中東呼吸綜合征冠狀病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)以及疫苗和治療研究進(jìn)展

盧帥 秦堃 譚文杰

102206北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)醫(yī)學(xué)病毒學(xué)與病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

·綜述·

中東呼吸綜合征冠狀病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)以及疫苗和治療研究進(jìn)展

盧帥 秦堃 譚文杰

102206北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)醫(yī)學(xué)病毒學(xué)與病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS?CoV）是2012年首次發(fā)現(xiàn)的具有高病死率、可感染人的一種新型冠狀病毒，給全球公共健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅。目前，針對(duì)中東呼吸綜合征冠狀病毒的病毒分離、免疫學(xué)及核酸檢測(cè)方法已經(jīng)建立，特異性的疫苗和治療藥物也正在研發(fā)之中，成為控制MERS?CoV感染蔓延的有力武器。本文就MERS?CoV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及疫苗和治療研究進(jìn)展作一綜述，以期為MERS?CoV的防控提供參考。

Fund program：Mega Project for Infectious Disease Research of China（2014ZX10004001）

中東呼吸綜合征冠狀病毒是2012年從沙特阿拉伯一位因急性肺炎伴腎功能衰竭而死亡的患者呼吸道上皮細(xì)胞中分離的一種新型冠狀病毒［1］。該病毒首先在沙特阿拉伯發(fā)現(xiàn)后，迅速向中東其他國(guó)家蔓延，隨后在埃及、突尼斯、法國(guó)、德國(guó)、英國(guó)、韓國(guó)、中國(guó)等全球27個(gè)國(guó)家都有了感染病例的報(bào)道。自2012年9月疫情爆發(fā)到2016年5月16日，WHO共收到全球1733例實(shí)驗(yàn)室確診感染MERS?CoV的病例報(bào)告，其中628例死亡，病死率達(dá)36%，遠(yuǎn)高于發(fā)生在2003年的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus，SARS?CoV）［2］。MERS?CoV的高病死率及快速蔓延，使其成為全球公共健康的嚴(yán)重威脅。

冠狀病毒（Coronavirus，CoV）屬巢式病毒目、冠狀病毒科、冠狀病毒屬，為有包膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)27?32kb，是目前已知最大的RNA病毒。國(guó)際病毒學(xué)分類(lèi)委員會(huì)（International committee on taxonomy of viruses，ICTV）將冠狀病毒分為α、β、γ、δ 4個(gè)病毒屬，其中MERS?CoV為β屬，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析其與蝙蝠冠狀病毒BtCoV?HKU4、BtCoV?HKU5遺傳關(guān)系接近，并且有報(bào)道其可能源于中東地區(qū)的單峰駱駝［3］。MERS?CoV基因組全長(zhǎng)約30kb，5′和3′端各有一個(gè)非編碼區(qū)，距5′端2／3區(qū)域包含兩個(gè)重疊的開(kāi)放閱讀框（OpeningReading Frame，ORF）：ORF1a和ORF1b，主要負(fù)責(zé)編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的酶類(lèi)等非結(jié)構(gòu)蛋白；而3′端1／3區(qū)域主要負(fù)責(zé)編碼棘突蛋白（Spike，S）、膜蛋白（Membrane，M）、小膜蛋白（Envelpoe，E）和核衣殼蛋白（Nucleocapsid，N）等四種結(jié)構(gòu)蛋白［4］。

目前已知能導(dǎo)致人類(lèi)感染的冠狀病毒有HCoV?229E、HCoV?OC43、SARS?CoV、HKU1、HCoV?NL63和MERS?CoV。其中MERS?CoV是繼SARS?CoV之后的又一高致死率的冠狀病毒，也受到全球越來(lái)越多的關(guān)注，因此快速準(zhǔn)確的診斷及安全有效的疫苗藥物對(duì)控制MERS?CoV感染十分關(guān)鍵。通常認(rèn)為病毒分離培養(yǎng)是實(shí)驗(yàn)室診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但MERS?CoV的培養(yǎng)較為特殊，不僅依賴(lài)較為敏感的細(xì)胞系，且需在生物安全三級(jí)（Biosafety Level?3，BSL?3）實(shí)驗(yàn)室操作，這對(duì)MERS?CoV的病毒培養(yǎng)產(chǎn)生了一定的局限性。目前，臨床尚無(wú)對(duì)MERS?CoV有效的疫苗或特異性治療藥物。但對(duì)MERS?CoV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法在不斷優(yōu)化，安全有效的疫苗和藥物也在不斷研究。本文就MERS?CoV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法及疫苗、藥物研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 MERS?CoV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1.1 MERS?CoV的抗體檢測(cè)血清學(xué)方法主要是檢測(cè)血清中的MERS?CoV結(jié)構(gòu)蛋白特異性抗體，可以用來(lái)評(píng)價(jià)冠狀病毒的血清流行病學(xué)、追蹤其傳播途徑進(jìn)行溯源，也可以用來(lái)監(jiān)測(cè)感染和疾病的進(jìn)展。MERS?CoV感染者的血清中抗體主要為IgM和IgG，其中IgM一般認(rèn)為主要出現(xiàn)在感染早期階段，而IgG抗體可在感染后長(zhǎng)期存在，WHO對(duì)血清學(xué)陽(yáng)轉(zhuǎn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)是恢復(fù)期血清抗體滴度是急性期的4倍或以上，因此對(duì)MERS?CoV感染的抗體檢測(cè)主要針對(duì)的是IgG。研究者們已建立了一系列檢測(cè)方法，常見(jiàn)如免疫熒光（Immunoflurescence assay，IFA）、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzyme?linked immunosorbent assay，ELISA）、蛋白印記（Western blot，WB）、蛋白芯片方法（Protein microarray）和假病毒中和實(shí)驗(yàn)（Pesudoparticle neutralization test，ppNT）、微量中和實(shí)驗(yàn)（Micro neutralization test，MNT）等。

血清學(xué)檢測(cè)方法最大的問(wèn)題是假陽(yáng)性和假陰性，Chan KH等通過(guò)IFA篩查并用中和抗體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，SARS患者血清中存在MERS?CoV的中和抗體［5］，提示了這種方法可能出現(xiàn)的假陽(yáng)性。同時(shí)IFA方法對(duì)熒光顯色的判斷具有主觀(guān)差異，難以標(biāo)準(zhǔn)化操作，整個(gè)診斷程序較為復(fù)雜，不適合高通量的檢測(cè)。而Corman等利用RT?PCR對(duì)MERS?CoV感染者拭子標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測(cè)時(shí)呈現(xiàn)陰性，但I(xiàn)FA方法卻在患者血清中檢出抗體［6］，表明IFA可以作為其他檢測(cè)方法的補(bǔ)充。

ELISA檢測(cè)方法則是以裂解的病毒或重組蛋白作為抗原，來(lái)檢測(cè)血清中的抗體。通常認(rèn)為ELISA檢測(cè)方法的敏感性較高，在對(duì)確診SARS?CoV感染的患者實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)陽(yáng)性率達(dá)85%?100%，與IFA比較具有相當(dāng)?shù)拿舾行浴６诓煌牟±龑?duì)照研究中發(fā)現(xiàn)IFA和基于病毒抗原的ELISA對(duì)SARS?CoV的診斷存在0%?12.2%的假陽(yáng)性率［7］。尤其是對(duì)一些在系統(tǒng)進(jìn)化上較為接近的冠狀病毒，就要考慮到ELISA反應(yīng)的特異性問(wèn)題。N和S蛋白作為冠狀病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白，其中N蛋白在病毒含量高，但相對(duì)保守，SARS–CoV N全長(zhǎng)基因與OC43、HKU1、MERS?CoV N基因的核苷酸同源性分別為34.2%、33.0%和46.7%［7］，因此在血清學(xué)檢測(cè)N抗體時(shí)交叉反應(yīng)較強(qiáng)。Woo等在研究基于SARS?CoV N蛋白的ELISA檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)與基于S蛋白的WB確診實(shí)驗(yàn)相比有87.9%的假陽(yáng)性［8］，同時(shí)也有報(bào)道稱(chēng)基于N蛋白的SARS?CoV檢測(cè)與其他人冠狀病毒存在較強(qiáng)的交叉反應(yīng)［9］。Al?Abdallat等利用與MERS?CoV較為接近的BtCoV?HKU5.2 N蛋白的ELISA初篩血清抗體，再用IFA和MNT實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)MERS?CoV特異抗體［10］。在對(duì)密接人群的血清學(xué)篩查中，Buchholz等建立了兩步檢測(cè)方法，利用病毒感染細(xì)胞的IFA作為初篩，以中和實(shí)驗(yàn)作為確診，表現(xiàn)出很好的效果［11］。

Prrera等構(gòu)建了MERS?CoV假病毒對(duì)人和單峰駝血清進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ppNT與傳統(tǒng)的MNT方法檢測(cè)駱駝血清MERS?CoV抗體的陽(yáng)性率分別為98.2%和93.6%，二者表現(xiàn)出很好的相關(guān)性，但均不能排除MERS?CoV相近毒株的交叉反應(yīng)［12］。但是ppNT檢測(cè)MERS?CoV的方法無(wú)需在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室操作，適合大規(guī)模的血清流行病學(xué)研究。也有報(bào)道利用正確折疊和糖基化的S1片段制成的蛋白芯片來(lái)檢測(cè)MERS?CoV，結(jié)果顯示與其他人冠狀病毒感染血清均無(wú)假陽(yáng)性［13］。這種方法需要樣本少，可用干燥血點(diǎn)來(lái)檢測(cè)，是一種快速、簡(jiǎn)便、高通量的檢測(cè)方法。

1.2 MERS?CoV的抗原檢測(cè)MERS?CoV的抗原檢測(cè)主要是針對(duì)人或動(dòng)物感染標(biāo)本如拭子等，來(lái)確定病毒在組織中的含量。Song D等利用多肽作為免疫原，篩選雜交瘤細(xì)胞獲得了特異性N蛋白鼠單抗，制備了針對(duì)MERS?CoV N抗原的膠體金快速檢測(cè)試紙條，并對(duì)單峰駝鼻拭子標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，證明與針對(duì)upE、ORF1a的RT?PCR方法表現(xiàn)出較高的一致性［14］。此外，針對(duì)MERS?CoV N抗原的雙抗體夾心ELISA方法也由Chen Y等建立，其病毒檢測(cè)限可達(dá)10 TCID50／0.1 ml，同時(shí)證明與其他人冠狀病毒和流感病毒、腺病毒等都無(wú)交叉反應(yīng)［15］。Yamaoka Y等利用小麥胚芽無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)制備了MERS?CoV N抗原及鼠單克隆抗體，建立了雙抗體夾心的ELISA和膠體金檢測(cè)方法［16］，具有很好的敏感性和特異性，這些方法都有望用于人群或駱駝MERS?CoV感染的檢測(cè)。但是，由于臨床樣本中MERS?CoV的排毒規(guī)律不清楚，選取合適的標(biāo)本和采樣時(shí)間對(duì)提高檢出率十分重要。

1.3 MERS?CoV的核酸檢測(cè)對(duì)MERS?CoV的分子學(xué)檢測(cè)方法包括real time RT?PCR和反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Reverse transcription loop?mediated isothermal amplification assays，RT?LAMP）等。根據(jù)MERS?CoV基因組結(jié)構(gòu)（HCoV?EMC／2012，JX869059），RT?PCR的目的基因可包括：upE、ORF1a、ORF1b、RdRp和N基因。Corman等建立了upE與ORF1b為靶標(biāo)的實(shí)時(shí)熒光定量RT?PCR方法，其中upE基因作為篩查基因，而ORF1b基因作為確診的目的基因，upE為目的基因的RT?PCR可檢測(cè)低至3.4拷貝／反應(yīng)的RNA，而ORF1b最低檢測(cè)限只能達(dá)到64拷貝／反應(yīng)，這種方法組合具有很好的特異性，在檢測(cè)其他呼吸道病毒如呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒等都表現(xiàn)出陰性［17］，具有很好的診斷性能。國(guó)內(nèi)也有對(duì)MERS?CoV核酸檢測(cè)方法優(yōu)化的報(bào)道［18］。Lu X等從全長(zhǎng)N基因中選出兩段N2（29424?29442 bp）和N3（28747?28771 bp），把upE和N2作為篩查的目的基因，而N3作為確診的目的基因，這種方法證明具有很好的敏感性和特異性。對(duì)MERS?CoV RNA最低檢測(cè)限可達(dá)10拷貝／反應(yīng)，具有很好的特異性，并且對(duì)其他呼吸道病毒以及人冠狀病毒都能很好地區(qū)分［19］。Chan JF等針對(duì)冠狀病毒的先導(dǎo)序列的實(shí)時(shí)定量RT?PCR檢測(cè)拭子標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)限可達(dá)5 RNA拷貝／反應(yīng)［20］。

鑒于RT?PCR方法的溫度循環(huán)依賴(lài)性，不適合現(xiàn)場(chǎng)操作，簡(jiǎn)便的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)逐漸發(fā)展起來(lái)。Kazuya等利用RT?LAMP靶向針對(duì)N基因保守區(qū)段的擴(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)MERS?CoV用時(shí)不超過(guò)1小時(shí)，且檢出低限可達(dá)3.4 RNA拷貝每反應(yīng)［21］。Sanchita等利用RT?LAMP擴(kuò)增MERS?CoV ORF1a，ORF1b和upE基因，檢測(cè)限為0.02到0.2 PFU每反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中MERS?CoV的檢測(cè)只需30?50 min，且與其他呼吸道病毒無(wú)交叉［22］。關(guān)麗等對(duì)RT?LAMP進(jìn)行優(yōu)化，建立了基于濁度儀和顏色變化的簡(jiǎn)單、快速的RT?LAMP［23］，雖然檢測(cè)限低于RT?PCR，但操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、非溫度循環(huán)依賴(lài)，相比RT?PCR更為方便快速。但是RT?PCR或RT?LAMP也有一定的局限性，尤其是在病毒逃逸及標(biāo)本如拭子RNA提取方法不當(dāng)時(shí)，檢出率會(huì)降低。同時(shí)RT?PCR方法的特異性也會(huì)因其他RNA的污染而受到干擾，這與SARS?CoV等其他RNA病毒檢測(cè)遇到的問(wèn)題是一樣的。

2 MERS?CoV的疫苗研究

MERS?CoV的S蛋白是介導(dǎo)病毒顆粒與細(xì)胞膜融合的結(jié)構(gòu)蛋白，能誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生。通常S蛋白可被切割成兩個(gè)部分S1和S2，其中S1介導(dǎo)病毒的附著，S2介導(dǎo)膜融合［24］。對(duì)MERS?CoV S蛋白的結(jié)構(gòu)研究顯示，其S1區(qū)段有重要的受體結(jié)合區(qū)RBD，其主要與細(xì)胞表面受體二肽基肽酶4（Dipeptidyl peptidase 4，DDP4）結(jié)合，從而介導(dǎo)病毒的入侵［25］。目前尚無(wú)對(duì)人或動(dòng)物有效的MERS?CoV疫苗，科學(xué)家們進(jìn)行疫苗研究關(guān)注的主要是S蛋白。Volz A等利用表達(dá)MERS?CoV S全長(zhǎng)的改良型痘苗病毒安卡拉株MVA免疫小鼠［26］，Coleman等用桿狀病毒表達(dá)的S蛋白顆粒加佐劑免疫小鼠［27］，能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生中和抗體，并具有保護(hù)作用。Du L等發(fā)現(xiàn)S蛋白377?662位氨基酸能誘導(dǎo)小鼠中和抗體的產(chǎn)生［28］，此區(qū)域正是受體結(jié)合區(qū)域，提示可作為MERS?CoV疫苗研究的靶標(biāo)。Mou H等利用帶有人IgG Fc段的受體結(jié)合區(qū)（Receptor binding domain，RBD）（S，377?588aa）重組蛋白免疫兔子，發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)產(chǎn)生很高的中和抗體［29］；Du L等發(fā)現(xiàn)截短的RBD（S，377?588aa）蛋白能抑制小鼠感染MERS?CoV，并能產(chǎn)生很強(qiáng)的中和抗體［30］。Lan J等利用不同的佐劑在小鼠模型實(shí)驗(yàn)研究中也發(fā)現(xiàn)RBD亞單位疫苗具有較好的保護(hù)效果［31］，在恒河猴模型中也發(fā)現(xiàn)RBD亞單位疫苗能起到部分保護(hù)效果［32］。而Wang L等用包含MERS?CoV S全長(zhǎng)的DNA疫苗證明了其在小鼠和恒河猴模型中的良好的保護(hù)效果［33］。Wang C等利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備了MERS?CoV病毒樣顆粒（Virus like particles，VLPs），并在恒河猴模型中證明具有較好的保護(hù)效果［34］。此外還有MERS?CoV S蛋白表位多肽疫苗，并在小鼠體內(nèi)證明能夠誘導(dǎo)較高的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平［35］。

3 MERS?CoV的抗病毒藥物研究

目前，臨床上尚無(wú)針對(duì)MERS?CoV感染的特異性治療藥物，MERS?CoV的治療多依賴(lài)于廣譜的抗病毒及支持治療，但一些特異性的藥物展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。Falzarano等用α干擾素（Interferon?α，IFN?α）和利巴韋林聯(lián)合治療恒河猴MERS?CoV感染模型，發(fā)現(xiàn)能降低病毒復(fù)制，起到一定的延緩病情作用，而在人體身上采用上述聯(lián)合治療，對(duì)部分患者可能有效［36］。Omrani等對(duì)MERS?CoV患者的隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療可部分改善MERS?CoV感染患者生存率［37］?？梢?jiàn)，IFN聯(lián)合利巴韋林對(duì)MERS?CoV的治療作用有限。在對(duì)MERS?CoV感染的特異靶標(biāo)藥物的研究發(fā)現(xiàn)，MERS?CoV在膜融合過(guò)程中S2區(qū)段的七肽重復(fù)區(qū)HR1和HR2的融合是十分關(guān)鍵的。以此為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)了類(lèi)似于HR2的多肽抑制劑，在體外實(shí)驗(yàn)證明可抑制病毒的膜融合與入侵［38］。Channappanavar等設(shè)計(jì)了HR2多肽類(lèi)似物HR2P?M2，并在MERS?CoV感染的動(dòng)物模型中展示了較好的效果［39］。此外，抗體治療也有很大進(jìn)展。許多MERS?CoV S單抗都表現(xiàn)出很好的中和活性，全人源的單抗有望作為較為安全的治療藥物進(jìn)入臨床［40］。

MERS?CoV作為嚴(yán)重威脅全球公共健康的病毒，快速準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和安全有效的治療藥物是控制其蔓延的關(guān)鍵。目前，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法多樣，對(duì)于不同病例、不同病程的患者，選擇合適的采樣部位、樣本及檢測(cè)手段對(duì)準(zhǔn)確的診斷十分重要。MERS?CoV病死率高，危害大，但目前臨床尚無(wú)有效藥物。因此，對(duì)MERS?CoV檢測(cè)方法的優(yōu)化及特異性疫苗藥物的開(kāi)發(fā)仍是應(yīng)對(duì)MERS所面臨的重要工作。

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Development of laboratory diagnosis，vaccines and therapies for the Middle East respiratory syndrome coronavirus

Lu Shuai，Qin Kun，Tan Wenjie

Key Laboratory of Medical Virology，National Health and Family Planning Commission，National Institute for Viral Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China（Lu S，Qin K，Tan WJ）

The Middle East respiratory syndrome coronavirus，firstly detected in 2012，was a novel coronavirus causing high mortality to humans，which posed a severe threat to public health.Presently，laboratory methods for virus isolation and diagnosis were built，as well as the development of vaccines and drugs for the MERS?CoV，which will be a powerful weapon to control its spread.This review summarizes recent advances on laboratory diagnosis，vaccines and therapies for MERS?CoV，which might provide implications for the prevention and control of this serious disease.

Middle East respiratory syndrome coronavirus；Diagnosis；Vaccine；Therapy

譚文杰，E?mail：tanwj28＠163.com

10.3760／cma.j.issn.1003?9279.2016.06.000

中東呼吸綜合征冠狀病毒；檢測(cè)；疫苗；治療

傳染病防治重大專(zhuān)項(xiàng)（2014ZX10004001）

2016?05?18）