易誘發(fā)出哮喘癥狀以及氣道變應(yīng)性炎癥與氣道高反應(yīng)。但目前，我國常用的SD大鼠、Wistar大鼠等穩(wěn)定性欠佳，很難被較高水準(zhǔn)的國際醫(yī)學(xué)雜志認(rèn)可，不宜用于哮喘研究，在此其優(yōu)缺點(diǎn)不再贅述。

2.3小鼠小鼠常用于呼吸道變態(tài)反應(yīng)的研究。它們的免疫遺傳學(xué)背景清楚，方便使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，成本較低，并被允許進(jìn)行大規(guī)模研究。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)和檢測手段的發(fā)展，針對小鼠的特異性免疫學(xué)試劑的大量出現(xiàn)，以及基因技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使小鼠模型便于進(jìn)行變態(tài)反應(yīng)機(jī)制的研究。常用的小鼠品系有BALB/c、C57BL/6、CBA、C3H、A/J等［9］，以前兩種最常用。

然而，現(xiàn)存的小鼠哮喘模型有許多局限性。首先，不出現(xiàn)類似人類哮喘的黏膜炎癥和上皮層嗜酸性粒細(xì)胞浸潤；其次，致敏和激發(fā)往往需要多次，否則不會(huì)出現(xiàn)人類哮喘典型的慢性氣道炎癥和上皮變化；最后，會(huì)出現(xiàn)過敏性肺泡炎或超敏性肺炎，掩蓋了氣道的炎癥損害［10］。此外，小鼠體積小，體質(zhì)量輕，氣道短，這給操作及取材帶來許多困難。

筆者認(rèn)為，基于生物特性考慮，過敏性疾病的研究以豚鼠為佳，免疫及基因手段的應(yīng)用首選小鼠。“雌雄不拘”一般不可取，同籠飼養(yǎng)更是不可行。哮喘模型的建立以及后續(xù)實(shí)驗(yàn)往往超過4周，期間若發(fā)生交配、孕娩、哺乳等事件，以及更為嚴(yán)重的因爭奪雌鼠而發(fā)生的雄鼠打斗，都會(huì)嚴(yán)重影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確、穩(wěn)定和可靠。如果分籠飼養(yǎng)并分屬不同組，雌雄之間本有差異不具可比性。一般哮喘研究建議選用同一性別的動(dòng)物。為避免雌激素及生理周期的影響，多選雄性；小鼠則選雌性，因其變應(yīng)性氣道炎癥比雄性更為顯著，嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤更為明顯，同時(shí)支氣管肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞數(shù)也較多。值得注意的是，考慮到實(shí)驗(yàn)過程中可能出現(xiàn)的誤傷、死亡，動(dòng)物個(gè)體差異性及個(gè)別采集樣本的不合格等因素，論文“結(jié)果”描述時(shí)，應(yīng)標(biāo)明入組例數(shù)與實(shí)際檢測例數(shù)，這可以增強(qiáng)研究論文的可信性。

3　模型建立

哮喘模型建立的要素諸多，篇幅有限，本文在此不一一提及，僅結(jié)合自身實(shí)踐就一些主要問題加以探討。

3.1嚴(yán)格篩選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和改進(jìn)飼養(yǎng)條件實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)選擇較易誘出變態(tài)反應(yīng)的動(dòng)物，為避免實(shí)驗(yàn)前接觸環(huán)境中可能存在的雞卵清蛋白（OVA），入組動(dòng)物應(yīng)從母代就接受特殊飼料喂養(yǎng)，并由動(dòng)物中心專業(yè)專職人員負(fù)責(zé)，嚴(yán)格按照清潔級(jí)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，如無菌環(huán)境、恒溫恒濕等，避免環(huán)境因素對實(shí)驗(yàn)的干擾。

3.2致敏劑及致敏方法致敏方法能夠影響研究對象的過敏反應(yīng)，合理的模型選擇需要綜合考慮致敏原與佐劑的類型、致敏原輸入方式及劑量等。模型建立時(shí)應(yīng)選用與人類哮喘相關(guān)聯(lián)的抗原來進(jìn)行致敏和激發(fā)，且輸入方式也應(yīng)同人類哮喘發(fā)生的生理病理機(jī)制相適合。

3.2.1致敏劑及佐劑的選擇基于大量研究報(bào)道，致敏階段推薦被動(dòng)免疫中復(fù)合形式的OVA致敏及激發(fā)，以O(shè)VA為致敏原（一般致敏時(shí)用Ⅴ級(jí)、激發(fā)時(shí)用Ⅱ級(jí)），Al（OH）3為免疫佐劑。

致敏劑一般由抗原和佐劑組合而成，佐劑能夠增強(qiáng)免疫原性及免疫應(yīng)答，防止脫敏情況發(fā)生。作為經(jīng)典的致敏原，OVA為異種蛋白，有很強(qiáng)的抗原性和免疫原性，易于獲得，常與Al（OH）3聯(lián)合使用。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)氫氧化鋁干粉難溶于水，與OVA不能很好混合，靜置后明顯分層，在進(jìn)行腹腔或皮下注射時(shí)極易堵塞針頭，嚴(yán)重影響致敏效果。佐劑與抗原的混合程度影響致敏原的免疫原性，故我們在Se-Woong Oh等方法的基礎(chǔ)上，選用硫酸鋁鉀代替Al（OH）3干粉（Sigma公司的凝膠劑也可以，但價(jià)格較昂貴［11］。董峰等在哮喘造模中發(fā)現(xiàn)Al（OH）3凝膠在增強(qiáng)OVA致敏反應(yīng)的效果上優(yōu)于干粉劑）［12］。硫酸鋁鉀易溶于水，常用作誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)的佐劑，這符合哮喘的免疫反應(yīng)特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中我們用NaOH調(diào)節(jié)pH值，硫酸鋁鉀與NaOH反應(yīng)生成Al（OH）3，形成混懸小球后與OVA混合充分，增強(qiáng)了致敏效果，且不堵塞針頭。

3.2.2致敏方法的改進(jìn)增加致敏部位有利于哮喘氣道慢性變應(yīng)性炎癥模型及氣道重塑模型的建立。Christina A.Herrick等發(fā)現(xiàn)皮膚是重要的致敏器官，單純腹腔注射不能很好地誘發(fā)Th2型變態(tài)反應(yīng)，故實(shí)驗(yàn)中我們建議采用腹腔注射和皮下注射相結(jié)合的方法，多點(diǎn)致敏［13］。

在激發(fā)時(shí)影響模型成功的因素主要有：激發(fā)時(shí)間與激發(fā)頻次、霧化器、激發(fā)時(shí)OVA的濃度。首先，慢性哮喘模型的建立方法與急性相比，主要區(qū)別在于激發(fā)時(shí)間更長。為了更好地模擬氣道慢性炎癥過程這一哮喘本質(zhì)，我們延長了霧化激發(fā)時(shí)間，并采用連續(xù)激發(fā)14 d，小鼠每次30 min，豚鼠則從30 s開始逐漸適應(yīng)性延長，以形成典型的慢性變應(yīng)性炎癥。當(dāng)然，氣道重塑模型則需要在此基礎(chǔ)上至少延長2周。其次，壓縮霧化激發(fā)的方式要優(yōu)于傳統(tǒng)的超聲霧化激發(fā)［14］。壓縮霧化方法產(chǎn)生的顆粒較小，平均中位直徑3.5 μm，能很好地進(jìn)入小氣道，從而誘導(dǎo)小氣道炎癥，而超聲霧化器產(chǎn)生的霧化顆粒大，大部分作用于口咽部，不能到達(dá)小氣道，因而激發(fā)效果不好［15］。激發(fā)時(shí)的OVA濃度較多選用1%。

4　模型的判定

目前對于哮喘模型建立是否成功，尚沒有一個(gè)規(guī)范的統(tǒng)一判斷標(biāo)準(zhǔn)。哮喘的動(dòng)物模型多種多樣，但均應(yīng)具備氣道變應(yīng)性炎癥和氣道高反應(yīng)性的兩大基本特征。驗(yàn)證模型是否成功主要從以下4個(gè)方面入手：動(dòng)物的總體外觀及行為學(xué)表現(xiàn)；炎癥細(xì)胞分類及計(jì)數(shù)；病理組織觀察；氣道反應(yīng)性測定。

4.1總體外觀及行為學(xué)表現(xiàn)通常結(jié)合動(dòng)物模型的整體外觀以及類似人類哮喘發(fā)作的典型表現(xiàn)，如煩躁不安或安靜少動(dòng)、點(diǎn)頭呼吸、呼吸加深加快、前肢縮抬、弓背直立、二便失禁等，判斷模型是否成功，并進(jìn)一步評(píng)價(jià)藥物作用。

4.2炎癥細(xì)胞分類及計(jì)數(shù)既往多采用瑞氏-吉姆薩染色法，但實(shí)際操作中，由于支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本較稀薄，受灌洗操作水平影響較大，普通推片及甩片機(jī)甩片效果均不理想，炎癥細(xì)胞在玻片上薄厚疏密分布不均，涂片染色時(shí)易脫片，這直接影響鏡下觀察及計(jì)數(shù)。我們結(jié)合史菲等支氣管肺泡灌洗術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化操作，根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行標(biāo)本采集，采用液基沉降法涂片，HE染色法染色計(jì)數(shù)，效果比較滿意［16］。此外，Diff Quik染色雖成本稍高，效果也比較理想。

4.3病理組織觀察光鏡下進(jìn)行模型動(dòng)物病理組織檢查，觀察其變化。并采用HE染色及其結(jié)果的Ashcroft評(píng)分觀察支氣管及肺組織炎性細(xì)胞浸潤情況，方法不再贅述。

4.4氣道反應(yīng)性的測定我們采用無創(chuàng)性體外非侵入性檢測法進(jìn)行氣道反應(yīng)性的測定。其具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）小鼠非限制性；2）手段非侵入性；3）小鼠在清醒狀態(tài)下自主呼吸；4）小鼠無感覺缺失；5）可用于長時(shí)間和重復(fù)檢測。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用整體容積描記箱（體描箱）記錄小鼠呼吸曲線，并計(jì)算出Penh值，然后根據(jù)Penh值的變化，運(yùn)用全身性體積描記法（WBP）無創(chuàng)性地測定小鼠氣道反應(yīng)性。Penh（enhanced pause）=［呼氣峰壓（PEP）/吸氣峰壓（PIP）］×［呼氣時(shí)間（Te）-松弛時(shí)間（Tr）］/Tr，簡之，即Penh=（PEP/PIP）×Pause，Pause=（Te-Tr）/Tr，Tr是呼氣壓力降為36%時(shí)所經(jīng)歷的Te。實(shí)驗(yàn)時(shí)按濃度梯度給予乙酰膽堿，計(jì)算Penh較基線增高的倍數(shù)來反映氣道反應(yīng)性的高低。相較而言，有創(chuàng)性檢測方法可直接檢測氣道阻力和順應(yīng)性，但需要麻醉狀態(tài)下氣管插管，對氣道反應(yīng)性會(huì)產(chǎn)生影響，且不能用于長期反復(fù)檢測，因此無法用于對哮喘肺功能變化的動(dòng)態(tài)研究，不能用于觀察藥物干預(yù)作用的動(dòng)態(tài)變化。

哮喘實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制備方法及模型成功的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，仍需在今后的研究中進(jìn)一步規(guī)范，以促進(jìn)哮喘研究的深入發(fā)展。

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TAN Jiejun，WANG Tiantian，LIU Zhiwei，et al.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Heilongjiang，Harbin 150040，China.

R562.2+5

A

1004-745X（2016）05-0816-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.05.018

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81473724）；哈爾濱市應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目（2014RFXJ098）；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目（2015-08）
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（電子郵箱：wangyp8899@163.com）

2016-01-27）