乙醇非氧化代謝產(chǎn)物脂肪酸乙酯的研究進(jìn)展

李江濤，張久亮，何 慧*，聶志奎，馬芝麗

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

乙醇非氧化代謝產(chǎn)物脂肪酸乙酯的研究進(jìn)展

李江濤，張久亮，何 慧*，聶志奎，馬芝麗

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

脂肪酸乙酯(fatty acid ethyl esters，F(xiàn)AEEs)是乙醇經(jīng)非氧化代謝途徑的產(chǎn)物，其在誘導(dǎo)器官損害方面發(fā)揮著重要的作用，可作為長(zhǎng)期攝入酒精的標(biāo)記物。本文對(duì)FAEEs在體內(nèi)的毒性、作為酒精攝入標(biāo)記物的證據(jù)、相關(guān)合成酶提取以及FAEEs的檢測(cè)等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為乙醇代謝研究方面提供一定的理論依據(jù)。

脂肪酸乙酯(FAEEs)；乙醇非氧化代謝；乙醇攝入標(biāo)記物；細(xì)胞毒性

2011年以來(lái)，我國(guó)白酒消費(fèi)人群大約有4億，年實(shí)際消費(fèi)量在500萬(wàn)t左右。過(guò)量攝入酒精對(duì)人體消化、神經(jīng)、骨骼、造血等多種系統(tǒng)都有一定毒性。乙醇的代謝途徑主要是氧化代謝，即在乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)、微粒體乙醇氧化系統(tǒng)和過(guò)氧化氫酶的作用下氧化為乙醛，乙醛進(jìn)一步在乙醛脫氫酶的作用下氧化為乙酸。同時(shí)，乙醇還可通過(guò)非氧化方式與脂肪酸發(fā)生酯化反應(yīng)，生成脂肪酸乙酯(fatty acid ethyl esters，F(xiàn)AEEs)，這個(gè)代謝過(guò)程是通過(guò)脂肪酸乙酯合成酶催化完成的[1]，當(dāng)乙醇有氧代謝被抑制時(shí)，將會(huì)增加FAEEs的生成量，F(xiàn)AEEs的存在很可能導(dǎo)致胰腺炎、肝炎、心肌消融等疾病危害。

長(zhǎng)期嗜酒對(duì)人體的傷害是很嚴(yán)重的，雖有研究[2]表明，酒精攝入量與肝損害的嚴(yán)重程度并不呈顯著相關(guān)，但據(jù)有關(guān)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，嗜酒人群中約有20%～30%會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的肝損害[3]。另有相關(guān)器官驗(yàn)尸結(jié)果證明，人體器官的損傷很多時(shí)候是因?yàn)榫凭珵E用造成的[4]。在急性酒精中毒的案例中，F(xiàn)AEEs在人體胰腺中含量最高，此外，肝臟、心臟和大腦等器官中也有較低濃度的FAEEs存在；并且在胰腺中并未發(fā)現(xiàn)乙醇有氧代謝的產(chǎn)物——乙醛[5]。這表明，在酒精中毒案例中，人體內(nèi)的FAEEs含量可作為一個(gè)關(guān)鍵的衡量指標(biāo)。通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在胰腺和肝臟中，通過(guò)抑制可在有氧條件下催化乙醇氧化為乙醛的酶(ADH、細(xì)胞色素P450和過(guò)氧化氫酶等)的活性即可抑制酒精的氧化代謝，從而使乙醇按生成FAEEs的非氧化代謝途徑進(jìn)行反應(yīng)[6]。

1 脂肪酸乙酯的毒性

早在1963年，Goodman和Deykin就對(duì)脂肪酸乙酯進(jìn)行了相關(guān)描述，認(rèn)為它是乙醇的代謝產(chǎn)物，Goodman在1980年進(jìn)一步提出它可能是過(guò)量飲用酒精導(dǎo)致器官損傷的媒介物；特別在乙醇氧化功能缺陷或者較弱的組織中，可以導(dǎo)致組織細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的異常、細(xì)胞膜氧化磷酸化的脫偶聯(lián)及蛋白質(zhì)的合成受抑制等[7]。到1986年，對(duì)急性酒精中毒致死的人進(jìn)行解剖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酒精濫用和FAEEs的產(chǎn)生有重要聯(lián)系。驗(yàn)尸結(jié)果表明，F(xiàn)AEEs的產(chǎn)生和器官損傷有很強(qiáng)的相關(guān)性，可作為酒精攝入的標(biāo)記物[5]。酒精濫用致器官的損害大部分發(fā)生在胰腺、肝臟、心臟和大腦。據(jù)檢測(cè)，這些器官中通常含有很高活性的脂肪酸乙酯合成酶和高濃度的FAEEs。近年來(lái)，有研究[8]表明乙醇攝入后產(chǎn)生FAEEs，然后傳送到心臟，進(jìn)而引起心肌消融。因此，心肌消融的機(jī)制可能涉及到FAEEs的細(xì)胞毒性作用。

目前，眾多的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)FAEEs在體內(nèi)和體外均顯示出毒性作用。Zbigniew等[9]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)FAEEs融合于低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)中，能夠發(fā)揮其完整的細(xì)胞毒性作用。利用600μmol/L的油酸乙酯或800μmol/L的花生四烯酸乙酯培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞，其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率分別達(dá)到31%和37%，LDL與400μmol/L的油酸乙酯培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，會(huì)使其蛋白質(zhì)合成率下降41%。同時(shí)，透射電鏡觀察結(jié)果顯示，細(xì)胞形態(tài)也會(huì)發(fā)生了很大變化，尤其是細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)固縮。該研究還證實(shí)了FAEEs在LDL內(nèi)能夠降低HepG2細(xì)胞的復(fù)制及蛋白酶的合成速率[10]。人們?cè)谂囵B(yǎng)細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AEEs的合成在人肝癌HepG2和E47細(xì)胞(即轉(zhuǎn)染并表達(dá)人CYP2E1的HepG2細(xì)胞)中比在人肺細(xì)胞VA13和VL-17A細(xì)胞(即過(guò)表達(dá)乙醇脫氫酶和CYP2E1的人肝癌HepG2細(xì)胞)中濃度增長(zhǎng)幅度更高[11]。該研究表明，一方面，不管CYP2E1(細(xì)胞色素P4502E1)是否過(guò)表達(dá)，ADH催化乙醇氧化是其主要的機(jī)制；另一方面，不管CYP2E1是否過(guò)表達(dá)，在E47細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)乙醇無(wú)氧代謝產(chǎn)物FAEEs能夠降低ADH的活性。因此，CYP2E1介導(dǎo)的乙醇氧化可能是次要的機(jī)制。Hikmet等[12]研究表明，F(xiàn)AEEs能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且干擾了細(xì)胞的G2/M期，使細(xì)胞的S期下降[13]。

Walter等[14]通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在大鼠內(nèi)，通過(guò)灌胃濃度為11μmol/L的FAEEs為核心的低密度脂蛋白，大鼠全身會(huì)發(fā)生水腫，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，導(dǎo)致胰腺細(xì)胞膜受損，這可能是血清蛋白酶和胰腺酶原被激活的緣故。目前，雖已有不少專家、學(xué)者認(rèn)同F(xiàn)AEEs在乙醇濫用中作為媒介物引起器官的損傷這一觀點(diǎn)，但是其導(dǎo)致細(xì)胞毒性的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。有研究[15]提出這可能是水解的FAEEs抑制了細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄，但尚無(wú)可靠的理論依據(jù)。

2 脂肪酸乙酯代謝相關(guān)酶及其代謝途徑

目前，在體內(nèi)催化FAEEs合成的酶有脂蛋白脂肪酶、羧酸酯酶、羧基酯脂肪酶等，F(xiàn)AEEs的催化合成，可能需要2種酶，即水解酶和酯合酶，并且水解酶是限速酶。細(xì)胞質(zhì)中的酶，例如谷草轉(zhuǎn)氨酶、脂肪酶、淀粉酶會(huì)在肝臟和胰腺受損后出現(xiàn)在血液中，可以假設(shè)FAEEs合成酶既與細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜結(jié)合，同時(shí)也會(huì)在肝臟和胰腺損傷后釋放到血液中[8,16]。

在1984年，從兔心肌介質(zhì)中分離純化出FAEEs酯合酶，在分離純化前，通過(guò)DEAE-纖維層析柱分離得到2種活性峰，純化后兩者的含量在總提取物中的比例超過(guò)了40%，SDS-PAGE分析得到單一的多肽，其分子質(zhì)量為26kD，采用凝膠滲透色譜分析表明，活性酶的分子質(zhì)量為50kD, 這一結(jié)果表明，這種酶是由2個(gè)相同或接近相同的亞基組成的可溶性二聚體酶[17-18]。

1987年，研究發(fā)現(xiàn)人的大腦灰質(zhì)合成酶活性大約是腦白質(zhì)合成酶活性的2倍。通過(guò)離子交換色譜分離得知，這兩種形式的合成酶存在于灰質(zhì)和白質(zhì)組織勻漿后的細(xì)胞質(zhì)或松散結(jié)合的膜組分中[19]。這份報(bào)告同時(shí)表明，血液中乙醇濃度較高，在大腦皮層中FAEEs濃度亦較高，這表明，F(xiàn)AEEs在人類大腦中能致急性中毒。

1991年，有研究者測(cè)定了攝入乙醇的大鼠脂肪組織中的不同時(shí)期的FAEEs的濃度和FAEEs合酶活性，在乙醇灌胃10周后，每克脂肪組織檢測(cè)到300nmol FAEEs，更重要的發(fā)現(xiàn)是，F(xiàn)AEEs從乙醇停用1周后完全消失[19]。在這項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)大部分FAEEs存在于一個(gè)孤立的脂肪組織中，而不是在細(xì)胞質(zhì)中。而且乙醇攝入停止后，酶的活性下降了很多，說(shuō)明FAEEs合成酶的活性受到是否存在乙醇外源性介質(zhì)的影響[19]。

Tony等[20]研究表明，F(xiàn)AEEs合成酶以細(xì)胞質(zhì)和微粒的形式存在，并產(chǎn)生其他的活性。細(xì)胞質(zhì)FAEEs合成酶的活性體現(xiàn)在使用乙醇和游離脂肪酸作為底物，合成FAEEs，被稱為FAEEs合成酶；微粒FAEEs合成酶的活性體現(xiàn)在使用乙醇和脂肪酰基輔酶A為底物，被稱為酰基輔酶A:乙醇?；D(zhuǎn)移酶(AEAT)。

3 脂肪酸乙酯作為乙醇攝入的標(biāo)記物

很早以前，人們就知道血液中乙醇可以作為乙醇攝入的標(biāo)記物，但是血液中乙醇在體內(nèi)會(huì)很快被降解，因此，需要一個(gè)指標(biāo)可以用來(lái)作為乙醇攝入的長(zhǎng)期標(biāo)記物，在玻璃化溫度條件下的乙醇濃度可能作為乙醇攝入的長(zhǎng)期標(biāo)記物，但是這也只是一種假設(shè)[21]。乙醇攝入后血液中的FAEEs濃度保持時(shí)間長(zhǎng)達(dá)24h，F(xiàn)AEEs在血液中消失的衰減曲線與血液中乙醇的衰減曲線相似[22-23]。而FAEEs的消除是個(gè)非常緩慢的二級(jí)反應(yīng)，所以在酒精攝入24h后，F(xiàn)AEEs仍存在于血液中，這些數(shù)據(jù)使人們得出結(jié)論：血液、頭發(fā)中的FAEEs能夠被用作酒精攝入的長(zhǎng)期標(biāo)記物[24]。

FAEEs一般被運(yùn)送到血液中脂蛋白和白蛋白的核心。在脂蛋白核心的FAEEs迅速轉(zhuǎn)變成磷脂雙層[19]；當(dāng)血液中FAEEs濃度較低時(shí)，其主要存在于白蛋白中，白蛋白攜帶FAEEs的能力很強(qiáng)；隨著血液中FAEEs濃度進(jìn)一步增加，脂蛋白攜帶的FAEEs濃度亦會(huì)增大。

人們了解到，白蛋白、極低密度脂蛋白(VLDL)、LDL和高密度脂蛋白(HDL)均可以刺激FAEEs，使之從細(xì)胞中釋放入血液，并且當(dāng)細(xì)胞暴露在乙醇環(huán)境中時(shí)，乙醇可誘導(dǎo)FAEEs的合成。攝入相同量的酒精濃度，在女性體內(nèi)乙醇濃度要低于男性，F(xiàn)AEEs峰濃度顯示，同等體質(zhì)量的男性與女性相比，前者體內(nèi)FAEEs濃度比后者高兩倍多[24]。進(jìn)一步的研究顯示，慢性酒精中毒患者體內(nèi)比急性酒精中毒患者體內(nèi)的油酸乙酯含量高。因此，有研究者[25]嘗試證明是否可以用體內(nèi)油酸乙酯含量的高低來(lái)區(qū)分慢性酒精中毒和急性酒精中毒。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慢性酒精中毒患者和急性酒精中毒患者的體內(nèi)油酸乙酯濃度有顯著差異，前者體內(nèi)的油酸乙酯濃度顯著高于后者；油酸乙酯濃度的峰值出現(xiàn)的時(shí)間與乙醇的濃度峰值出現(xiàn)的時(shí)間相近。

由于乙醇在體內(nèi)代謝快，故在車禍?zhǔn)鹿拾l(fā)生后通過(guò)乙醇濃度來(lái)評(píng)價(jià)是否有酒精攝入并不可靠[26]。所以人們開(kāi)始嘗試檢測(cè)器官組織中FAEEs的濃度，以FAEEs作為酒精攝入的標(biāo)志物。實(shí)驗(yàn)中，給大鼠的腹膜間注射乙醇，然后讓其存活直至死亡，獲取腹膜間脂肪和肝組織，發(fā)現(xiàn)肝臟和脂肪組織中均含有FAEEs[27]。人體心臟肌肉內(nèi)的FAEEs的正常濃度低于0.001μmol/L，但是在尸檢過(guò)程中卻發(fā)現(xiàn)，不管是慢性酒精中毒患者還是急性酒精中毒患者，其心臟肌肉內(nèi)的FAEEs濃度都達(dá)到了115μmol/L[26]。Bhupendra等[28-29]等測(cè)定了39位病人血液樣本中FAEEs的濃度，并且考察了FAEEs濃度與體內(nèi)酒精濃度的關(guān)系，其中41～50歲年齡范圍的病人FAEEs濃度最高，但性別差異不明顯。在大多數(shù)患者中檢測(cè)到的主要FAEEs為棕櫚酸乙酯和油酸乙酯，并且FAEEs的濃度隨著血醇濃度的增加而增加，但是相比較而言, 急性酒精中毒患者比慢性酒精中毒患者的FAEEs濃度低(分別為4250、15086ng/mL)。沒(méi)有任何慢性酒精攝入患者檢測(cè)不出FAEEs，因此，F(xiàn)AEEs是一個(gè)可以作為慢性酗酒者體內(nèi)乙醇攝入更加可靠的標(biāo)志物。

4 FAEEs的分析測(cè)定

如果將血液中FAEEs作為乙醇攝入的標(biāo)記物，則樣品中FAEEs的穩(wěn)定性是一個(gè)非常重要的問(wèn)題。對(duì)人體血液中FAEEs進(jìn)行分析，研究收集容器、貯藏時(shí)間和貯藏溫度這些因素對(duì)血液中FAEEs濃度的影響[5]，結(jié)果顯示，室溫條件下4h內(nèi)需要分離出細(xì)胞血漿和血清，然后4h后需要將細(xì)胞血漿和血清進(jìn)行冷凍保存，以方便后續(xù)的分析檢測(cè)。還發(fā)現(xiàn)在裝有EDTA溶液的真空管中FAEEs的含量極少，以至于不能用于分析，這是因?yàn)橛幸粋€(gè)未知的機(jī)制降低了FAEEs的濃度。

人在攝入大量酒精后，F(xiàn)AEEs在人體循環(huán)中含量大多在50nmol/L～3μmol/L之間，測(cè)定低濃度的FAEEs需要靈敏度高和特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法，例如氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)。目前GC-MS采用與FAEEs極性相反的聚乙二醇和ZB-WAX毛細(xì)管柱來(lái)測(cè)定FAEEs，整個(gè)過(guò)程需要30～40min。Clark等[30]利用丙酮沉淀、正己烷提取，氨基丙基硅膠固相萃取法從血清中分離出FAEEs。Politi等[27]利用非極性的二甲基聚硅氧烷柱進(jìn)行GC-MS分析，對(duì)人血漿中FAEEs的峰具有很好的分離度，而且檢測(cè)時(shí)間縮短了60%以上，檢測(cè)下限降到5～10nmol/L，定量下限為60nmol。測(cè)量總FAEEs的批內(nèi)精密度(RSD)低于7%。Kwak等[31]用反相HPLC- MS-MS法檢測(cè)人類胎糞中的FAEEs含量，在正離子模式下通過(guò)ESI-MS-MS和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)進(jìn)行分離和定量，測(cè)定0.33nmol/g的亞油酸乙酯時(shí)，F(xiàn)AEEs的絕對(duì)回收率為(55±10)%，而當(dāng)測(cè)定1.55nmol/g十四烷酸乙酯時(shí)，F(xiàn)AEEs的絕對(duì)回收率提高到了(86±8)%。檢測(cè)限和定量限的范圍分別是0.01～0.08nmol/g和0.02～0.27nmol/g[32]。

5 結(jié) 語(yǔ)

乙醇非氧化代謝產(chǎn)物FAEEs不僅可以作為長(zhǎng)期攝入酒精的標(biāo)記物，還可能作為判斷急性酗酒和非急性酗酒的重要指標(biāo)，其在人體器官中以在胰腺中含量最高，此外在肝臟、心臟和大腦等器官中亦有較低濃度的FAEEs存在，并且對(duì)于胰腺炎的癥狀產(chǎn)生和復(fù)發(fā)有很大的促進(jìn)作用。酗酒可產(chǎn)生過(guò)多的FAEEs，雖然人們對(duì)其毒害作用的認(rèn)識(shí)在不斷深化，但對(duì)于FAEEs的細(xì)胞毒性和由此造成的器官損傷作用機(jī)制并不十分清楚，需要做進(jìn)一步更深入的研究。在一些生物標(biāo)記物中，因?yàn)镕AEEs的高靈敏度和特異性，對(duì)頭發(fā)中FAEEs的測(cè)定，并以此來(lái)估計(jì)人體內(nèi)的酒精攝入量，已成為了目前最常用的方法，然而，對(duì)于FAEEs的測(cè)定大多都采用GC、MS等大型儀器，并且樣品的制備過(guò)程較為繁瑣[27]，因此，對(duì)于能夠?qū)ふ乙环N簡(jiǎn)便、快速、靈敏的檢測(cè)FAEEs濃度的方法亦是今后的研究熱點(diǎn)。

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Research Advance in Non-Oxidized Metabolic Products of Ethanol: Fatty Acid Ethyl Esters

LI Jiang-tao，ZHANG Jiu-liang，HE Hui*，NIE Zhi-kui，MA Zhi-li
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Fatty acid ethyl esters (FAEEs), as the non-oxidized metabolic products of ethanol, play an important role in ethanol-induced organ damage and can serve as the long-term markers of ethanol intake. The toxicity of FAEEs in vivo, the extraction of enzymes associated with FAEEs and the detection of FAEEs are summarized in this paper. In addition, the evidence of FAEEs as alcohol intake markers is provided as well.

fatty acid ethyl esters；non-oxidized metabolic product；markers of ethanol intake；cytotoxicity

Q591.9

A

1002-6630(2013)03-0290-04

2011-12-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30972043)；國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2008AA10Z314)

李江濤(1986—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)和天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail：ljthyd@yahoo.com.cn

*通信作者：何慧(1960—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)和天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail：hehui@mail.hzau.edu.cn