豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒研究進(jìn)展

謝小紅，胡　意（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南長沙　410128）

豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒研究進(jìn)展

謝小紅，胡意
（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南長沙410128）

豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）是引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病的主要病原體，給養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。一直以來，對于PCV2的防控主要通過疫苗接種。目前使用的疫苗可大致分為全病毒滅活疫苗、嵌合病毒疫苗、重組亞單位疫苗三大類。病毒樣顆粒（VLPs）作為一種偽病毒，以其高免疫原性、高安全性成為新型疫苗的研究熱點(diǎn)。本文綜述了VLPs在國內(nèi)外的最新研究動態(tài)、研究和開發(fā)的意義，提出了VLPs作為一種基因轉(zhuǎn)載工具，其研究為疫苗研發(fā)開拓了新的方向。

豬圓環(huán)病毒；亞單位疫苗；病毒樣顆粒

1　PCV2的社會危害

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）首次發(fā)現(xiàn)于1974年，由Tischer等[1]在豬腎上皮細(xì)胞系（PK-15）的污染物中被分離到。由于當(dāng)時其并不引起豬的疾病，所以未受到太多關(guān)注，真正被世人熟知是在二十世紀(jì)末。當(dāng)時在豬場流行一種被稱為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的疾病。加拿大的Clark在報(bào)道患有此病的仔豬體內(nèi)分離到一種有別于PK-15細(xì)胞培養(yǎng)污染物中分離的豬圓環(huán)病毒（PCV1）的變種，它能引起豬的相關(guān)疾病，為了與之前發(fā)現(xiàn)的PCV1相區(qū)別，將這種能使豬致病的圓環(huán)病毒命名為圓環(huán)病毒2型（Porcine Circovirus 2，PCV2）。自發(fā)現(xiàn)以來，PCV2在全球范圍內(nèi)大規(guī)模暴發(fā)并迅速蔓延，給全球養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。學(xué)者們將PCV2在豬群中引起的一系列疾病統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病（PCVAD），主要包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎腎病綜合征（PDNS）、豬的相關(guān)性腸炎與肺炎、仔豬先天性顫動（CT）以及母豬的繁殖障礙等[2]。PCV2單獨(dú)感染并不會引起豬群明顯的病癥，但當(dāng)其與豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）或豬細(xì)小病毒（PPV）等病原體并發(fā)感染時，會導(dǎo)致豬群大規(guī)模發(fā)病，而且還會造成機(jī)體免疫抑制，使患病豬對病原體的自身抵抗力下降，進(jìn)而導(dǎo)致病癥加重。

2　PCV2的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

PCV2屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬（Circovirus），是一種小型無包膜的單鏈正股環(huán)狀DNA病毒，分子量為0.58×106Da[3]。病毒顆粒呈二十面體，平均直徑在17 nm左右[4]，是世界上發(fā)現(xiàn)的較小動物病毒之一。其基因組含有大約1 767～1 768個堿基，包含3個主要的開放閱讀框（ORFs），編碼三個主要的蛋白質(zhì)（Rep、Rep′、Cap）。衣殼蛋白Cap由ORF2編碼，基因組全長702 bp，含有233個氨基酸，分子量在27 kDa左右，是病毒顆粒唯一的結(jié)構(gòu)蛋白和免疫原性蛋白，能刺激機(jī)體產(chǎn)生持久的體液免疫和細(xì)胞免疫。該蛋白的N端存在一個核定位信號，由41個高度保守的氨基酸序列組成，且此區(qū)富含堿性氨基酸（如精氨酸），對于病毒在細(xì)胞核內(nèi)的定位必不可少。研究表明核定位信號區(qū)域的12RHRPRSH18和34HRYRWRRK41殘基與PCV2 ORF2的亞細(xì)胞定位密切相關(guān)[5]。利用合成肽技術(shù)鑒定PCV2 Cap蛋白上的抗原位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了5個精確的線性B細(xì)胞抗原表位，分別為92-103aa、156-162aa、175-192aa、195-201aa和231-233aa，并獲悉233位脯氨酸是PCV2特異的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)[6]。

3　PCV2疫苗的使用情況

疫苗免疫已成為豬場預(yù)防和控制PCV2感染的最佳選擇。從我國疫苗種類來看，預(yù)防 PCV2感染的疫苗種類繁多。這些疫苗大致可分為三大類：全病毒滅活疫苗、嵌合病毒疫苗、重組亞單位疫苗。全病毒滅活疫苗是利用甲醛等試劑將全病毒毒株滅活后加入佐劑制備而成。法國Merial公司的PCV2a全病毒滅活疫苗Circovac ?最先開始推向市場，用于繁育母豬和三周齡以上仔豬，其在減少感染量和減輕臨床癥狀方面表現(xiàn)出較好的臨床效果。PCV2全病毒滅活疫苗具有免疫原性好、保護(hù)力確切等優(yōu)點(diǎn)，但是制備全病毒滅活疫苗需要培養(yǎng)大量的病毒，而普通的細(xì)胞培養(yǎng)很難得到高滴度的PCV2，且由于 PCV2不同亞型間的交叉保護(hù)力不強(qiáng)，一旦毒株變異，疫苗的保護(hù)力就大打折扣。

嵌合病毒疫苗是應(yīng)用基因工程手段將不致病的PCV1 ORF1基因用致病的ORF2的基因片段替換[7]，構(gòu)建重組基因，表達(dá)多種病原體抗原的一類新型疫苗。由于該嵌合病毒含有PCV2的ORF2，可以在宿主體內(nèi)表達(dá)成相應(yīng)的Cap蛋白，刺激宿主細(xì)胞產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。不過嵌合病毒疫苗存在免疫持續(xù)期短、制備成本大的缺陷，還可能存在一定的導(dǎo)致PCV2變異株產(chǎn)生的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

重組亞單位疫苗是將 PCV2 ORF2基因插入的表達(dá)載體中，表達(dá)出具有PCV2免疫原性的Cap蛋白，再將純化的蛋白加入免疫佐劑制備而成。近年來國內(nèi)一些研究者開展了大量的 PCV2亞單位疫苗研發(fā)課題。張永武[8]等利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了 PCV2的 Cap 蛋白；張家明[9]等用Cap 蛋白制備的亞單位蛋白疫苗在小鼠體內(nèi)進(jìn)行免疫試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)動物產(chǎn)生特異性抗體，證明PCV2亞單位蛋白疫苗能為動物提供有效保護(hù)。但是由于常規(guī)的亞單位疫苗中的靶蛋白在制備過程中存在無法正確折疊，或者給動物接種時無法充分被抗原遞呈細(xì)胞識別攝取等問題，因此相比于弱病毒疫苗，其免疫源性稍差一些。

4　PCV2病毒樣顆粒的研究進(jìn)展

近年來的不少研究發(fā)現(xiàn)，某些病毒的結(jié)構(gòu)蛋白能在細(xì)胞內(nèi)自主組裝成不含病毒核酸的空心顆粒，它們在形態(tài)上與真正病毒粒子相同或相似，被稱為病毒樣顆粒（Virus-like particles，VLPs）。根據(jù)其天然病毒構(gòu)造，大致將VLPs分為無包膜VLPs和有包膜VLPs兩類。有包膜VLPs除含有衣殼蛋白外，其外層還被一層宿主細(xì)胞膜包圍。無包膜VLPs通常由一種或多種病毒衣殼蛋白組裝而成，其形態(tài)和結(jié)構(gòu)規(guī)則完全可以模擬天然病毒的結(jié)構(gòu)。在近幾十年里，VLPs作為一種有效的表位展示載體及新型亞單位疫苗，具有免疫源性好、安全性高等優(yōu)勢，作為展示載體能與其他病毒重組成多價(jià)苗或聯(lián)苗，成為新型疫苗的研究熱點(diǎn)和開發(fā)方向。許多人類和動物的病毒都可以形成VLPs[10-12]，如細(xì)小病毒VLPs[13-14]、人乳頭瘤病毒VLPs[15]、鼠多瘤病毒VLPs[16]等。由于VLPs在形態(tài)結(jié)構(gòu)上與天然的病毒粒子有極強(qiáng)相似度，與其他類型的亞單位疫苗相比，更容易被抗原遞呈細(xì)胞捕捉并呈遞給免疫系統(tǒng)。且其幾乎不含病毒基因組，在宿主細(xì)胞內(nèi)無復(fù)制增殖能力，完全避免了滅活苗和弱毒苗在動物機(jī)體內(nèi)潛在的返祖、變異或散毒等風(fēng)險(xiǎn)，具有更高的安全性。VLPs表面能夠以高密度的方式展示病毒的主要抗原表位，有利于其被抗原遞呈細(xì)胞尤其是樹突細(xì)胞（Dendritic Cells，DCs）捕捉攝取，進(jìn)而有效刺激CD4+T細(xì)胞以及CDB+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的免疫反應(yīng)。在無佐劑情況下仍可被DCs攝取，并促進(jìn)DCs的成熟和遷移，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生高效的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[17]。相比于常規(guī)的亞單位重組蛋白，VLPs可刺激機(jī)體引發(fā)更高效、持久、廣泛的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)?；赩LPs獨(dú)有的免疫特性，其作為一種理想的疫苗開發(fā)形式受到廣泛關(guān)注。

5　PCV2 病毒樣顆粒的現(xiàn)階段國內(nèi)外研究動態(tài)

目前采用昆蟲-桿狀病毒（Sf9-Baculovirus）表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)成功表達(dá)出PCV2 Cap蛋白[18]，密度梯度離心后可以得到較高濃度和純度的PCV2 VLPs。將其制備成PCV2 VLPs新型亞單位疫苗后接種易感動物，也得到很好的免疫效果。自PCV2 VLPs亞單位疫苗投入使用后，豬群中PCV2流行情況得到較為有效的控制，成為國際市場上控制PCV2的主要疫苗類型。不過利用昆蟲-桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)PCV2 Cap蛋白的工藝還不夠完善，使得生產(chǎn)程序復(fù)雜，價(jià)格昂貴，導(dǎo)致亞單位疫苗投入生產(chǎn)受到很大限制。如果利用原核表達(dá)系統(tǒng)等生產(chǎn)PCV2 VLPs將大幅度降低PCV2 VLPs的生產(chǎn)成本。由此可見，影響VLPs制備的關(guān)鍵因素就是衣殼蛋白表達(dá)系統(tǒng)的選擇及優(yōu)化[19]。在不同表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的病毒衣殼蛋白會有不同的特征，從而影響其自主組裝折疊[20]。很多研究者利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)PCV2的Cap蛋白質(zhì)，并計(jì)劃將其在體外自主組裝折疊成VLPs，但結(jié)果顯示得到的Cap蛋白并未成功組裝成VLPs[21]。2013年，Yin等[22]在PCV2 ORF2基因5’端插入一個Sumo-融合標(biāo)簽，極大程度地提高了Cap蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌中的表達(dá)效率，將純化后的蛋白用酶切技術(shù)去除Sumo-融合標(biāo)簽后能在體外自主組裝折疊成VLPs。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)及組裝Cap VLPs 是可能的，但其表達(dá)和組裝機(jī)理較昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)復(fù)雜，有待進(jìn)一步研究。目前在國內(nèi)外，對PCV2 VLPs的組裝機(jī)理研究甚少，對于下游PCV2 VLPs作為基因運(yùn)載體的研究與應(yīng)用更是少見。

6　PCV2 病毒樣顆粒研究和開發(fā)的意義

由于PCV導(dǎo)致的相關(guān)疾病會對豬的免疫系統(tǒng)造成嚴(yán)重破壞，與其他病原體繼發(fā)感染導(dǎo)致病豬癥狀加重，在外界多種因素的刺激下，接種疫苗不當(dāng)還會引發(fā)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征，因此開發(fā)出對豬刺激小、安全性好、廉價(jià)高效的PCV2疫苗產(chǎn)品已經(jīng)成為疫苗生產(chǎn)工業(yè)的一大挑戰(zhàn)。VLPs疫苗與傳統(tǒng)的亞單位疫苗相比，只需要低劑量的有效抗原就能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，達(dá)到與全病毒相似的免疫效果，且對機(jī)體產(chǎn)生更弱的應(yīng)激反應(yīng)。VLPs的這些免疫特性使其在新型疫苗研究中受到極為廣泛的關(guān)注。早在上世紀(jì)七十年代末就有文獻(xiàn)報(bào)道鼠多瘤病毒的假衣殼顆?？梢园懵兜腄NA，暗示著假衣殼有攜帶DNA的潛質(zhì)[23]。二十一世紀(jì)初，不少文獻(xiàn)報(bào)道了人乳頭狀病毒VLPs和鼠多瘤病毒VLPs可以包裹一定長度的外源性DNA，并可將其帶入宿主細(xì)胞內(nèi)[24-25]。有研究證明人乳頭狀病毒VLPs能有效攜帶siRNA分子進(jìn)入到靶細(xì)胞，對人類宮頸癌的治療可起到有效的臨床作用[26]。

PCV2 VLPs與其他病毒VLPs相比，具有十分獨(dú)特的優(yōu)勢。很多病毒包含兩個或者多種不同的衣殼蛋白質(zhì)，因而其VLPs 的蛋白表達(dá)和組裝過程更為復(fù)雜繁瑣。而PCV2 VLPs結(jié)構(gòu)簡單，僅由病毒唯一一種結(jié)構(gòu)蛋白（Cap）構(gòu)成，組裝過程中只需要表達(dá)一種蛋白質(zhì)，這就使得PCV2 VLPs制備工序和組裝難度大大降低。Khayat等[27]通過對PCV2衣殼蛋白的深入研究，已將其Cap 蛋白質(zhì)的三維晶體結(jié)構(gòu)解析出來，為對PCV2 VLPs的結(jié)構(gòu)研究提供了基礎(chǔ)。目前研究表明PCV2主要以硫酸乙酰肝素（HS）和硫酸軟骨素（Chon-droitin sulfate B，CS-B）作為廣譜性受體[28]，對大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞都具有侵染性。這些優(yōu)勢暗示著PCV2 VLPs也可以和乳頭狀病毒VLPs一樣，作為一種基因運(yùn)載體，攜帶藥物分子、siRNA或外源基因進(jìn)入細(xì)胞。基于PCV2 VLPs的諸多優(yōu)勢，在生物學(xué)研究和臨床疫苗方面，對其進(jìn)行深入研究和開發(fā)具有十分重要的指導(dǎo)意義。

7　結(jié)語

從目前形勢來看，PCV2亞單位疫苗的接種，對于豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病的預(yù)防和控制起到一定的良性作用。在臨床應(yīng)用上，PCV2 VLPs作為一種新型的亞單位疫苗，保持了病毒顆粒表面抗原蛋白的天然構(gòu)象，幾乎不含病毒基因組，具有同天然病毒相似的免疫源性，且更安全高效，是目前新型病毒疫苗研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。目前PCV2 VLPs的組裝及包裹外源物質(zhì)的機(jī)理尚未被完全了解，且其具有的其他生物學(xué)意義也還沒有被完全挖掘出來，但是作為一種基因轉(zhuǎn)載工具，PCV2 VLPs為疫苗研發(fā)開拓了新的研究方向。

[1] Tischer I，Rasch R，Tochtermann G. Characterization of papovavirus- and picornavirus -like particles in permanent pig kidney cell lines[J]. Zentralbl Bakteriol，1974，226：153-167.

[2]陸萍，童彤，王艷，等. 不同基因簇PCV2b安徽株對感染小鼠免疫應(yīng)答的影響[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2015（1）：37-42.

[3]Tischer I，Gelderblom H，Vettermann W，et al. A very small porcine virus with circular single-stranded DNA. Nature，1982，295：64-66.

[4] Segalés J，Kekarainen T，Cortey M. The natural history of porcine circovirus type 2：from an inoffensive virus to a devastating swine disease? [J]. Vet Microbiol，2013，165（1/2）：13-20.

[5]Liu Q，Tikoo S K，Babiuk L A，et al. Nuclear localization of the ORF2 protein encoded by porcine circovirus type 2[J]. Virology，2001，285（1）：91-99.

[6]商紹彬.豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白抗體間接ELISA檢測技術(shù)的建立[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2007.

[7]王一平，郭龍軍，唐青海，等.豬圓環(huán)病毒2型疫苗的研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012（9）：1337-1345.

[8] 張永武，連海，張錦霞，等.表達(dá)豬圓環(huán)病毒 2 型 Cap蛋白的重組桿狀病毒的構(gòu)建與鑒定[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016，37（3）：14-18.

[9]張家明. 豬圓環(huán)病毒 2 型 ORF2 在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)及亞單位疫苗的初步研究[D] . 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[10]McAleer W，Buynak E，Maigetter R，et al. Human hepatitis B vaccine from recombinant yeast[J].Nature，1984，307（5947）：178-180.

[11]Martinez C，Dalsgaard K，Lopez de Turiso J A，et al. Production of porcine parvovirus empty Caps with high immunogenic activity[J]. Vaccine，1992，10（10）：684-690.

[12]Yao Q，Kuhlinann F，Eller R，et al. Production and Characterization of Simian-HumanImmunodeficiency Virus-Like Particles[J]. AIDS Res.Hum.Retroviruses，2000，16（3）：227-236.

[13]Gilbert L，Toivola J，Lehtomaki E，et al. Assembly of fluorescent chimeric virus-like particles of canine parvovirus in insect cells[J]. Bio. chem. Biophys. Res. Commun，2004，313（4）：878-887.

[14]Feng H，Liang M，Wang H，et al. Recombinant canine parvovirus-like particles express foreign epitopes in silkworm pupae[J]. Vet. Microbiol，2011，154：49-57.

[15] Hagensee M E，Yaegashi N，Galloway D. Self-assembly of human papillomavirus type 1 Caps by expression of the L1 protein alone or by coexpression of the L1 and L2 Cap proteins[J]. J. Virol，1993，67（1）：315-322.

[16]Lawatscheck R，Aleksaite E，Schenk J A，et al. Chimeric polyomavirus derived virus like particles：the immunogenicity of an inserted peptide applied without adjuvant to mice depends on its insertion site and its flanking linker sequence[J]. Viral Immunol，2007，20（3）：453-460.

[17]萬敏.PCV2b病毒樣顆粒疫苗的制備及檢測[D].長春：吉林大學(xué)，2014.

[18]Nawagitgul P，Morozov I，Bolin SR，et al. Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major Cap protein[J]. J Gen Virol，2000，81（9）：2281-7.

[19]余婉婷，湛洋，雷昕諾，等.豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的研究應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘，2015（5）：57-58.

[20]莊金秋，梅建國，李峰，等.病毒樣顆粒疫苗及其在豬病防控中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].養(yǎng)豬，2015（3）：121-124.

[21] Marcekova Z，Psikal I，Kosinova E，et al. Heterologous expression of full-length Cap protein of porcine circovirus 2 in Escherichia coli and its potential use for detection of antibodies[J]. Arch Virol，2009，162（1/2）：133-141.

[22] Yin S，Sun S，Yang S，et al. Self-assembly of virus-like particles of porcine circovirus type 2 Cap protein expressed from Escherichia coli[J]. Virol J，2010，7（166）：1-5.

[23] BarrSM，KeckK，AposhianH.Cell-free assembly of a polyoma-like particle from empty Capsids and DNA[J]. Virology，1979，96：656-659.

[24] Gillock ET，Rottinghaus S，Chang D，et al. Polyomavirus major capsid protein VP1 is capable of packaging cellular DNA when expressed in the baculovirus system[J]. J Virol，1997，71：2857-2865.

[25] Stokrova J，Palkova Z，F(xiàn)ischer L，et al.Interactions of heterologous DNA with polyomavirus major structural protein，VP1[J]. FEBS Lett，1999，445：119-125.

[26] Bousarghin L，Touze A，Gaud G，et al. Papillomavirus virus -like particles packaged with human inhibition of cervical cancer cell growth by human papillomavirus oncoprotein short hairpin RNAs[J]. Mol Cancer Ther，2009，8：357-365.

[27] Khayat R，Brunn N，Speir JA，et al.The 2.3-angstrom structure of porcine circovirus 2[J]. J Virol，2011，85（15）：7856-7862.

[28] Misinzo G，Delputte P，Meerts P，et al. Porcine circovirus 2 uses heparin sulfate and chondroitin sulfate B glycosaminoglycans as receptors for its attachment to host cells[J]. J Virol， 2006，80：3487-3494.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Research Progress on Virus-like Particles of Porcine Circovirus Type 2

Xie Xiaohong，Hu Yi
（Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan410128）

Porcine circovirus type 2（PCV2）is the main etiological agent of PCV2-associated diseases（PCVAD），causing enormous economic loss in pig industry. By far，vaccination is the major prevention and control measure against PCVAD. There are three kinds of vaccines applied in production at present，including inactivated whole-virus vaccine，mosaic virus vaccine and recombinant subunit vaccine. As a type of“fake”virus，PCV2 VLPs（viruslike particles）has become a hot research topic in the development of new vaccines，due to its advantages of better immunogenicity and higher security than traditional vaccines. In this article，the newest research trends and significance of research and exploitation were given a review. At the end，a conclusion was drawn：as a tool of genetic transfer vector，the research of VLPs would open up a new direction for the vaccine research and development.

porcine circovirus；subunit vaccine；virus-like particles

S851.3

A

1005-944X（2016）12-0060-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.12.018