不同應(yīng)力刺激對(duì)成骨細(xì)胞影響的研究進(jìn)展

王大維 王浩 董福生

1.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院口腔科，石家莊 050051 2.河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科，石家莊 050017

在生長發(fā)育過程中，機(jī)械應(yīng)力作為體內(nèi)復(fù)雜力學(xué)環(huán)境中的重要組成部分，調(diào)節(jié)著骨組織的形成及改建，尤其在成骨過程中的作用更為明顯。成骨細(xì)胞是應(yīng)力敏感細(xì)胞的一種，其生長分化、功能活動(dòng)及凋亡對(duì)骨骼形成與礦化的程度都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。早在1892年Julius Wolff等[1]就提出了Wolff定律，指出骨骼的生長會(huì)受應(yīng)力刺激而改變結(jié)構(gòu)。Hou等[2]也在小鼠活體實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，物理刺激可以影響成骨細(xì)胞新陳代謝，調(diào)節(jié)細(xì)胞表型，并改變成骨細(xì)胞在骨發(fā)生及發(fā)展中的基因表達(dá)。骨組織對(duì)機(jī)械應(yīng)力刺激的應(yīng)答過程可劃分為4個(gè)連續(xù)的過程，即力學(xué)偶聯(lián)過程、生化偶聯(lián)過程、信號(hào)傳遞過程、效應(yīng)細(xì)胞的反應(yīng)過程。應(yīng)力刺激作用于機(jī)體時(shí)，成骨細(xì)胞通過力學(xué)刺激應(yīng)答過程將物理信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)信號(hào)，經(jīng)過一系列復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)過程，改變成骨細(xì)胞的基因表達(dá)及蛋白分泌，進(jìn)而調(diào)控骨骼的生長、修復(fù)及改建。本文從不同應(yīng)力刺激對(duì)成骨細(xì)胞功能的影響、成骨細(xì)胞對(duì)外力刺激的應(yīng)答及信號(hào)傳導(dǎo)通路等方面作一綜述。

1 不同應(yīng)力刺激對(duì)成骨細(xì)胞功能的影響

目前研究不同應(yīng)力刺激對(duì)成骨細(xì)胞功能的影響，常見的應(yīng)力加載方式有牽張力、壓應(yīng)力及流體剪切力等。不同的應(yīng)力加載方式和裝置會(huì)對(duì)成骨細(xì)胞產(chǎn)生不同的應(yīng)力效果。

1.1 牽張力對(duì)成骨細(xì)胞功能的影響

在體內(nèi)，成骨細(xì)胞可分泌基質(zhì)包裹自身，外力通過對(duì)此基質(zhì)的形變刺激傳導(dǎo)給細(xì)胞骨架，這些外力導(dǎo)致基質(zhì)的變形，在骨陷窩及骨小管周圍對(duì)成骨細(xì)胞形成拉力。目前多數(shù)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的牽張力加載裝置是基于此原理[3]。通過模仿生理狀態(tài)下基質(zhì)的形變，采用不同方法牽拉培養(yǎng)基膜，使粘附于基膜上的成骨細(xì)胞被動(dòng)拉伸。近年來許多學(xué)者對(duì)牽張力加載裝置進(jìn)行了改進(jìn)，如改用鈦合金作為支架、使用彈性合適的硅膠或生物高分子材料等，并可調(diào)控刺激的大小、方向、頻率、周期等[4]，但此種裝置仍有其缺點(diǎn)，細(xì)胞受力大小取決于基質(zhì)與基底膜的接觸，培養(yǎng)基膜各區(qū)域細(xì)胞容易產(chǎn)生受力不均勻等情況，而且體外培養(yǎng)基膜的應(yīng)變明顯大于骨基質(zhì)，且單軸牽拉時(shí)，牽拉軸的垂直方向可對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生收縮壓力。周期性培養(yǎng)基膜屈曲形變時(shí)，若屈曲率過大則產(chǎn)生流體剪切力，增加干擾因素。

成骨細(xì)胞對(duì)牽張應(yīng)力的作用很敏感。牽張刺激會(huì)激發(fā)成骨細(xì)胞的分化和增殖潛力，還可以刺激成骨細(xì)胞通過調(diào)整縫隙連接或旁分泌因子來調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞[5-6]。此外，由于多孔微管特殊結(jié)構(gòu)的放大效應(yīng)，成骨細(xì)胞可感應(yīng)到牽拉應(yīng)力并傳遞至臨近細(xì)胞[7]。在日常生活及運(yùn)動(dòng)中，機(jī)體內(nèi)牽張力范圍大約為500～3000 με。唐麗靈等[8]對(duì)成骨細(xì)胞施加周期性拉伸刺激，發(fā)現(xiàn)500 με的拉伸刺激促進(jìn)了成骨細(xì)胞的增殖、膠原蛋白合成、堿性磷酸酶活力和骨鈣素分泌，而1000 με和1500 με水平的拉伸則抑制了成骨細(xì)胞的生長和分化能力。Jacobs等[9]利用不同大小靜態(tài)拉力分別刺激人牙周膜成纖維細(xì)胞及成骨細(xì)胞，認(rèn)為合適大小的牽張力可促進(jìn)人牙周膜成纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化，過高的牽張力則會(huì)導(dǎo)致成骨細(xì)胞活力降低，不利于骨的改建。Shen等[10]的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)周期性牽張力可促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。這些研究表明，只有合適大小及頻率的牽張力才能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化，促進(jìn)骨的生長、修復(fù)和改建。

1.2 流體剪切力對(duì)成骨細(xì)胞功能的影響

骨組織內(nèi)存在大量的微管結(jié)構(gòu)，外界應(yīng)力可引起微管內(nèi)液體流動(dòng)，形成流體剪切力?？梢哉f，剪切力是一種特殊形式的壓力。目前廣泛使用的流體剪切應(yīng)變模型為并行平板流動(dòng)室(parallel-plate flow chamber，PPFC)，它是一種可以提供較精確液體層流的實(shí)驗(yàn)裝置，利用進(jìn)出口的壓力梯度造成流體剪切力，常用于研究細(xì)胞流體力學(xué)[11]。但是傳統(tǒng)的平行平板流動(dòng)室系統(tǒng)仍存在操作復(fù)雜、加工價(jià)格較貴、處理細(xì)胞的數(shù)量不足等缺點(diǎn)，且如何提供細(xì)胞在加載中所需要的溫度、濕度、CO2分壓等問題尚未能解決。2010年Zhou等[12]提出了一種全新的模擬流體剪切力的加載方式—“搖晃法”加載系統(tǒng)。他們構(gòu)建了一個(gè)有節(jié)律的搖晃矩陣培養(yǎng)板模型給細(xì)胞定量加載流體剪切力，并利用數(shù)學(xué)模型確定了臨界翻轉(zhuǎn)角度以及所產(chǎn)生流體剪切力的理論數(shù)值。其力值大小與液體的粘稠度和最大搖擺角成正比，與矩陣內(nèi)液體的深-長比和搖擺周期成反比。Zhou等認(rèn)為，在這種上下?lián)u晃的系統(tǒng)中，只要控制得當(dāng)，模型中細(xì)胞所受流體剪切力差異將少于20%。此種加載方式優(yōu)點(diǎn)在于簡便易行，可處理大量細(xì)胞，便于激光共聚焦顯微鏡或原子力顯微鏡的原位觀測(cè)，且其產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)剪切力能更好地模擬活體組織中的力學(xué)環(huán)境。

但Zhou等并未將此裝置應(yīng)用于實(shí)際，沈等[13]利用此裝置對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行了加載。他們將生長活躍期的成骨細(xì)胞以5×105個(gè)/ml的密度接種在矩形培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后，于超凈臺(tái)上將培養(yǎng)皿放置于CHA-S恒溫振蕩器上，設(shè)定晃動(dòng)頻率和幅度，保持晃動(dòng)時(shí)培養(yǎng)液與培養(yǎng)皿底面的角度不超過±5°，頻率為120 r/min。加載液(DMEM培養(yǎng)基)的量為18.6 ml時(shí)，根據(jù)Zhou等提出的培養(yǎng)皿中心處的流體剪切應(yīng)力公式計(jì)算，培養(yǎng)皿中84%區(qū)域的細(xì)胞將受到6.2～8.8 dyne/cm2的流體剪切應(yīng)力。通過與平行平板流動(dòng)室結(jié)果的比較，沈等認(rèn)為，“搖晃法”更適用于：(1)多組別、大通量的細(xì)胞加載研究；(2)加載后對(duì)細(xì)胞內(nèi)極微量的細(xì)胞因子進(jìn)行定量檢測(cè)；(3)需要對(duì)加載后的細(xì)胞進(jìn)行原位觀測(cè)的情況。此外，Lim等[14]也利用“搖晃法”成功誘導(dǎo)了牙槽骨間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化。

越來越多的證據(jù)表明，在機(jī)械外力加載后，由于胞外液體在微管結(jié)構(gòu)中流動(dòng)產(chǎn)生的流體剪切力，是調(diào)節(jié)骨細(xì)胞新陳代謝的主要外界刺激。Burger等[15]提出的腔隙-小管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的假說，認(rèn)為骨組織中腔隙-小管構(gòu)成的三維網(wǎng)絡(luò)執(zhí)行骨中力學(xué)傳感和力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，剪應(yīng)力是外在力學(xué)刺激傳感到骨組織細(xì)胞的主要作用形式。成骨細(xì)胞在體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)中均可受流體剪切力的作用，動(dòng)態(tài)的流體剪切力可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化增殖，抑制成骨細(xì)胞凋亡[16]。Qin等[17]研究表明，骨髓內(nèi)震蕩壓力產(chǎn)生的流體剪切力及流體靜壓力可促進(jìn)骨生成，Zhang等[18]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)。Li等[19]實(shí)驗(yàn)顯示流體剪切力能夠提高骨密度。Young等[20]則進(jìn)一步提出，流體剪切力是通過誘導(dǎo)COX-2的表達(dá)，調(diào)節(jié)PG的產(chǎn)生，從而影響骨新陳代謝的整個(gè)過程。而Jiang等[21]認(rèn)為ERK5信號(hào)通路是誘導(dǎo)COX-2表達(dá)的重要途徑。Aisha等[22]也發(fā)現(xiàn)流體剪切力可明顯促進(jìn)人體成骨細(xì)胞內(nèi)線粒體的代謝和增殖，防止細(xì)胞凋亡，促進(jìn)ALP活性及骨鈣素蛋白增加，且細(xì)胞內(nèi)RANKL/OPG的比值降低，提示流體剪切應(yīng)力可抑制破骨細(xì)胞活性。

1.3 壓應(yīng)力對(duì)成骨細(xì)胞功能的影響

目前關(guān)于壓應(yīng)力對(duì)成骨細(xì)胞功能的影響相對(duì)研究較少。早期研究壓應(yīng)力對(duì)成骨細(xì)胞功能的影響主要為靜態(tài)壓應(yīng)力。Koyama等[23]的研究顯示，3.0 g/cm2的持續(xù)靜壓力可促進(jìn)成骨細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的骨吸收。Quinn等[24]認(rèn)為持續(xù)的靜態(tài)壓力使細(xì)胞與培養(yǎng)基內(nèi)可溶物質(zhì)交換減慢，導(dǎo)致細(xì)胞代謝功能的減退。在正常生理情況下，骨組織在受力過程中因運(yùn)動(dòng)、重力等多種因素影響，位于骨組織表面、骨內(nèi)外膜下的成骨細(xì)胞同時(shí)也受到持續(xù)不規(guī)則的力學(xué)刺激，因此持續(xù)性動(dòng)態(tài)壓力對(duì)成骨細(xì)胞的代謝及成骨作用有重要影響。Liu等[25-26]認(rèn)為動(dòng)態(tài)壓力可誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞的早期成骨分化，促進(jìn)骨組織礦化及細(xì)胞的增殖。Damaraju等[27]認(rèn)為動(dòng)態(tài)壓力可以加速成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞的聚集。Sanchez等[28]也認(rèn)為動(dòng)態(tài)壓力可使細(xì)胞內(nèi)IL-6水平升高從而調(diào)控骨的生成。

目前對(duì)于壓力的加載方式主要為氣壓調(diào)控，也有部分實(shí)驗(yàn)采用離心作用，對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行離心加載，來模擬運(yùn)動(dòng)過程中骨所受壓力，此種加力方式優(yōu)點(diǎn)是力值穩(wěn)定，方向一致，可靠性好，不損傷細(xì)胞，可以多次重復(fù)進(jìn)行，但在離心過程中細(xì)胞由于離心力加載時(shí)細(xì)胞并不處于統(tǒng)一的離心半徑，因而其應(yīng)用存在一定局限性。近年出現(xiàn)的Flexcell壓力系統(tǒng)能為各種組織、三維細(xì)胞培養(yǎng)物提供壓力加載，其具備多種優(yōu)點(diǎn)，如可以提供周期性動(dòng)態(tài)壓力；實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞及組織在壓力作用下的反應(yīng)；基于柔性膜基底變形受力均勻；加載頻頻率、形變率可以精確調(diào)節(jié)；操作簡便等，是以后研究壓力對(duì)細(xì)胞功能影響的較理想裝置。

2 成骨細(xì)胞對(duì)外力刺激的應(yīng)答及信號(hào)傳導(dǎo)通路

早在20年前，Duncan和Turner[29]就已經(jīng)將細(xì)胞內(nèi)感受機(jī)械應(yīng)力的過程總結(jié)為4個(gè)階段：第一步為力耦合，即將骨組織受到的機(jī)械應(yīng)力傳遞至細(xì)胞中，造成細(xì)胞外形的改變，或使骨基質(zhì)中間隙液流動(dòng)加快，造成流動(dòng)電勢(shì)，并使顯露于液流中的細(xì)胞受到剪切力的影響；第二步為力傳導(dǎo)，即將加載于細(xì)胞上的機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)換為細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)或電學(xué)應(yīng)答的過程；第三步為信號(hào)傳導(dǎo)，包括蛋白激酶級(jí)聯(lián)系統(tǒng)、G蛋白系統(tǒng)、力學(xué)特異敏感性離子通道、細(xì)胞間隙連接、第二信使系統(tǒng)等；最后一步是細(xì)胞發(fā)生生理反應(yīng)或功能變化，完成力學(xué)刺激對(duì)細(xì)胞的作用過程。成骨細(xì)胞作為骨組織中的應(yīng)力敏感細(xì)胞，在感受到外界力學(xué)刺激時(shí)，會(huì)通過多種信號(hào)傳導(dǎo)通路將機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)信號(hào)，通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳導(dǎo)到達(dá)效應(yīng)位點(diǎn)，從而刺激成骨細(xì)胞的功能活動(dòng)。由于應(yīng)力刺激導(dǎo)致的細(xì)胞因子改變是此過程中的關(guān)鍵，因此對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究是目前的熱點(diǎn)，其中BMPs及Wnt/β-catenin信號(hào)通路作為重要的通路而被廣泛研究。

2.1 BMP2-smad5-Runx2傳導(dǎo)通路在成骨細(xì)胞感受外力刺激中的作用

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP) 是多功能生長因子，其在骨組織中表達(dá)，為維持骨代謝平衡所必需，在骨骼發(fā)育和骨折愈合中發(fā)揮重要的作用，是一個(gè)極其重要的調(diào)節(jié)蛋白家族。骨形態(tài)發(fā)生蛋白除 BMP1 外均屬于TGF-β超家族。在迄今發(fā)現(xiàn)的約20多種BMPs成員中，以BMP-2、BMP-4和 BMP-7的活性最強(qiáng)。BMP2是BMPs家族中非常重要的一個(gè)亞型，可以刺激間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，并促進(jìn)成骨細(xì)胞分化為骨細(xì)胞。

BMPs與其受體BMPR結(jié)合，通過蛋白傳遞信號(hào)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，其中Smad-RunX2是BMPs向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)的主要通路之一[30]。Bjoern等[31]認(rèn)為適當(dāng)?shù)幕顒?dòng)或壓力刺激可通過增強(qiáng)骨生成效應(yīng)促進(jìn)骨折的愈合，10%的壓力[(11.81±0.42) kPa]可促進(jìn)BMP-2、smad-5、RunX2的表達(dá)，從而進(jìn)一步促進(jìn)ALP、COL1、OC、OPN等基因及蛋白的表達(dá)。Mitsui等[32]實(shí)驗(yàn)也證明了應(yīng)力可促進(jìn)BMP蛋白的表達(dá)，并確定了一個(gè)最佳的通過BMP通路成骨的作用力，來指導(dǎo)正畸臨床工作。Wang等[33]也認(rèn)為，拉應(yīng)力通過BMPs-Smad信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，并可能是通過降低Smurf1來促進(jìn)Smad蛋白聚集，從而激活BMPs-Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路。

2.2 Wnt/β-catenin信號(hào)通路在成骨細(xì)胞感受外力刺激中的作用

Wnt 基因于1982年由Nusse等發(fā)現(xiàn)[34]，其編碼的Wnt蛋白具備分泌型生長因子的特點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)其能夠在應(yīng)力作用下通過自分泌的方式對(duì)成骨細(xì)胞發(fā)揮作用[35-36]。在成骨細(xì)胞中，Wnt蛋白參與了4 條信號(hào)通路，即 Wnt/β-catenin信號(hào)通路、平板細(xì)胞極性信號(hào)通路、Wnt/Ca2+信號(hào)通路、含環(huán)磷酸腺苷 (CAMP) 效應(yīng)元件結(jié)合蛋白的蛋白激酶A(PKA)信號(hào)通路[37]，其中Wnt/β-catenin信號(hào)通路即經(jīng)典信號(hào)通路研究最為成熟。細(xì)胞內(nèi)分泌的Wnt配體通過細(xì)胞表面受體Fzd家族與LRP5/LRP6受體結(jié)合形成復(fù)合物，受體復(fù)合物引起β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的積累，從而傳導(dǎo)信號(hào)至細(xì)胞內(nèi)。Norvell等[38]發(fā)現(xiàn)流體剪切力刺激可以激活 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路從而影響成骨細(xì)胞的分化。Robinson 等[39]發(fā)現(xiàn)體內(nèi)及體外加載應(yīng)力刺激都能夠促進(jìn)β-catenin 蛋白的表達(dá)，且Wnt/β-catenin信號(hào)通路可增加成骨細(xì)胞對(duì)機(jī)械力刺激的敏感性。Liu等[40]認(rèn)為，流體靜壓力可促進(jìn)Wnt蛋白表達(dá)，且應(yīng)力可能是通過ERK通路促進(jìn)Wnt10b表達(dá)。Jansen 等[41]的研究顯示，15 min的周期性拉伸應(yīng)力在實(shí)驗(yàn)初期可以促進(jìn)前成骨細(xì)胞內(nèi)β-catenin 蛋白的表達(dá)，但在結(jié)束周期性加載12 h和40 h后β-catenin 蛋白的表達(dá)明顯減少。另有研究發(fā)現(xiàn)[42]，在成骨作用中PTH與Wnt信號(hào)通路相關(guān)，主要表現(xiàn)在：即使細(xì)胞內(nèi)有Dkk1過表達(dá)，PTH仍可激活Wnt信號(hào)通路，而如用Dkk1抑制Wnt信號(hào)通路則會(huì)減弱PTH在基質(zhì)細(xì)胞中的作用且會(huì)抑制新骨的形成，PTH要發(fā)揮全部功能需要完整的Wnt信號(hào)通路。目前，雖然人們對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路在應(yīng)力作用下影響成骨細(xì)胞分化的機(jī)制有了初步認(rèn)識(shí)，但由于Wnt信號(hào)通路并不是單一的通路，而是與其他相關(guān)通路形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，因此在今后研究中應(yīng)著重探究Wnt/β-catenin信號(hào)通路和其他通路的交聯(lián)作用。

3 展望

骨生理學(xué)的研究已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞與分子生物學(xué)研究時(shí)代，成骨細(xì)胞作為骨組織中骨形成、骨改建調(diào)節(jié)和骨細(xì)胞來源的細(xì)胞群體，是參與骨代謝，維持正常骨量的重要功能細(xì)胞。隨著相關(guān)學(xué)科及實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展，應(yīng)力刺激對(duì)成骨細(xì)胞的作用逐漸成為了目前的研究熱點(diǎn)。近年來，人們通過不斷改進(jìn)實(shí)驗(yàn)裝置、更新實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)不同應(yīng)力刺激下成骨細(xì)胞的反應(yīng)有了初步的研究成果，但其具體機(jī)制仍不甚清晰，且由于各加載方案在條件控制、細(xì)胞來源、應(yīng)力性質(zhì)、頻率、大小等方面的差異，其所得結(jié)果也不盡相同，有待進(jìn)一步研究。

本文主要總結(jié)了不同應(yīng)力對(duì)成骨細(xì)胞的影響。由于骨細(xì)胞較成骨細(xì)胞對(duì)應(yīng)力更為敏感，所以研究不同應(yīng)力刺激對(duì)骨細(xì)胞的影響、力學(xué)刺激如何在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)樯飳W(xué)信號(hào)以及通過何種結(jié)構(gòu)或部位做出生物學(xué)反應(yīng)，是以后研究的方向和重點(diǎn)。