FCGR3A基因多態(tài)性對西妥昔單抗介導抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用殺傷A549細胞的影響

李瑾昱，朱艷云，張國慶，孫勝杰，焦順昌

中國人民解放軍總醫(yī)院腫瘤內一科，北京 100853

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FCGR3A基因多態(tài)性對西妥昔單抗介導抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用殺傷A549細胞的影響

李瑾昱，朱艷云，張國慶，孫勝杰，焦順昌

中國人民解放軍總醫(yī)院腫瘤內一科，北京 100853

摘要：目的探討FCGR3A基因多態(tài)性對西妥昔單抗介導抗體依賴的細胞介導的細胞毒(ADCC)作用殺傷A549細胞的影響。方法選取肺腺癌A549細胞作為靶細胞，NKTm細胞為效應細胞。基因測序法檢測NKTm細胞FCGR3A基因多態(tài)性，CCK- 8法檢測西妥昔單抗介導NKTm細胞的ADCC活性。結果NKTm細胞FCGR3A具有基因多態(tài)性，分別為V/V、V/F及F/F表型。西妥昔單抗介導3種表型的NKTm細胞的ADCC活性差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.0015)，其中FCGR3A- 158V/V表型的NKTm細胞的ADCC活性比V/F及F/F表型強(P<0.01)，而V/F與F/F表型的NKTm細胞ADCC活性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論西妥昔單抗介導的NKTm細胞ADCC活性與FCGR3A基因多態(tài)性有關。

關鍵詞：西妥昔單抗；A549細胞；FCGR3A；抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用

ActaAcadMedSin，2015,37(6)：645-649

西妥昔單抗是一種人源化IgG1抗體類藥物，通過與腫瘤細胞膜上的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)結合，阻斷自身配體介導的EGFR信號傳導通路活化，達到抑制腫瘤的作用。作為單克隆抗體類藥物，西妥昔單抗的Fc段可被免疫細胞表面Fcγ受體(Fc gamma receptor，F(xiàn)CGR)分子識別，因此，西妥昔單抗一端結合腫瘤細胞，另一端可通過Fc段與免疫細胞的FCGR結合，介導免疫細胞發(fā)揮抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)，釋放細胞毒性因子殺傷腫瘤細胞[1]。ADCC作用被證實是單克隆抗體類藥物治療腫瘤的重要機制之一[2]。而免疫細胞表面Fcγ受體的基因多態(tài)性影響其與靶點的結合能力[3]從而影響ADCC作用。有研究認為，F(xiàn)CGR3A基因多態(tài)性與西妥昔單抗介導的ADCC作用及臨床療效相關[4- 6]。但上述報道是對結腸癌的研究，而在非小細胞肺癌方面是否FCGR3A基因多態(tài)性對西妥昔單抗介導的ADCC作用有影響相關報道較少，且目前在非小細胞肺癌的治療中，西妥昔單抗缺乏有效的療效預測指標，是否FCGR3A能夠作為非小細胞肺癌患者應用西妥昔單抗?jié)撛诘念A測指標，需要臨床前研究。因此，本研究以在臨床上用于過繼性細胞免疫治療的NKTm細胞作為效應細胞[7]，探討在對非小細胞肺癌的體外實驗中，F(xiàn)CGR3A基因多態(tài)性是否能夠影響西妥昔單抗介導的ADCC作用。

材料和方法

材料人肺腺癌A549細胞為我室常規(guī)凍存；NKTm細胞由本院腫瘤中心實驗室林星石教授培養(yǎng)并提供。RPMI- 1640培養(yǎng)液(GIBCO公司，美國)；胎牛血清(GIBCO公司，美國)；PBS溶液(GIBCO公司，美國)；西妥昔單抗(默克公司，德國)；胰蛋白酶EDTA液(AMRESCO公司，美國)；Blood & Cell Culture DNA Mini Kit(QIAGEN公司，德國)；細胞計數(shù)試劑盒- 8(Dojindo laboratories公司，日本)。HERA Cell 240二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國)；Multiskan MK3酶標儀(Thermo公司，美國)；HERA Safe KS- 12生物安全柜(Thermo公司，美國)；SORVALL LEGEND MACH 1.6R離心機(Thermo公司，美國)；Olympus BX41 正置顯微鏡(Olympus公司，日本)；Olympus CKX41倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)；Veriti 96well梯度PCR儀(Applied Biosystems公司，美國)；流式細胞儀(BECKMAN公司，美國)。

靶細胞的制備將A549細胞置于無菌細胞培養(yǎng)瓶中，RPMI- 1640培養(yǎng)液常規(guī)傳代培養(yǎng)(含100 U/ml青霉素，100 U/ml鏈霉素，10%胎牛血清)，培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱。待傳代24 h后應用胰蛋白酶-EDTA消化液消化細胞后離心洗滌，用RPMI- 1640培養(yǎng)液重懸A549細胞后待用。

NKTm細胞FCGR3A基因多態(tài)性的檢測Blood & Cell Culture DNA Mini Kit試劑盒提取NKTm細胞DNA，設計引物上游：5’CTCAGGATCTGGGTGGT 3’；下游：5’TGTGATTAGCGTAAGGAAA 3’進行PCR反應。PCR產物送北京三博遠志技術有限公司進行電泳、純化及測序。測序圖應用Applied Biosystems公司SeqScanner軟件進行分析，以Genebank提供的FCGR3A標準序列為基準，應用NCBI網(wǎng)站Blast程序進行序列比對。

西妥昔單抗介導NKTm細胞ADCC活性的檢測取對數(shù)生長期的A549細胞，接種于96孔板(5×103個/孔)。37 ℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱孵育12 h；待A549細胞附壁后加入西妥昔單抗。待藥物作用18 h后在聯(lián)合組及NKTm作用組加入NKTm細胞(效靶比為25∶1)。而抗-CD16組則加入經抗-CD16抗體(0.01 mg/ml)封閉30 min后的NKTm細胞。待再培養(yǎng)4 h后所有實驗孔加入CCK- 8試劑10 μl。2 h后將培養(yǎng)板置于酶標儀上，測定波長450 nm。記錄各孔的光密度(optical density,OD)，以未處理組作為對照組，3個復孔，每組重復3次。

NKTm細胞FCGR3A基因表型對ADCC作用的影響將對數(shù)生長期的A549細胞，按5×103個/孔接種于96孔板，37 ℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱孵育12 h后加入西妥昔單抗，繼續(xù)培養(yǎng)18 h。之后將效應細胞按FCGR3A- 158基因表型不同分為V/V組、V/F組、F/F組，分別加入相應的實驗組中(效靶比為25∶1)。培養(yǎng)4 h后所有實驗孔加入CCK- 8試劑10 μl。2 h后將培養(yǎng)板置于酶標儀上，測定波長450 nm。記錄各孔的OD值，以未處理組作為對照組，3個復孔，每組重復3次。

各組抑制率計算公式(1)西妥昔單抗組=1-(西妥昔單抗組OD值/靶細胞對照組OD值) ×100%。(2)NKTm細胞組=[靶細胞對照組OD值-(NKTm細胞組OD值-NKTm細胞對照組OD值)]/靶細胞對照組OD值×100%。(3)聯(lián)合作用組=[靶細胞對照組OD值-(聯(lián)合作用組OD值-NKTm細胞對照組OD值)]/靶細胞對照組OD值×100%。

統(tǒng)計學處理應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用秩和檢驗分析方法檢驗組間差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

西妥昔單抗介導NKTm細胞ADCC作用與NKTm細胞單獨作用組(B組)比較，聯(lián)合西妥昔單抗顯著增強NKTm細胞對A549細胞的殺傷作用(C組)，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。西妥昔單抗不能增強抗-CD16抗體封閉后的NKTm細胞的殺傷力(D組)，與單獨NKTm細胞(B組)比較，差異無統(tǒng)計學意義(圖1)。

NKTm細胞FCGR3A基因表型對ADCC作用的影響對NKTm細胞進行FCGR3A-V158F基因多態(tài)性的檢測，基因測序圖見圖2。以FCGR3A表型不同的NKTm細胞作為效應細胞，檢測西妥昔單抗介導的ADCC作用對A549細胞的殺傷，結果顯示西妥昔單抗介導3種表型NKTm細胞的ADCC活性差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.0015)，西妥昔單抗介導FCGR3A-V/V表型的NKTm細胞ADCC作用最強，與V/F和F/F表型差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而V/F與F/F表型NKTm細胞ADCC作用對靶細胞的抑制率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。西妥昔單抗或NKTm細胞單獨作用對A549細胞的各組抑制率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖3)。

ADCC：抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用;A組：西妥昔單抗組；B組：NKTm細胞組；C組：NKTm細胞+西妥昔單抗組(聯(lián)合應用組)；D組：NKTm細胞(抗-CD16)+西妥昔單抗組；與A、B、D組比較，aP<0.01

ADCC：antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity;Group A：cet- uximab group；Group B：NKTm cells group；Group C：NKTm cells+ cetuxiamb group (the combined application group)；Group D：NKTm cells(anti-CD16)+cetuximab group；aP<0.01 compared with group A，B，and D

圖 1ADCC作用對A549細胞的體外殺傷作用

Fig 1ADCC effect against A549 cellsinvitro

箭頭：突變位點

arrow：mutation site

A：FCGR3A- 158V/V；B：FCGR3A- 158V/F；C：FCGR3A- 158F/F

圖 2FCGR3A基因多態(tài)性測序圖

Fig 2Single nucleotide polymorphism sequencing diagrams of FCGR3A

與V/F、F/F表型比較，aP<0.01

aP<0.01 compared with genotypes V/F and F/F

圖 3FCGR3A基因多態(tài)性對西妥昔單抗介導NKTm細胞ADCC活性的影響

Fig 3Effect of polymorphic FCGR3A on cetuximab mediated ADCC

討論

FLEX Ⅲ期臨床研究結果表明，西妥昔單抗聯(lián)合化療一線治療晚期非小細胞肺癌可以提高患者的中位生存期(11.3個月比10.1個月)與1年生存率(47%比42%)[8]。然而，與結直腸癌治療中的研究結果不同的是，西妥昔單抗在非小細胞肺癌的治療中缺乏有效的療效預測指標。研究表明K-ras基因突變、EGFR基因突變、EGFR基因擴增、PTEN表達情況均與西妥昔單抗治療非小細胞肺癌的療效無關[9- 10]。對FLEX研究的后期數(shù)據(jù)分析結果顯示，EGFR表達水平可能預測西妥昔單抗療效[11]。而介導免疫反應是單抗類藥物重要的抗腫瘤作用機制之一，因此，某些影響免疫的因素有可能成為西妥昔單抗療效預測指標。

作為人源化IgG1單克隆抗體，西妥昔單抗的ab段與腫瘤細胞表面EGFR結合，其Fc段則可以與淋巴細胞表面Fc受體結合，從而激活淋巴細胞的細胞毒作用，殺傷腫瘤細胞。與西妥昔單抗介導ADCC作用最密切相關的淋巴細胞表面Fc受體為FCGR3A即CD16分子。有文獻報道，西妥昔單抗對頭頸部鱗狀細胞癌的體外殺傷實驗中，F(xiàn)CGR3A的基因多態(tài)性與西妥昔單抗介導的ADCC活性相關[12]。在結直腸癌的臨床試驗中同樣提示FCGR3A的基因多態(tài)性與西妥昔單抗治療后患者的無進展生存時間相關[4]。然而，在非小細胞肺癌的治療中，F(xiàn)CGR3A基因多態(tài)性與西妥昔單抗介導的ADCC作用是否相關報道較少。

NKTm細胞是將人外周血淋巴細胞進行體外擴增培養(yǎng)、誘導分化而獲得的具有高效抗腫瘤活性的混合免疫細胞，以CD3+、CD8+、CD56+和CD16+細胞為主，已作為效應細胞廣泛應用于臨床過繼性細胞免疫治療[7]。本研究以A549細胞作為靶細胞，NKTm細胞為效應細胞，進行西妥昔單抗介導ADCC作用對非小細胞肺癌細胞的體外殺傷實驗，結果表明西妥昔單抗能夠特異性地介導NKTm 細胞發(fā)揮ADCC作用殺傷A549細胞，聯(lián)合作用的抑制率顯著高于兩者單獨應用。而NKTm細胞的FCGR(CD16)分子被封閉后西妥昔單抗則不能介導其發(fā)揮ADCC作用，表明NKTm細胞主要依靠CD16分子與西妥昔單抗結合從而發(fā)揮ADCC作用。本研究分別以FCGR3A基因表型不同的NKTm細胞作為效應細胞，檢測西妥昔單抗介導的ADCC活性，結果顯示V/V表型的NKTm細胞ADCC活性顯著高于V/F型與F/F型(P<0.01)，而V/F型與F/F型NKTm細胞的ADCC活性差異無統(tǒng)計學意義。這與西妥昔單抗在結直腸癌的臨床研究結果[4]基本一致。而不同表型的NKTm細胞單獨作用對靶細胞的抑制率差異無統(tǒng)計學意義，可見FCGR3A基因表型不同影響的是ADCC作用而非NKTm細胞本身的殺傷作用。有文獻報道，F(xiàn)CGR3A-V/V型受體具有與IgG1抗體更強的結合能力[13- 14]；FCGR3A-V/V型的NK細胞CD69和CD107a的表達更高且能夠分泌更多的γ-干擾素、白介素- 8、巨噬細胞炎性蛋白- 1α、巨噬細胞炎性蛋白- 1β、趨化因子和腫瘤壞死因子α[12]。這些可能是具有FCGR3A-V/V基因型的淋巴細胞ADCC活性強的原因。

綜上，本研究提示免疫細胞表面FCGR3A的基因多態(tài)性影響西妥昔單抗介導ADCC作用殺傷非小細胞肺癌，可能西妥昔單抗?jié)撛诘寞熜ьA測指標為臨床應用及研究提供了基礎實驗支持。但體內外作用機制存在差異，因此仍需進一步的基礎及臨床研究加以證實。

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·論著·

Effects of Rapamycin and Rapamycin-loaded Poly(lactic-co-glycolic)Acid Nanoparticles on Apoptosis and Expression of bcl- 2 and p27kip1Proteins of Human Umbilical Arterial Vascular Smooth Muscle Cell

Effect of FCGR3A Polymorphisms on Antibody-dependent Cetuximab-mediated Cytotoxicity in A549 Cells LI Jin-yu，ZHU Yan-yun，ZHANG Guo-qing，SUN Sheng-jie，JIAO Shun-chang

Department of Medical Oncology，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China

Corresponding author：JIAO Shun-changTel：010- 66937875，E-mail：jiaosc@vip.sina.com

ABSTRACT：ObjectiveTo investigate the effect of FCGR3A polymorphisms on the antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) activity induced by cetuximab against A549 cells. MethodsA549 cell line was used as target cells and NKTm cells as effector cells. FCGR3A polymorphisms were detected by direct sequencing. The ADCC activity mediated by cetuximab was assessed by CCK- 8 assay. ResultsThree genotypes of FCGR3A were detected：V/V，V/F，and F/F. The ADCC activity of NKTm cells with these three different genotypes mediated by cetuximab were significantly different (P=0.0015). NKTm cells with FCGR3A- 158V/V genotypes had significantly higher ADCC activity than FCGR3A-V/F or F/F genotypes (P<0.01)，whereas the ADCC activity between V/F and F/F genotype showed no statistical significance(P>0.05). ConclusionFCGR3A polymorphisms have an impact on ADCC activity mediated by cetuximab in NKTm cells.

Key words：cetuximab；A549 cells；FCGR3A；antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity

收稿日期：(2015- 01- 22)

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2015.06.003

中圖分類號:R735.5

文獻標志碼:A

文章編號：1000- 503X(2015)06- 0645- 05

通信作者：焦順昌電話：010- 66937875，電子郵件：jiaosc@vip.sina.com

基金項目：軍隊十一五重點課題(06G106)Supported by the Key Project of the “Eleventh Five-year Plan” for Medical Science Development of PLA of China(06G106)