應(yīng)用PCR-RFLP檢測(cè)老年靜脈血栓人群凝血酶原基因突變

曲兆潔　金　峰　史　磊　張　靜　梁　迪

(吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林　長(zhǎng)春　130021)

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應(yīng)用PCR-RFLP檢測(cè)老年靜脈血栓人群凝血酶原基因突變

曲兆潔金峰1史磊1張靜1梁迪

(吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130021)

摘要〔〕目的探討漢族健康人群和老年靜脈血栓病患者中G20210A突變的發(fā)生率。方法應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析技術(shù)對(duì)某地區(qū)72例健康個(gè)體和43例老年靜脈血栓患者進(jìn)行G20210A基因突變研究分析。結(jié)果漢族健康個(gè)體和老年靜脈血栓患者均未檢出G20210A基因突變類型包括純合子和雜合子。結(jié)論G20210A突變可能不是某地區(qū)漢族健康人群和老年靜脈血栓病患者發(fā)病的主要危險(xiǎn)因素。

關(guān)鍵詞〔〕凝血酶原基因;突變;檢測(cè)

1吉林大學(xué)第二臨床醫(yī)院

第一作者：曲兆潔(1991-)，女，在讀碩士，主要從事天然藥物化學(xué)研究。

凝血酶原基因中5'上游區(qū)和3'下游區(qū)為非編碼區(qū)，對(duì)凝血酶原基因的表達(dá)起調(diào)控作用〔1〕。凝血酶原G20210A突變導(dǎo)致凝血酶原水平升高，造成血液高凝引起血栓〔2〕，如靜脈血栓栓塞癥(VTE)中的深靜脈血栓(DVT)和肺血栓栓塞癥(PTE)。本研究應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP技術(shù))對(duì)某地區(qū)72例漢族健康人和43例老年靜脈血栓病人進(jìn)行了G20210A基因突變的研究分析。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象隨機(jī)抽取72例某地區(qū)無(wú)血緣關(guān)系的漢族健康人群靜脈血1 ml，加乙二胺四乙酸(EDTA)K2抗凝，充分混勻后放入-20℃冰箱冷藏室保存。其中男42例，女30例，年齡30～62歲。另從我院收住的老年靜脈血栓患者43例中抽取靜脈血1 ml，同上處理，其中男22例，女21例，年齡50～74歲。

1.2主要儀器及試劑PCR儀，pros型，德國(guó)Eppendorf公司;凝膠成像分析系統(tǒng)，Gel Doc XR型，美國(guó)伯樂(lè)BIO-RAD公司；小型臺(tái)式離心機(jī)Sigma1-14型，德國(guó)Sigma公司；血液基因組提取試劑盒(DP318)，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，TaKaRa TaqTMHS Perfect Mix及HindⅢ內(nèi)切酶均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3DNA的提取取冷藏保存的抗凝全血200 μl于1.5 ml離心管中，加入20 μl Proteinase K溶液，混勻，然后按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，最后將DNA溶液收集到離心管中備用。

1.4PCR擴(kuò)增參照文獻(xiàn)〔3〕設(shè)計(jì)合成引物:上游引物5'- GCACAGACGGCTGTTCTCTT-3';下游引物:5'-ATAGCACTGGGAGCATTGAAGC-3'，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μl，其中DNA模板1 μl，2× mix 12.5 μl，上游引物0.5 μl，primer下游引物0.5 μl，補(bǔ)充ddH2O至25 μl。PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性1 min，95℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共33個(gè)循環(huán)，最后72℃ 延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并置凝膠成像儀上觀察特異性條帶，正常PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為506 bp，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5PCR-RFLP分析取上述成功擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物10 μl，10倍 Buffer:2 μl，Hind Ⅲ 限制性核酸內(nèi)切酶1 μl，反應(yīng)總體積20 μl，37℃酶切1 h后終止。用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并于凝膠成像儀下觀察酶切結(jié)果。

2結(jié)果

正常情況下的506 bp的PCR擴(kuò)增片段中存在1個(gè)Hind Ⅲ限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，可將該片段切成407、99 bp兩個(gè)片段(野生型)。若凝血酶原G20210A基因發(fā)生G→A突變，則出現(xiàn)一個(gè)新的Hind Ⅲ限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，其中407 bp片段又被切成384、23 bp兩個(gè)片段:故若為突變純合子，則出現(xiàn)384、99、23 bp三條電泳條帶:若為突變雜合子，則出現(xiàn)407、384、99、23 bp四條電泳條帶。本實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示:這72例漢族健康人群中凝血酶原G20210A基因均無(wú)該突變類型。結(jié)果表明該群漢族健康人無(wú)明顯的差異，凝血酶原G20210A基因突變的發(fā)生率均為0。同樣對(duì)血栓病患者的PCR產(chǎn)物以及經(jīng)Hind Ⅲ限制性核酸內(nèi)切酶酶切后的電泳圖表明這43例老年血栓病人群也無(wú)明顯的差異，凝血酶原G20210A基因突變的發(fā)生率也為0。部分樣本電泳結(jié)果。見(jiàn)圖1。

1～5:漢族健康人PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物;6～10為老年血栓病人PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；11～15為健康人PCR酶切產(chǎn)物，16～20為老年血栓病人PCR酶切產(chǎn)物；M為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker圖1　PCR產(chǎn)物及經(jīng)Hind Ⅲ 限制性核酸內(nèi)切酶酶切凝膠電泳

3討論

凝血酶原基因G20210A突變是遺傳性易栓癥領(lǐng)域在分子生物學(xué)研究中的一個(gè)重大發(fā)現(xiàn)〔4〕。Poort等〔2〕認(rèn)為G20210A等位基因突變可使靜脈血栓形成的危險(xiǎn)性增加約3倍。Makris等〔5〕發(fā)現(xiàn)，凝血酶原G20210A等位基因在正常個(gè)體中的流行性僅0.66%，而有靜脈血栓形成史者凝血酶原基因G20210A突變的發(fā)生率為7.9%。目前不同研究者得出G20210A基因突變發(fā)生率結(jié)果不同，可能因選擇的研究人群不同所致。Zalavras等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)G20210A突變使下肢DVT形成的風(fēng)險(xiǎn)性增加了2.7倍。Arruda等〔7〕研究結(jié)果認(rèn)為凝血酶原基因G20210A突變可增加年輕女性心肌梗死發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)。

但凝血酶原基因G20210A突變是歐洲人群血栓性疾病的重要致病因素，國(guó)內(nèi)研究結(jié)果未能證實(shí)這種相關(guān)性〔8〕。郭辰紅等〔9〕關(guān)于凝血酶原基因G20210A突變與下肢DVT形成相關(guān)性研究中，發(fā)現(xiàn)86 例下肢DVT形成患者和100 例健康者中均未發(fā)現(xiàn)凝血酶原基因G20210A突變，該基因突變可能不是中國(guó)漢族人群下肢DVT的主要危險(xiǎn)因子。本研究提示凝血酶原基因G20210A 突變可能與中國(guó)人VTE 發(fā)生關(guān)系不大，但由于該研究在中國(guó)的研究報(bào)道較少，這項(xiàng)研究的樣本量不夠大，因此還有待于進(jìn)一步研究。血栓性疾病的形成與遺傳性、后天獲得性因素及環(huán)境密切相關(guān)〔10〕，因此，研究中國(guó)不同地區(qū)、不同民族群體中G20210A突變的存在情況，對(duì)于從分子水平闡明VTE發(fā)生的致病機(jī)制具有一定現(xiàn)實(shí)意義。

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〔2014-11-22修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：梁迪(1979-)，男，博士，講師，主要從事藥物合成研究。

中圖分類號(hào)〔〕R543.6〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)21-6074-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.030