MicroRNA在阿爾茨海默病中的作用及機制

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MicroRNA在阿爾茨海默病中的作用及機制

田金鑫邵水金國海東

(上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室,上海201203)

關(guān)鍵詞〔〕阿爾茨海默?。晃NA；β淀粉樣蛋白

第一作者：田金鑫(1989-)，女，碩士，主要從事電針治療阿爾茨海默病的研究。

微RNA(miRNA)是真核生物中廣泛存在的非編碼RNA，長約21到23個核苷酸，預(yù)測轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)至少一半的人類轉(zhuǎn)錄組〔1〕。近年來發(fā)現(xiàn)，miRNA可能在阿爾茨海默病(AD)等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。了解和探討miRNA在AD中的作用及其機制可為臨床尋找特異性的治療靶點提供基礎(chǔ)。

1miRNA的生物學(xué)基礎(chǔ)

miRNA的生物合成途徑是高度保守的，每個miRNA的調(diào)控靶點大約200個，而一個 mRNA的轉(zhuǎn)錄可能受多個miRNA調(diào)節(jié)。許多miRNAs通過轉(zhuǎn)錄因子或表觀遺傳機制，包括DNA甲基化和組蛋白修飾，受到高度時間和空間上的調(diào)節(jié)〔2〕。

1.1miRNA的生物合成大部分miRNAs是通過經(jīng)典的miRNA生物合成途徑產(chǎn)生的。首先，miRNA基因由RNA聚合酶(pol)Ⅱ轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生長約幾千個堿基的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(pri-miRNA)。pri miRNAs具有5'端帽和3'端多聚腺苷酸。他們可能編碼一個單一的miRNA，獨特的miRNA簇，或者蛋白質(zhì)，因此也可以作為前體miRNA〔3〕。下一步，也發(fā)生在細胞核內(nèi)，由微處理器復(fù)合物的精密調(diào)控。此復(fù)合物的主要成分是RNA聚合酶Ⅲ(Drosha)和其結(jié)合配偶體DiGeorge氏綜合征關(guān)鍵區(qū)基因8 (DGCR8)，雙鏈RNA結(jié)合蛋白〔4〕。Drosha剪切pri-miRNAs釋放60～70個核苷酸長度的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，稱為前體miRNAs(pre-miRNA)。Exportin-5介導(dǎo)pre-miRNA將其從核內(nèi)運輸?shù)桨|(zhì)中。在胞質(zhì)中，第二個核糖核酸酶Ⅲ(Dicer)，切割pre-miRNA生成22個核苷酸的雙鏈miRNA。miRNA雙鏈與結(jié)合Argonaute(Ago)蛋白結(jié)合而迅速解鏈，一股成為成熟的miRNA，并結(jié)合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)上，通過降解靶mRNAs或阻遏轉(zhuǎn)錄參與mRNA表達的調(diào)控，見圖1。而互補鏈在細胞內(nèi)的濃度較低，被認為不具有功能，并且可被迅速降解。然而，最近的研究表明，一些互補鏈序列與不同的Ago蛋白復(fù)合物結(jié)合后也具有活性〔5〕。

圖1　經(jīng)典的miRNA生物合成途徑

miRNA的產(chǎn)生還包括其他非經(jīng)典的途徑，在哺乳動物已被確定有四條不依賴于Drosha的途徑，包括mirtron途徑、小核仁RNA、tRNA和短發(fā)夾RNA來源途徑〔6〕。在這些途徑中，pri-miRNAs被剪接形成短發(fā)夾狀內(nèi)含子，被稱為mirtrons，然后再被Exportin-5轉(zhuǎn)運和Dicer剪切〔7〕。mirtrons在靈長類動物的神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用〔8〕。此外，還有兩條不依賴于Dicer的miRNA合成途徑〔9〕。

1.2miRNA的再循環(huán)一般認為，miRNA半衰期長，是一種高度穩(wěn)定的分子〔10〕。核酸外切酶在miRNA降解和再循環(huán)中可能發(fā)揮重要作用。研究表明，在動物體內(nèi)，核酸外切酶(XRN)2可調(diào)控miRNA的衰退〔11〕。最近的研究證實，對于不同的miRNA和不同的類型細胞，miRNA的再循環(huán)差異很大，對神經(jīng)元來說，其miRNA具有快速衰退的特征〔12〕。miRNA再循環(huán)可能有助于解釋其調(diào)節(jié)大量的翻譯的能力〔13〕。成熟的miRNA通過結(jié)合到Ago從而受到保護，而mRNA靶序列的存在被認為是在防止miRNA從RISC復(fù)合物釋放以及隨后降解的重要保護因素。因此，當(dāng)mRNA靶序列不存在時，miRNA可被特異性釋放，使RISC可結(jié)合新的miRNA。

1.3miRNA的作用機制目前認為，miRNAs通過抑制mRNA翻譯或降解mRNA來調(diào)節(jié)基因表達。一旦摻入到RISC后，成熟miRNA通常在3'UTR區(qū)，通過堿基配對與靶mRNA轉(zhuǎn)錄識別。miRNA的2～6個核苷酸是目標(biāo)識別的關(guān)鍵。miRNA及其靶mRNA序列之間互補的程度影響下游調(diào)控機制，精確的匹配可導(dǎo)致降解，而錯配將導(dǎo)致翻譯抑制。關(guān)于翻譯抑制的確切機制仍不清楚，目前有一些相關(guān)的假說模型，包括抑制翻譯起始、促進靶mRNA脫腺苷化、將miRNA及其靶點封存到P小體或應(yīng)激顆粒或翻譯后RISC介導(dǎo)的蛋白降解〔14〕。miRNA與靶點相互作用可使蛋白水平降低1/2〔15〕。雖然miRNA被認為主要是負性調(diào)控基因表達，但在細胞應(yīng)激等情況下miRNA也可以激活其作用靶點。

2與AD相關(guān)的miRNA

AD是一種復(fù)雜的神經(jīng)退行性疾病，是老年癡呆癥的的最常見形式〔16〕。它起病隱匿，表現(xiàn)為緩慢的，漸進性的，并且不可逆的認知和記憶功能喪失，由于神經(jīng)元和突觸的破壞，最終將導(dǎo)致癡呆和死亡。AD的主要病理特征包括淀粉樣蛋白-β(Aβ)沉積形成的老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)及膽堿能神經(jīng)元及其突觸的喪失。關(guān)于AD的發(fā)病機制中，以Aβ級聯(lián)學(xué)說占主導(dǎo)地位。Aβ主要是一種40～42個 氨基酸片段，由其淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)APPβ位點裂解酶(BACE1)和γ-分泌酶依次裂解后生成。除了Aβ級聯(lián)學(xué)說外，還包括基因突變學(xué)說、膽堿能學(xué)說、免疫與炎癥學(xué)說和氧化應(yīng)激學(xué)說等。

miRNA在神經(jīng)系統(tǒng)中表達十分豐富，在軸突生長，樹突棘形成，神經(jīng)元分化和突觸可塑性等過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。最近的研究表明，miRNAs網(wǎng)絡(luò)的改變將影響疾病的進程。AD患者腦組織中存在miRNA失調(diào)〔17〕。這些疾病相關(guān)miRNA的變化主要位于灰質(zhì)區(qū)〔18〕。目前，已發(fā)現(xiàn)多種miRNA與AD關(guān)鍵基因調(diào)控變化有關(guān)，包括miR-106、miR-107、miR-132、miR-146、miR-153、miR-29和miR-9等。

2.1miR-106APP是miRNA調(diào)控的靶點之一。miR-106a和miR-106b可直接和APP mRNA結(jié)合，它們在AD患者前顳葉皮層表達下調(diào)〔19〕。有趣的是，miR-106能夠調(diào)節(jié)ATP-結(jié)合轉(zhuǎn)運體A1(ABCA1)，一種與ApoE脂化和生產(chǎn)Aβ的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運體，這表明miR-106的可以不止通過一條途徑影響Aβ的生成〔20〕。

2.2miR-107在AD的早期階段，顳葉皮層miR-107下調(diào)，并與BACE1上調(diào)有關(guān)，這可能影響Aβ的產(chǎn)生〔21〕。而miR-107的減少將進一步伴隨著神經(jīng)炎斑塊密度的升高〔22〕。有趣的是，miR-107和miR-124a除了BACE1之外還能調(diào)節(jié)APP代謝的其他方面，從而表明單一miRNA可影響同一條通路上多個靶點的能力，并可產(chǎn)生累加效應(yīng)的潛力。MiR-107可直接靶向加工APP的另一個分泌酶整合素和金屬蛋白酶10(ADAM10)，miR-124a通過直接靶向聚嘧啶結(jié)合蛋白1(PTBP1)參與APP mRNA選擇性剪接。

2.3miR-132研究表明，AD患者中miR-132表達異常。miR-132可介導(dǎo)Akt生存信號通路、抗炎通路和乙酰膽堿代謝〔23〕。在細胞培養(yǎng)模型，下調(diào)miR-132的水平可導(dǎo)致神經(jīng)元死亡〔24〕，并且AD和亨廷頓病(HD)的患者組織中miR-132的表達減少〔25〕。

2.4miR-146miR-146a是AD與炎癥有關(guān)的一種miRNA，它可以調(diào)控先天免疫。在受AD病理影響的大腦區(qū)域，包括海馬和顳葉皮層，miR-146a表達上調(diào)；而在未受影響的區(qū)域miR-146a水平保持不變〔26〕。研究表明，miR-146a的作用靶點包括補體因子(CF)H，白細胞介素(IL)-1受體相關(guān)激酶1(IRAK1)和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)6，這些都與AD失調(diào)的先天免疫和炎癥通路有關(guān)〔27〕。miR-146a還可作用于跨膜四旋(TSPAN)12，TSPAN12是ADAM10的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，因此miR-146a可能會影響Aβ的代謝〔28〕。這些發(fā)現(xiàn)進一步證明miRNA能夠影響多種通路并介導(dǎo)發(fā)病機制之間的串話。

2.5miR-153在APPswe/PSΔE9雙突變小鼠模型疾病的早期和晚期miR-153水平顯著下降。與缺少新皮層神經(jīng)元纖維纏結(jié)的標(biāo)本相比(對照和Braak Ⅰ/Ⅱ期標(biāo)本)，尸檢后發(fā)現(xiàn)有新皮層神經(jīng)元纖維纏結(jié)(Braak Ⅲ～Ⅳ期)的大腦標(biāo)本中miR-153的水平明顯降低。miR-153可影響APP和β淀粉樣蛋白前體樣蛋白(APLP)2的mRNA轉(zhuǎn)錄〔29〕。此外，在人額葉皮層，miR-153和APP在蛋白水平發(fā)生逆向共調(diào)控〔30〕。因此，miR-153可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控APP/APLP2的表達，但這種潛在的相互作用需要進一步的驗證。

2.6miR-29miR-29家族可與BACE1 mRNA靶向結(jié)合，在散發(fā)AD患者中與BACE1的表達呈負相關(guān)。這種相關(guān)具有AD特異性，并在HEK293和SH-SY5Y細胞培養(yǎng)模型中得到驗證。除了調(diào)節(jié)BACE1，在老年大腦中miR-29a/b升高，并可調(diào)控小膠質(zhì)細胞活化〔31〕。miR-29簇已在散發(fā)性和家族性患者中確定序列，并且發(fā)現(xiàn)與AD密切相關(guān)的簇中存在變異〔32〕。然而，這一發(fā)現(xiàn)需要在大樣本中進一步驗證，并深入闡明這些變異的具體作用。

2.7miR-9miR-9是一種高度保守的大腦富集的miRNA，也是迄今為止AD中最常見的失調(diào)miRNA，miR-9可能存在上調(diào)或下調(diào)兩種可能〔16〕。向體外原代培養(yǎng)神經(jīng)元中添加Aβ可導(dǎo)致miR-9快速下降，表明miR-9下調(diào)可能與斑塊形成相關(guān)〔33〕。miR-9的作用靶點包括神經(jīng)原纖維纏結(jié)中的一種蛋白質(zhì)神經(jīng)絲重鏈(NFH)和去乙?；窼IRT1，SIRT1與tau蛋白相互作用，并增加過磷酸化tau蛋白的積累〔34〕。其他三個抑制SIRT1的miRNAs，即miR-181c，miR-34，和miR-132，在AD大腦顯示一致的表達改變〔35〕。此外，miR-132有幾個與AD發(fā)病機制直接相關(guān)的靶點，包括張力蛋白同源物(PTEN)，叉頭蛋白O3A(FOXO)3A，和E1A結(jié)合蛋白P300，它們在神經(jīng)細胞凋亡和乙酰膽堿酯酶(AChE)中都發(fā)揮重要作用。抑制AChE與膽堿能抗炎通路有關(guān)，是目前治療AD的常規(guī)藥物〔36〕。

2.8miR-34miR-34作為AD的另一個指標(biāo)，他在體內(nèi)有三種存在方式miR-34a，miR-34b。miR-34c，其中miR-34a，miR-34c被證實跟AD關(guān)系最密切。miR-34c在AD患者外周單核細胞和血漿中都有明顯的升高，與同年齡的正常組對照。并指出miR-34c通過抑制參與細胞的存活和氧化防御途徑的幾個選定的基因的表達，如Bcl2，SIRT1等，實現(xiàn)神經(jīng)細胞的凋亡進而導(dǎo)致AD的發(fā)生發(fā)展〔37〕。

3miRNA治療AD的臨床應(yīng)用

目前已有多個miRNA治療其他疾病的臨床試驗，如癌癥和慢性丙型肝炎病毒感染〔38〕。并且預(yù)期在未來幾年將有更多類似的臨床試驗及應(yīng)用產(chǎn)生。miRNA的治療應(yīng)用主要通過兩個策略：利用miRNA模擬物進行RNA干擾(RNAi)和通過miRNA拮抗劑抑制miRNA。已有大量的研究表明，應(yīng)用RNAi技術(shù)靶向疾病相關(guān)基因，如BACE1和APP，在動物模型中表現(xiàn)出有益的作用〔39〕。但RNAi技術(shù)和傳統(tǒng)的藥物開發(fā)一樣面臨著同樣的挑戰(zhàn)，包括藥代動力學(xué)、靶向特異性、療效和毒性等〔37〕。而miRNA可以模仿自然發(fā)生的RNAi機制，因此可能毒性較低，并有證據(jù)表明治療神經(jīng)退行性疾病時，與其他的短發(fā)夾RNA(shRNA)相比，miRNA免疫激活明顯降低。

miRNA作為治療劑的一個優(yōu)點是它可以影響多個靶基因和通路。然而，這也可能是不利的，因為這可能導(dǎo)致脫靶效應(yīng)。每個miRNA可以靶向幾百個mRNA,因此，了解miRNA與內(nèi)源性RNA之間不期望的相互作用是顯得十分重要。另外一個值得考慮的是，人工合成的miRNA可能抑制體內(nèi)生物合成機制，從而削弱內(nèi)源性miRNA的作用。因此，非經(jīng)典合成途徑的mirtron人工合成物有望成為未來miRNA治療理想來源。

4結(jié)論

由于AD的發(fā)病機制涉及多條途徑，目前臨床上尚無根治AD的有效藥物，只能對癥治療，無法緩解AD的病理進程。miRNA通過作用多個靶點和途徑，顯然將成為AD治療的一個極具前景的有效策略。

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〔2015-01-22修回〕

(編輯李相軍)

通訊作者：國海東(1981-)，男，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥防治心腦血管疾病研究。

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助課題(81102670，31400838，81373754)

中圖分類號〔〕R741.02〔

文獻標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6271-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.129