對ISO 4134：1999標(biāo)準(zhǔn)的分析及修訂建議

繆素娜戴煦徐維嘉

（華測檢測認(rèn)證集團(tuán)股份有限公司廣東深圳518101）

對ISO 4134：1999標(biāo)準(zhǔn)的分析及修訂建議

繆素娜戴煦徐維嘉

（華測檢測認(rèn)證集團(tuán)股份有限公司廣東深圳518101）

對肉和肉制品中L-（+）-谷氨酸含量測定的國家標(biāo)準(zhǔn)和國際標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了比較分析，指出國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 4134：1999存在明顯的技術(shù)爭議，進(jìn)而對ISO 4134：1999存在問題與不足進(jìn)行了深入分析，并提出了一些具體的修訂建議，目的在于引起重視和廣泛討論，以促進(jìn)ISO 4134：1999的盡快修訂，提高其適用性。

ISO：1999；L-（+）-谷氨酸；測定；修訂；建議

1 前言

L-（+）-谷氨酸含量是肉和肉制品中的重要評價(jià)指標(biāo)之一[1]，L-（+）-谷氨酸在肉和肉制品中以自由流動的游離態(tài)和構(gòu)成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的結(jié)合態(tài)兩種形式存在，其中游離態(tài)L-（+）-谷氨酸主要作為鮮味風(fēng)味前體物評價(jià)指標(biāo)之一[2-7]，結(jié)合態(tài)L-（+）-谷氨酸主要作為蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值評價(jià)指標(biāo)之一[7]，兩者在肉和肉制品中的含量差別可達(dá)上百倍[7]，測定兩者具有不同的指導(dǎo)意義。目前國內(nèi)沒有專門針對肉和肉制品中L-（+）-谷氨酸測定的標(biāo)準(zhǔn)，其中國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》[8]能滿足肉和肉制品中L-（+）-谷氨酸的測定，其所測得的L-（+）-谷氨酸為總L-（+）-谷氨酸（游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的總和）。國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 4134：1999《肉和肉制品中L-（+）-谷氨酸的測定參考法》[9]是專門針對肉和肉制品中L-（+）-谷氨酸含量測定的標(biāo)準(zhǔn)，其檢測原理是采用0℃的高氯酸溶液對試樣中的L-（+）-谷氨酸進(jìn)行提取，氧化態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）在谷氨酸脫氫酶（GIDH）存在的條件下被L-（+）-谷氨酸還原，得到的還原態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）在心肌黃酶的作用下與碘四唑硝基氯（INT）反應(yīng)生成甲瓚，用分光光度計(jì)在492 nm處測定甲瓚的吸收峰，從而計(jì)算L-（+）-谷氨酸含量。從ISO 4134：1999檢測原理看，其所測得的L-（+）-谷氨酸為游離態(tài)L-（+）-谷氨酸，但標(biāo)準(zhǔn)中未對其進(jìn)行明確界定和說明，容易誤導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)使用者以為所測得的為總L-（+）-谷氨酸，從而覺得同一樣品采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.124-2003和國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 4134：1999所測得的L-（+）-谷氨酸結(jié)果相差甚遠(yuǎn)，輕者造成困惑，甚者引起檢測糾紛或帶來經(jīng)濟(jì)損失。因此筆者認(rèn)為有必要對ISO 4134：1999標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行深入分析，并提出具體的修訂建議。

2 ISO 4134：1999標(biāo)準(zhǔn)存在問題與不足

通過對ISO 4134：1999標(biāo)準(zhǔn)條文進(jìn)行解讀分析，并結(jié)合筆者多年研究經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為其存在以下問題與不足。

2.1 存在問題

（1）L-（+）-谷氨酸在肉和肉制品中分別以自由流動的游離態(tài)和構(gòu)成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的結(jié)合態(tài)兩種形式存在，而標(biāo)準(zhǔn)中“9.2樣品前處理”關(guān)于L-（+）-谷氨酸提取過程，主要是將試樣用絞肉機(jī)絞爛后，取約50 g加入100 mL 0℃稀高氯酸溶液（1 mol/L）進(jìn)行均質(zhì)，均質(zhì)后離心過濾取濾液。由此可見該提取過程并沒有將構(gòu)成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的結(jié)合態(tài)L-（+）-谷氨酸水解釋放出來，也就是濾液中被檢測的L-（+）-谷氨酸實(shí)質(zhì)上僅為游離L-（+）-谷氨酸，筆者也通過試驗(yàn)證實(shí)了這一個觀點(diǎn)。但標(biāo)準(zhǔn)文本并未對此進(jìn)行明確界定和說明，容易誤導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)使用者。

（2）標(biāo)準(zhǔn)中5.7的心肌黃酶檢測溶液和5.9的谷氨酸脫氫酶溶液均以mg/mL為單位，但未標(biāo)識相應(yīng)的酶活力單位。由于酶活力單位是酶制劑最關(guān)鍵的指標(biāo)，該指標(biāo)的缺失，會使標(biāo)準(zhǔn)使用者在選購和配制試劑時(shí)無可適從，從而導(dǎo)致檢測無法開展或檢測失敗。

（3）根據(jù)ISO 1442：1997《肉和肉制品水分含量測定》[10]，Wm（水分含量）是以質(zhì)量分?jǐn)?shù)（百分比）表示，從附錄C關(guān)于L-（+）-谷氨酸含量計(jì)算公式由來的推導(dǎo)看，10.3試樣L-（+）-谷氨酸的含量計(jì)算公式中的“Wm/100”不正確，應(yīng)去掉“/100”；另從附錄C關(guān)于計(jì)算公式由來的推導(dǎo)看，Wg實(shí)際指的是試樣（包括水分）的L-（+）-谷氨酸含量，因此公式下方的符號說明“Wg是指試樣干基L-（+）-谷氨酸含量”的說法有誤，應(yīng)去掉“干基”。

2.2 不足

（1）9.3的“繪制吸光值隨時(shí)間變化的曲線，將曲線反向延長與縱坐標(biāo)交匯，推算反應(yīng)開始時(shí)吸光值（參見附錄B）”的做法不科學(xué)。用曲線外推法尋找反應(yīng)起始值適用于隨著反應(yīng)時(shí)間延長反應(yīng)產(chǎn)物檢測結(jié)果穩(wěn)步增長且沒有反應(yīng)終點(diǎn)的運(yùn)算[11]，而事實(shí)上標(biāo)準(zhǔn)中的檢測試劑是過量的，隨著L-（+）-谷氨酸消耗完畢，反應(yīng)產(chǎn)物的吸光值則不再增大，因此正確的做法應(yīng)以反應(yīng)產(chǎn)物吸光值的穩(wěn)定值作為反應(yīng)終點(diǎn)，并以反應(yīng)終點(diǎn)的吸光值作為檢測結(jié)果。盡管L-（+）-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣檢測溶液均采用外推法推算反應(yīng)開始時(shí)吸光值作為檢測結(jié)果，與均采用反應(yīng)終點(diǎn)吸光值作為檢測結(jié)果運(yùn)算得到的L-（+）-谷氨酸含量大體上一致，但采用外推法推算反應(yīng)開始時(shí)吸光值得到的間接檢測結(jié)果肯定不如直接測得的反應(yīng)終點(diǎn)檢測結(jié)果真實(shí)可靠，具有造成檢測結(jié)果誤差增大的風(fēng)險(xiǎn)。

（2）標(biāo)準(zhǔn)中采用已知濃度的L-（+）-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.02 mg/mL）所對應(yīng)的吸光值差來對反應(yīng)產(chǎn)物甲瓚的摩爾吸光系數(shù)[12]進(jìn)行單點(diǎn)校正，然后根據(jù)甲瓚的摩爾吸光系數(shù)和試樣檢測溶液的吸光值差、稀釋倍數(shù)計(jì)算試樣L-（+）-谷氨酸含量。當(dāng)試樣檢測溶液L-（+）-谷氨酸濃度與L-（+）-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.02 mg/mL）相差較大時(shí)，容易造成檢測結(jié)果偏差較大，因此采用單點(diǎn)校正存在局限。

（3）反應(yīng)產(chǎn)物甲瓚由分光光度計(jì)進(jìn)行測定，每個樣品測定均需人手單獨(dú)操作，終點(diǎn)判定需每隔2 min重復(fù)讀數(shù)直到讀數(shù)穩(wěn)定為止，操作繁瑣、檢測效率低。

3 ISO 4134：1999標(biāo)準(zhǔn)修訂建議

針對上述存在問題與不足，筆者提出如下修訂意見：

（1）針對問題1：對標(biāo)準(zhǔn)測定的L-（+）-谷氨酸進(jìn)行明確界定，并將標(biāo)準(zhǔn)的測定對象從僅為肉和肉制品中游離L-（+）-谷氨酸，擴(kuò)大到肉和肉制品中游離L-（+）-谷氨酸和總L-（+）-谷氨酸。相應(yīng)地，在術(shù)語定義增加游離L-（+）-谷氨酸和總L-（+）-谷氨酸的術(shù)語解釋；在檢測步驟里增加試樣總L-（+）-谷氨酸的提?。辉谖庵禍y定里增加試樣檢測溶液總L-（+）-谷氨酸的吸光值測定；在結(jié)果計(jì)算和公式由來的推導(dǎo)里增加試樣總L-（+）-谷氨酸的計(jì)算公式及公式由來的推導(dǎo)。

（2）針對問題2：補(bǔ)充心肌黃酶檢測溶液和谷氨酸脫氫酶溶液對應(yīng)酶活力單位的標(biāo)識。

（3）針對問題3：將計(jì)算公式中的“Wm/100”更正為“Wm”。將計(jì)算公式下方的符號說明“Wg是指試樣干基L-（+）-谷氨酸含量”更正為的“W1是指試樣游離L-（+）-谷氨酸含量”。

（4）針對不足1：將“繪制吸光值隨時(shí)間變化的曲線，將曲線反向延長與縱坐標(biāo)交匯，推算反應(yīng)開始時(shí)吸光值（參見附錄B）”修改為“以吸光值穩(wěn)定值做為反應(yīng)終點(diǎn)檢測結(jié)果”，并相應(yīng)地將附錄B刪去。

（5）針對不足2：將L-（+）-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.02 mg/mL）更改為L-（+）-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（0.006 g/L、0.010 g/L、0.020 g/L、0.040 g/L、0.060 g/L），對L-（+）-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行吸光值測定，建立L-（+）-谷氨酸溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線和數(shù)學(xué)方程，代替L-（+）-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液單點(diǎn)校正。

（6）針對不足3：光吸收酶標(biāo)儀與分光光度計(jì)測定反應(yīng)產(chǎn)物吸光值的原理相似，理論上采用分光光度計(jì)的測定均可用光吸收酶標(biāo)儀代替，且光吸收酶標(biāo)儀具有分光光度計(jì)難以比擬的優(yōu)勢：光吸收酶標(biāo)儀為儀器自動檢測，能對反應(yīng)過程進(jìn)行在線實(shí)時(shí)監(jiān)控，可生成吸光值隨反應(yīng)時(shí)間變化的動力學(xué)曲線，使檢測過程一目了然并能自動識別反應(yīng)終點(diǎn)；光吸收酶標(biāo)儀最常用的反應(yīng)載體為96孔板，也就是一批次能檢測多達(dá)96個樣品，具有高通量快速并大量節(jié)省試劑成本的特點(diǎn)。因此提出在標(biāo)準(zhǔn)中新增一種測定L-（+）-谷氨酸的檢測方法——光吸收酶標(biāo)儀法。將標(biāo)準(zhǔn)的原檢測方法（分光光度計(jì)法）分類為第一法，將新增方法分類為第二法。第二法繼續(xù)沿用第一法的適用范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語定義、原理、抽樣、試樣制備及檢測步驟的樣品前處理章節(jié)內(nèi)容，在參照第一法的基礎(chǔ)上，對試劑、設(shè)備、檢測步驟的吸光值測定、結(jié)果計(jì)算與表達(dá)及公式由來的推導(dǎo)進(jìn)行修改和補(bǔ)充。

4 結(jié)語

本文通過對肉和肉制品中L-（+）-谷氨酸測定的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.124-2003和國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 4134：1999進(jìn)行對比分析，認(rèn)為ISO 4134：1999存在明顯的技術(shù)爭議，進(jìn)而對ISO 4134：1999進(jìn)行了深入分析，并針對ISO 4134：1999存在問題與不足提出了一些具體的修訂建議。這些修訂建議還有待于進(jìn)行深入的試驗(yàn)論證，以為ISO 4134：1999的修訂提供更為可靠的數(shù)據(jù)支撐。

由于理解角度和能力的限制，上述的分析及修訂建議難免偏頗，誠請專家、學(xué)者們批準(zhǔn)指正。

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Analysis and Revision Suggestions on ISO 4134：1999

MIAO Suna，DAI Xu，XU Weijia
（Centre Testing International（Shenzhen）Ltd.，Shenzhen，Guangdong，518101）

This paper gives a comparative analysis on the national and international standards of meat and meat products determination of L-glutamic acid content，and points out that the international standard ISO 4134：1999 has obvious technical disputes，then makes a in-depth analysis on the existing problems and shortcomings of ISO 4134：1999，and puts forward some concrete revision suggestions，in order to arouse attention and extensive discussion for the current standard，to promote its revision and improve its applicability.

ISO：1999；L-（+）-Glutamic Acid；Determination；Revision；Suggestions

TS207

E-mail：miaosuna@cti-cert.com

2016-06-17