屎腸球菌冷凍干燥保護(hù)劑篩選及穩(wěn)定性比較研究

彭虹旎，梁 莉，陳西廣

(1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003；2.青島康地恩生物科技有限公司技術(shù)中心，山東 青島 266101)

屎腸球菌屬腸球菌屬，是乳酸菌類益生菌的一種，能調(diào)整單胃動物腸道菌群，抑制腸道內(nèi)致病菌的過度繁殖。屎腸球菌在動物微生態(tài)制劑及食品添加劑方面有廣泛的應(yīng)用，作為動物微生態(tài)的常用益生菌株，可單獨(dú)使用或與其他益生菌復(fù)配，用于調(diào)節(jié)動物腸道菌群，提高免疫力及改善生長性能[1-2]。

乳酸菌作為發(fā)酵劑或微生態(tài)制劑進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化開發(fā)時，需采用有利于菌體活性和貯存穩(wěn)定性的生產(chǎn)與保存工藝，使活菌量在干燥和后續(xù)保存中都盡可能維持高水平，冷凍干燥法在菌體長期保存方面具有明顯優(yōu)勢，且固體產(chǎn)品更易儲運(yùn)和銷售應(yīng)用。同時，產(chǎn)業(yè)化的工藝開發(fā)必須兼顧技術(shù)性和經(jīng)濟(jì)性[3]。已往國內(nèi)外對乳酸菌凍干工藝及存活率的研究中，對不同種類乳酸菌的凍干保護(hù)劑組成、凍干速率、預(yù)凍條件等內(nèi)容都有涉及，其中保護(hù)劑包括蛋白質(zhì)類、多糖類、小分子糖類、醇類和維生素類，其中被廣泛認(rèn)可的保護(hù)劑常用主要成分包括脫脂乳、蔗糖、海藻糖等[4-6]，每種物質(zhì)使用量10g/L至150g/L不等，在單一保護(hù)劑中甚至可達(dá)到250g/L[7]；其次使用較多的成分如谷氨酸鈉、甘油、VC等[8-10]，每種物質(zhì)使用量5g/L至50g/L不等。在不同的實(shí)驗(yàn)中，不同的乳酸菌凍干存活率介于6%[13]至93.05%[10]之間。如Volkert等[11]比較氣冷式冷凍法(air freezing)、噴淋凍結(jié)法(spray freezing)法等方法對鼠李糖乳桿菌活性和細(xì)胞膜完整性的影響，發(fā)現(xiàn)用20g/100mL脫脂乳作為保護(hù)劑時每種方法的凍干存活率都較高。另外，Schwab等[12]通過測定膜流動性和膜側(cè)壓，發(fā)現(xiàn)蔗糖、果寡糖和脫脂乳都可以明顯提高生長對數(shù)期羅伊氏乳桿菌的凍干存活率。Schoug等[13]通過響應(yīng)面法評價不同的蔗糖濃度、細(xì)胞密度和冷凍速率對一株棒狀乳桿菌凍干存活率的影響，結(jié)果不同條件下這株棒狀乳桿菌的凍干存活率從低于6%到高于70%不等，他認(rèn)為各種因素對該菌的存活率都有影響，但最重要的影響因素是冷凍速率，最佳速率應(yīng)是2.8℃/min。在乳酸菌的保存研究方面，Miyamoto-Shinohara等[14]通過對凍干并真空保存于安瓶的不同種類革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌存放20a后活性的比較，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在凍干后的存活率與安瓶密封時的真空度有關(guān)，每種細(xì)菌凍干后的良好保存都有賴于高度的干燥和在高真空度下密封。其中嗜酸乳桿菌和屎腸球菌在凍干后存活率分別為62.5%和85.2%，它們的年存活率近96%。

屎腸球菌作為乳酸菌類益生菌中的一種，在微生態(tài)產(chǎn)品中的應(yīng)用效果同樣受活菌量、貯存穩(wěn)定性的影響。本實(shí)驗(yàn)擬對屎腸球菌采用冷凍干燥及加速保存實(shí)驗(yàn)[15]，尋找適合屎腸球菌規(guī)模生產(chǎn)的冷凍干燥保護(hù)劑和產(chǎn)品保存條件。

1 材料與方法

1.1 菌種、試劑與培養(yǎng)基

屎腸球菌由青島康地恩生物研發(fā)中心保存。

保護(hù)劑種類：脫脂奶粉、海藻糖、麥芽糊精、蔗糖。以玉米淀粉為保護(hù)劑對照。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10g、牛肉膏 10g、酵母膏5g、K2HPO42g、檸檬酸銨2g、乙酸鈉 5g、葡萄糖20g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳 0.25g、吐溫-80 1mL，蒸餾水1L，溶解各組分，pH值調(diào)節(jié)至6.2～6.4，115℃滅菌30min。

1.2 儀器與設(shè)備

DH4000A培養(yǎng)箱 天津泰斯特儀器有限公司；PHS-3D pH計(jì) 上海精科儀器有限公司；SW-CJ-3D超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；H-1650離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及擴(kuò)培

?。?0℃保存的屎腸球菌凍存管1支，在MRS平板上劃線，37℃培養(yǎng)36～48h，挑取單菌落接種于100mL液體MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24h后，以5%的接種量轉(zhuǎn)接至1L液體MRS培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)20h，進(jìn)入穩(wěn)定期，停止培養(yǎng)，測定活菌數(shù)，備用。

1.3.2 菌泥與菌懸液制備

將擴(kuò)大培養(yǎng)好的發(fā)酵液置于離心機(jī)中，以轉(zhuǎn)速條件為5000r/min離心10min，棄掉上清液，用無菌水重懸，洗滌，按同樣轉(zhuǎn)速條件再次離心，即獲得冷凍干燥實(shí)驗(yàn)所需的菌泥，并測定活菌數(shù)。

采用無菌水溶解凍干保護(hù)劑，加入菌泥，活菌數(shù)調(diào)節(jié)至1×1010CFU/mL，在磁力攪拌器上充分混勻菌懸液。

1.3.3 冷凍干燥

將添加保護(hù)劑的菌懸液倒入平板中，鋪成薄層，置于－40℃預(yù)凍，使得菌懸液中的水分充分凍結(jié)，然后在－80℃、真空度為3.5Pa條件下真空冷凍干燥24h，獲得凍干樣品。

1.3.4 收集存放條件及樣品貯存穩(wěn)定性評價

冷凍干燥過程結(jié)束后，立即取出樣品，放置于鋁箔袋中，封口，分別放置于4℃和37℃條件下，每周取樣測定樣品活菌數(shù)，并計(jì)算樣品中剩余活菌存活率，以比較不同溫度條件下的貯存穩(wěn)定性。

1.3.5 活菌數(shù)測定

樣品溶解于生理鹽水中混勻，以10倍梯度進(jìn)行稀釋，取適合的稀釋度(最終菌落數(shù)約30～300CFU之間適宜)的試管中液體1mL置于平板中，與MRS培養(yǎng)基混勻，37℃培養(yǎng)48h后，計(jì)數(shù)菌落數(shù)，以菌落平均數(shù)計(jì)為該樣品的單位活菌數(shù)。

1.3.6 凍干樣品存活率計(jì)算

設(shè)冷凍干燥前菌泥活菌數(shù)為N1/(CFU/mL)；冷凍干燥后菌粉活菌數(shù)為N2/(CFU/mL)。

1.3.7 保護(hù)劑篩選

首先使用脫脂乳、蔗糖、麥芽糊精、海藻糖進(jìn)行單因素試驗(yàn)，同時選擇玉米淀粉為保護(hù)劑對照，無任何保護(hù)劑添加組作為空白對照；添加保護(hù)劑的處理組，保護(hù)劑質(zhì)量濃度均為10g/100mL。觀察單一保護(hù)劑條件下的凍干存活率，及37℃(RH 75%)條件下貯存穩(wěn)定性。

然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及參考文獻(xiàn)[4,9-10,13]，將脫脂乳、蔗糖、麥芽糊精組合，進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)，優(yōu)化保護(hù)劑配方，實(shí)驗(yàn)采用L9(33)正交表。比較各種保護(hù)劑組合的凍干存活率，選擇存活率最高的兩組，進(jìn)行4℃和37℃條件下的貯存穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，篩選出最優(yōu)的保護(hù)劑配方。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一保護(hù)劑對屎腸球菌凍干存活率的影響

圖1 單一保護(hù)劑對屎腸球菌凍干存活率的影響Fig.1 Effect of cryoprotectant type on survival rate of lyophilized E.faecium

冷凍干燥過程中會產(chǎn)生低溫、凍結(jié)及脫水等多種效應(yīng)，因此，為了防止微生物在凍干過程中變性，選擇有效的保護(hù)劑至關(guān)重要。由圖1可知，所選的4種保護(hù)劑在相同的質(zhì)量濃度下分別進(jìn)行凍干實(shí)驗(yàn)，屎腸球菌存活率在70%～80%之間，但玉米淀粉組和無保護(hù)劑的空白對照組存活率也分別達(dá)到了57%和76%，說明這株屎腸球菌本身有較好的凍干耐受性，而且凍干過程中，單一保護(hù)劑對這株屎腸球菌的存活率影響不大。

2.2 單一保護(hù)劑對屎腸球菌貯存穩(wěn)定性的影響

圖2 添加單一保護(hù)劑后凍干樣品穩(wěn)定性分析Fig.2 Effect of cryoprotectant type on storage stability of E.faecium at 37 ℃ (75% RH)

由圖2可知，在為期4周的貯存穩(wěn)定性加速實(shí)驗(yàn)中，各保護(hù)劑在貯存過程中對菌體都有一定的保護(hù)作用。海藻糖保護(hù)效果與其他3種保護(hù)劑相當(dāng)，價格卻遠(yuǎn)高于這些保護(hù)劑，不適于實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。而淀粉組和空白對照組菌量下降迅速，說明在沒有適當(dāng)保護(hù)劑的情況下，即使微生物本身凍干耐受性較好，也無法較長期穩(wěn)定保存。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合凍干保護(hù)劑

不同的保護(hù)劑在凍干過程中發(fā)揮著不同的作用，一般認(rèn)為，低分子化合物(如低聚糖、氨基酸等)在凍干過程中直接發(fā)揮作用，而高分子化合物(如蛋白質(zhì)、多糖等)則是促進(jìn)低分子化合物的保護(hù)作用，本課題預(yù)實(shí)驗(yàn)中選擇脫脂乳、蔗糖、麥芽糊精做單因素保護(hù)劑凍干實(shí)驗(yàn)，選擇質(zhì)量濃度為10g/100mL，凍干后屎腸球菌存活率在70%～80%之間；而在一般應(yīng)用中，實(shí)驗(yàn)室保存菌種有的單獨(dú)使用脫脂乳作為凍干保護(hù)劑，用量可達(dá)20g/100mL，有時則會搭配蔗糖，其用量達(dá)7g/100mL；但更多研究中，會配合使用脫脂乳、蔗糖甚至麥芽糊精等成分，各成分的用量在1～10g/100mL居多。如杜磊等[16]在乳酸菌冷凍保護(hù)劑的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混菌保護(hù)劑最佳配方為10g/100mL蔗糖、10g/100mL脫脂乳及5g/100mL谷氨酸鈉，菌體經(jīng)冷凍處理后存活率可達(dá)到95%；而郭云等[17]在研究中發(fā)現(xiàn)，以10g/100mL脫脂乳加5g/100mL海藻糖和5g/100mL蔗糖為基質(zhì)進(jìn)行噴霧干燥，菌體存活率最高達(dá)73.9%；麥芽糊精具有優(yōu)良的乳化性能，有調(diào)整產(chǎn)品組織結(jié)構(gòu)的作用，在食品及保健品中常作為壁材組分之一應(yīng)用于噴霧干燥等后處理工藝[18-19]。因此，本實(shí)驗(yàn)將脫脂乳、蔗糖、麥芽糊精組合，進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)，優(yōu)化保護(hù)劑配方，采用L9(34)正交表，結(jié)果如表1所示。

表1 復(fù)合保護(hù)劑對菌體凍干存活率的影響Table 1 Effect of complex cryoprotectant on survival rate of lyophilized E.faecium

由表1可知，影響屎腸球菌凍干后存活率的因素主次順序?yàn)锽＞C＞A，即蔗糖的效果最明顯，麥芽糊精次之。

經(jīng)正交試驗(yàn)得到的最佳組合為1號試驗(yàn)組：A1B1C1，即脫脂乳1g/100mL、蔗糖1g/100mL、麥芽糊精10g/100mL，凍干后菌體存活率達(dá)到84.4%。其次是4號試驗(yàn)組：A2B1C2(脫脂乳5g/100mL、蔗糖1g/100mL、麥芽糊精5g/100mL)，凍干后菌體存活率達(dá)到83.1%。

蔗糖和麥芽糊精都屬糖類保護(hù)劑，糖類保護(hù)劑的保護(hù)作用在于抑制質(zhì)膜的相變。即在微生物細(xì)胞脫水時進(jìn)行“水置換”作用。凍干過程中，細(xì)胞膜質(zhì)經(jīng)歷了從液晶態(tài)到凝膠態(tài)的相的變化，而在室溫下復(fù)水時處于凝膠態(tài)的干燥質(zhì)膜又經(jīng)歷了從凝膠態(tài)到液晶態(tài)的轉(zhuǎn)變，由于膜經(jīng)歷了狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，某些區(qū)域產(chǎn)生缺陷，使細(xì)胞膜發(fā)生滲漏。若在干燥前加入二糖，如海藻糖或蔗糖，可降低干燥膜的膜相轉(zhuǎn)變溫度，當(dāng)磷脂干燥脫水時，蔗糖在失水部位以氫鍵和磷脂的極性端相連，防止?fàn)顟B(tài)的轉(zhuǎn)變和復(fù)水時的滲漏，從而提高細(xì)胞的存活率。

2.4 凍干樣品的穩(wěn)定性分析

生物制品經(jīng)冷凍干燥后制成凍干樣品，還需經(jīng)歷長期儲存過程。通常，由冷凍干燥得到的樣品在長期的儲存過程活性組分會不斷變化，因此，以較好的保護(hù)劑組合制成的凍干樣品通過貯存穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)分析，更有助于凍干樣品效果的評價。本實(shí)驗(yàn)選擇正交試驗(yàn)中屎腸球菌凍干存活率較高的1號和4號組合進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，分別將凍干樣品置于4℃及37℃(RH 75%)條件下，定期測定樣品中的活菌數(shù)，結(jié)果如圖3、4所示。

由圖3可知，屎腸球菌凍干樣品在4℃條件下存放4周后，兩個不同保護(hù)劑組合的存活率均高于90%(將實(shí)驗(yàn)初始測定時樣品存活率定為100%)，單位活菌量下降小，這說明了4℃的低溫存放效果好。而且，4號組合(脫脂乳5g/100mL、蔗糖1g/100mL、麥芽糊精5g/100mL)樣品存活率高于1號組合(脫脂乳1g/100mL、蔗糖1g/100mL、麥芽糊精10g/100mL)，菌量呈現(xiàn)增長的趨勢，這可能是由于在復(fù)水培養(yǎng)時保護(hù)劑成分有增菌作用所致。

圖3 4℃條件下凍干樣品的穩(wěn)定性分析Fig.3 Stability of lyophilized E.faecium during storage at 4 ℃

圖4 37℃(RH 75%)條件下凍干樣品的穩(wěn)定性分析Fig.4 Stability of lyophilized E.faecium during storage at 37 ℃ (RH 75%)

圖4 是屎腸球菌凍干樣品在37℃(RH 75%)條件下存放4周后的情況，存放前2周時，1號組合(脫脂乳1g/100mL、蔗糖1g/100mL、麥芽糊精10g/100mL)存活率已經(jīng)降低至50%，而4號組合(脫脂乳5g/100mL、蔗糖1g/100mL、麥芽糊精5g/100mL)沒有明顯的存活率下降；4周后，1號組合和4號組合樣品的存活率分別降至38.4%和97.9%(將實(shí)驗(yàn)初始測定時樣品存活率定為100%)。

經(jīng)過4℃和37℃(RH 75%)的貯存穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，可知凍干保護(hù)劑配方，4號組合穩(wěn)定性優(yōu)于1號組合。在貯存過程中，脫脂乳含量較高的組合表現(xiàn)較好，可能是脫脂乳的成分可以更好地直接與細(xì)胞膜表面極性磷脂集團(tuán)相互作用，在菌體外形成蛋白膜，從而降低在貯存過程中細(xì)胞膜的損傷。而麥芽糊精在細(xì)胞脫水時不能充分置換水分子，所以1號組合，細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性不如脫脂乳含量較高的4號組合，在貯存過程中菌量損失相應(yīng)較多。

3 結(jié) 論

屎腸球菌在凍干過程中選擇有效的保護(hù)劑至關(guān)重要，為尋找適于屎腸球菌規(guī)?；a(chǎn)的凍干保護(hù)劑，本實(shí)驗(yàn)將脫脂乳、蔗糖、麥芽糊精組合，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化保護(hù)劑配方，得到的最佳組合為脫脂乳5g/100mL、蔗糖1g/100mL、麥芽糊精5g/100mL，此保護(hù)劑組合對屎腸球菌在冷凍干燥和干燥后貯存過程中均有顯著的保護(hù)作用，如：凍干后菌體存活率達(dá)到83.1%；使用鋁箔袋密封保存，在37℃(RH 75%)條件下存放4周后存活率為97.9%(將實(shí)驗(yàn)初始測定時樣品存活率定為100%)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為屎腸球菌凍干產(chǎn)品制備和在常溫條件下貯運(yùn)提供了直接參考。

另外，本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)使用此保護(hù)劑的屎腸球菌凍干樣品在4℃條件下存放4周后存活率高于100%，除球菌本身抗逆性較強(qiáng)外[3]，其原因和機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。

在乳酸菌的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)過程中，菌株之間的個體差異、干燥方式和相應(yīng)的保護(hù)方法、所生產(chǎn)制劑的貯存穩(wěn)定性、使用效果評價等，都需要不斷的研究完善，以便持續(xù)提高微生態(tài)制劑的產(chǎn)品品質(zhì)，保障消費(fèi)者的健康和利益。

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