粒細(xì)胞集落刺激因子對阿爾茨海默病大鼠腦內(nèi)炎癥的影響

李　健　米永杰　石　釗　聶　政

(成都醫(yī)學(xué)院解剖組胚教研室，四川　成都　610500)

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粒細(xì)胞集落刺激因子對阿爾茨海默病大鼠腦內(nèi)炎癥的影響

李健米永杰石釗聶政

(成都醫(yī)學(xué)院解剖組胚教研室，四川成都610500)

摘要〔〕目的探討粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)治療阿爾茨海默病(AD)大鼠對腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的影響。方法54只Wistar雄性大鼠(3～4個(gè)月齡)，隨機(jī)選取18只作為正常組、36只制作AD大鼠模型成功后采用隨機(jī)數(shù)字表法各選取18只分別作為治療組、模型組；模型組和正常組采用HE染色法對大腦皮層組織進(jìn)行觀察，治療組給予G-GCS(0.3 ml·kg-1·d-1)，模型組和正常組分別給予等量磷酸鹽緩沖液(PBS)注射，又分別于第7、14、21天進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測并進(jìn)行組間比較。結(jié)果正常組治療第7、14、21天的大腦皮層細(xì)胞IL-1β染色光密度值均顯著低于模型組、治療組(P<0.05)，治療組治療14、21 d后大腦皮層細(xì)胞IL-1β染色光密度值低于模型組(P<0.05)。 正常組治療第7、14、21天的大腦皮層細(xì)胞TNF-α染色光密度值均顯著低于模型組、治療組(P<0.05)，治療組治療14、21 d后大腦皮層細(xì)胞TNF-α染色光密度值低于模型組(P<0.05)。 結(jié)論AD大鼠對腦內(nèi)炎癥反應(yīng)作用顯著增強(qiáng)，G-CSF可以有效降低AD大鼠的炎癥反應(yīng)作用，對大鼠大腦皮層細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞〔〕粒細(xì)胞集落刺激因子；阿爾茨海默病；炎癥反應(yīng)

第一作者：李健(1978-)，女，碩士，副教授，主要從事神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變研究。

阿爾茨海默病(AD)主要病理改變?yōu)榇竽X彌散性萎縮和神經(jīng)細(xì)胞變性，并且以記憶障礙、失言、失認(rèn)、執(zhí)行功能障礙和行為改變等全面性癡呆為主要臨床特征〔1，2〕，該病發(fā)病緩慢且呈進(jìn)行性發(fā)展〔3〕。目前臨床上對該病的治療包括控制伴發(fā)的精神病理癥狀和改善患者認(rèn)知功能，但其治療效果差強(qiáng)人意〔4〕。研究表明神經(jīng)炎癥在AD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，而近年來研究發(fā)現(xiàn)粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)具有神經(jīng)保護(hù)作用〔5〕。本文探討G-CSF對AD大鼠腦內(nèi)炎癥的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物54只Wistar雄性大鼠(3～4個(gè)月齡)，體重250～300 g，平均(273±10.4)g，均喂養(yǎng)于(23～25)℃、濕度40%～60%、光照12 h的環(huán)境中，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.2動物模型制作方法隨機(jī)選取18只作為正常組，36只制作AD大鼠模型成功后編號采用隨機(jī)數(shù)字表法各選取18只分別作為治療組、模型組；不對正常組實(shí)施任何手術(shù)措施，用 10%水合氯醛腹腔注射治療組和模型組大鼠，待大鼠麻醉后將其頭部固定在立體定向儀上，對手術(shù)區(qū)進(jìn)行常規(guī)消毒，從頭背中部實(shí)施縱向切口手術(shù)，暴露出顱骨，采取顱鉆鉆開手術(shù)區(qū)顱骨。手術(shù)分兩步：第一步刀尖按前后(AP):1.8 mm、外側(cè)(L):2.5 mm、腹側(cè)(V):5.5 mm的坐標(biāo)插入后，以3 mm的幅度上下抽動刀片10次。接著把刀尖上升1 mm 后，內(nèi)進(jìn)1 mm，以3 mm的幅度上下抽動刀片10次，確保穹窿海馬傘(FF)被完全橫斷。最后上提刀片確定無出血的情況下用骨蠟封閉創(chuàng)口，并在切口處撒少許青霉素粉劑進(jìn)行抗炎，縫合皮膚。所有進(jìn)行手術(shù)的大鼠于術(shù)后第14天開始行Morris 水迷宮定位航行訓(xùn)練，連續(xù)記錄5 d大鼠的逃避潛伏期成績，取平均數(shù)，若治療組和模型組的大鼠成績明顯高于正常組，則證明建模成功。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器與藥品醫(yī)學(xué)超凈工作臺購自蘇州長留凈化科技有限公司、大鼠腦立體定位儀購自上海益聯(lián)科教設(shè)備有限公司、OLYMPUS 照相顯微鏡購自日本 SONY 公司、RM2245 石蠟切片機(jī)、HI1210 組織烘片機(jī)、HI1220 組織攤片機(jī)、EG1150H 組織包埋機(jī)購自上海徠卡儀器有限公司，Morris 水迷宮箱(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院)、0.9%生理鹽水、10%水合氯醛、手術(shù)器械等。

1.4實(shí)驗(yàn)方法正常組及模型組腹腔注射0.3 ml·kg-1·d-1磷酸鹽緩沖液(PBS)，治療組腹腔注射 0.3 ml·kg-1·d-1的G-CSF，均連續(xù)注射7 d。

1.5大腦皮層組織的HE染色于最后1次給藥結(jié)束后灌注取腦：用10%水合氯醛將大鼠麻醉后仰臥固定，暴露出心臟，將輸液針刺入大鼠的左心室，剪開右心耳后用250 ml預(yù)熱過的0.9%生理鹽水灌注，接著換成200 ml pH7.4的4%多聚甲醛灌注，待大鼠四肢抽搐僵硬時(shí)開顱取腦，并用上述灌注液固24 h。24 h過后使用常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋。制備成厚度為4 μm的連續(xù)石蠟切片，最后行 HE染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察各組皮層的病理形態(tài)學(xué)變化并拍照。

1.6免疫熒光檢測方法將制作完好的石蠟切片脫蠟、水化；制備新鮮的pH7.4的PBS緩沖液沖洗切片，進(jìn)行抗原修復(fù)；取出切片后逐張滴加 50 μl的過氧化酶阻斷液室溫孵育20 min后用PBS 反復(fù)沖洗3 遍，每次沖洗5 min；除去多余的 PBS 液后每張切片滴加50 μl的正常非免疫動物血清室溫孵育20 min后將正常非免疫動物血清洗凈，每張切片滴加 50 μl的一抗〔白細(xì)胞介素(IL)-1β 和腫瘤壞死因子(TNF)-α的一抗〕，于4℃孵育過夜。第2天用新鮮配制的PBS 沖洗3次，每次沖洗5 min。除去多余的 PBS 液后每張切片滴加50 μl的一抗，室溫下孵育40 min。孵育結(jié)束后使用PBS 沖洗3次，每次沖洗5 min。除去多余的 PBS液每張切片滴加50 μl的鏈霉素抗生物素-過氧化物酶液，室溫下孵育40 min。PBS 沖洗后用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色具體顯色步驟如下：洗凈PBS液后再切片上滴加適量的DAB溶液，在光學(xué)顯微鏡下持續(xù)觀察，直至觀察到滿意的染色程度。

1.7免疫圖像分析分別于治療后第7、14、21天處死各組6只大鼠，每只小鼠切去6張冠狀面切片，每一張切片在預(yù)定區(qū)域內(nèi)拍攝200張照片，采用隨機(jī)的方法取其方形區(qū)域內(nèi)的陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，拍片腦區(qū)為大鼠大腦皮層，采用IPP5.1醫(yī)學(xué)圖像分析軟件系統(tǒng)分析其熒光光密度值(IOD)。

2結(jié)果

2.1正常組、模型組大腦皮層組織HE染色觀察正常組大腦皮層組織HE染色結(jié)果，可見解剖結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)正常、細(xì)胞分布均勻、神經(jīng)元細(xì)胞體呈圓形或錐形，細(xì)胞的輪廓清楚，細(xì)胞排列緊密、有序、細(xì)胞核淡染，核仁明顯。模型組腦皮層組織可見大量散在的固縮凋亡細(xì)胞，細(xì)胞體積縮小、胞質(zhì)濃縮、細(xì)胞核變小。見圖1。

2.23組大腦皮層組織免疫熒光染色I(xiàn)L-1β染色結(jié)果正常組治療第7、14、21天的大腦皮層細(xì)胞IL-1β染色光密度值均顯著低于模型組、治療組(P<0.05)，治療組治療14 d、21 d后大腦皮層細(xì)胞IL-1β染色光密度值低于模型組(P<0.05)。見表1和圖2。

正常組

模型組

圖1正常組和模型組腦皮層組織HE染色(×400)

±s,IOD，n=18)

組別治療7d治療14d治療21d正常組38.29±8.6739.28±10.2439.12±11.46模型組93.26±17.851)146.28±21.941)86.75±14.271)治療組89.57±15.971)65.25±12.051)2)53.29±13.071)2)

與正常組比較：1)P<0.05，與模型組比較：2)P<0.05；下表同

圖2　各組大腦皮層組織IL-1β免疫熒光染色(標(biāo)尺50 μm)

2.33組大腦皮層組織免疫熒光染色TNF-α染色結(jié)果正常組治療第7、14、21天的大腦皮層細(xì)胞TNF-α染色光密度值均顯著低于模型組、治療組(P<0.05)，治療組治療14、21 d后大腦皮層細(xì)胞TNF-α染色光密度值低于模型組(P<0.05)。見表2和圖3。

表23組大腦皮層組織免疫熒光檢測

±s,IOD,n=18)

組別治療7d治療14d治療21d正常組58.14±12.0656.17±11.3055.02±12.29模型組99.17±18.281)115.74±23.951)113.06±27.081)治療組95.02±17.141)84.02±14.271)2)62.95±15.221)2)

圖3　3組大腦皮層組織TNF-α免疫熒光染色(標(biāo)尺50 μm)

3討論

流行病學(xué)研究顯示，在發(fā)達(dá)國家，AD是繼心臟病、腫瘤和腦卒中后的第四大致死性疾病，而研究數(shù)據(jù)表明在我國約有500萬人群患有AD〔6，7〕。目前臨床上對AD的治療以藥物治療為主，具體包括以下幾個(gè)方面：①改善膽堿能系統(tǒng)的藥物：AD患者的腦組織內(nèi)尤其是額葉皮質(zhì)和海馬的膽堿能系統(tǒng)受到損害，導(dǎo)致乙酰膽堿水平降低，此類藥物主要包括乙酰膽堿前體藥物(鹽酸乙酰L-肉堿)，膽堿酯酶抑制劑(他克林、多奈哌齊、加蘭他敏)，乙酰膽堿M1受體激動劑(沙利定、占諾美林等)，②谷氨酸受體拮抗劑：興奮谷氨酸能神經(jīng)系統(tǒng)可以引起神經(jīng)元興奮性中毒，因此，拮抗谷氨酸受體可以保護(hù)神經(jīng)元。具體包括N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑和美金剛等；③抗β淀粉樣蛋白(Aβ)治療：Aβ積聚是導(dǎo)致AD病變的始動原因和中心環(huán)節(jié)，而Aβ是β淀粉樣前體蛋白經(jīng)過三種不同的分泌酶(α、β、γ)水解而來，因此這三種酶的抑制劑可以成為治療AD的靶點(diǎn)。④抑制tau蛋白磷酸化藥物：利用GSK3β反義核苷酸阻斷Aβ誘導(dǎo)的tau蛋白磷酸化可能延緩AD的進(jìn)展；⑤抗炎藥物：炎性反應(yīng)參與了AD的病理改變，應(yīng)用抗炎藥物能夠抑制Aβ沉積和老年斑形成，具體包括吲哚美辛、阿司匹林等非甾體類抗炎藥；⑥神經(jīng)營養(yǎng)及生長因子：神經(jīng)營養(yǎng)因子可以維持神經(jīng)系統(tǒng)的功能和促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，常應(yīng)用神經(jīng)生長因子；⑦激素類藥物：褪黑激素可以通過提高谷胱甘肽還原酶的活性而清除自由基，可以抑制tau蛋白的磷酸化，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和Aβ聚集〔8〕。此外，抗氧化劑、鈣離子拮抗劑和腦代謝改善藥都被應(yīng)用于AD的治療〔9〕。

G-CSF是一種由207個(gè)氨基酸組成的低分子糖蛋白，通過特異性地與G-CSF受體(G-CSFR)結(jié)合而調(diào)節(jié)粒細(xì)胞生長因子，由于其具有促進(jìn)粒細(xì)胞和造血干細(xì)胞增殖分化的作用而被用于粒細(xì)胞減少癥的治療〔10〕。G-CSF在神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中表達(dá)較多，在抗細(xì)胞凋亡和抗炎方面具有較強(qiáng)的作用。研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF可以通過以下幾個(gè)方面來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能：①提高腦缺血壞死區(qū)細(xì)胞的存活率和減少壞死區(qū)面積；②分泌神經(jīng)因子和促進(jìn)血管、神經(jīng)生成來促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)；③通過對多條抗細(xì)胞凋亡途經(jīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)而增加神經(jīng)元細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的存活率；此外，G-CSF 還能減少IL-6、IL-8和TNF-α的釋放而減輕炎性反應(yīng)〔11,12〕。本項(xiàng)研究表明G-CSF能夠通過抑制IL-1β和TNF-α的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用，對AD大鼠大腦皮層神經(jīng)元具有保護(hù)作用。這可能是由于G-CSF具有減輕小膠質(zhì)細(xì)胞和Aβ沉積所致神經(jīng)炎癥的功能，此外，G-CSF還可以抑制炎癥因子進(jìn)入腦內(nèi)造成神經(jīng)炎癥，從而發(fā)揮保護(hù)腦組織的功能。

參考文獻(xiàn)4

1Schneider LS.Alzheimer disease pharmacologic treatment and treatment research〔J〕.Contin Lifelong Learning Neurol,2013;19(2):339-57.

2De Wolf C.Alzheimer disease in 2020〔J〕.Cryonics,2013;12(19):245-57.

3Goldman JS.Alzheimer disease〔J〕.Genet Counsel Adult Neurogenet Dis,2015;17(2)：312-26.

4李 林.中國阿爾茨海默病研究進(jìn)展〔J〕.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2015;29(5):765-83.

5何曉英,付華,袁平.粒細(xì)胞集落刺激因子對腦出血大鼠的治療機(jī)制〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2014;34(9):2486-9.

6Tolboom N,Van Der Flier WM,Boverhoff J,etal.Molecular imaging in the diagnosis of Alzheimer's disease:visual assessment of〔11C〕 PIB and〔18F〕 FDDNP PET images〔J〕.J Neurol Neurosurg Psychiatry,2010;81(8):882-4.

7梁春榮，劉雨輝，王葉冉,等.阿爾茨海默病患者外周血炎癥因子水平與認(rèn)知功能的相關(guān)性研究〔J〕.解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2014;39(2):133-7.

8胡競揚(yáng),劉中霖,劉云云.阿爾茨海默病與抑郁關(guān)系的研究進(jìn)展〔J〕.中華腦科疾病與康復(fù)雜志(電子版),2015;5(2):40-3.

9吳佳瑩,羊紅玉,趙青威.抗阿爾茨海默病的新靶點(diǎn)及藥物研發(fā)進(jìn)展〔J〕.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2013;33(19)：1615-8.

10朱永翠,汪虹,陳斌,等.外用重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子提高微粒皮移植成活率的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2015;31(9):1407-10.

11關(guān)雪蓮,侯麗淳,畢勝,等.大鼠腦出血周邊組織腦水含量,細(xì)胞凋亡和Bax表達(dá)的變化及粒細(xì)胞集落刺激因子的影響〔J〕.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2015;32(4)：328-31.

12王樹英,秦偉,賈建平.阿爾茨海默病認(rèn)知損害的研究進(jìn)展〔J〕.中華老年醫(yī)學(xué)雜志,2014;33(6):682-4.

〔2014-11-07修回〕

(編輯苑云杰)

The effect of G-CSF on brain inflammation in rats with Alzheimer's disease

LI Jian,MI Yong-Jie, SHI Zhao,etal.

Department of Anatomy and Histoembryology,Chengdu Medical College,Chengdu 610500,Sichuan,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of granulocyte colony stimulating factor(G-CSF)on the inflammatory reaction in the brain of rats with Alzheimer's disease(AD).Methods60 Wistar male rats(3 to 4 months of age)were randomly selected as normal group(n=21),the remaining 39 were established AD rat model to as treatment group and model group(18 each group);the three AD rats and 3 normal rats were observed on cerebral tissue using HE staining,the treatment group was given G-GCS(0.3 ml·kg-1·d-1),control and normal group were given equal volume of PBS injection,the index were detected on the 7th,14th and 21st day.ResultsThe brain cortical cells of IL-1 beta staining optical density values in normal group in 7,14,21 d were significantly lower than those of model group,those of treatment group were lower than those in model group(P<0.05).TNF alpha staining color density values of normal group in 7,14,21 d were significantly lower than those of model group(P<0.05),those of treatment group were lower than those of model group(P<0.05).ConclusionsThe effect on the cerebral inflammatory reaction in AD rat is significantly enhanced,G-CSF can effectively reduce the inflammatory reaction of AD rats presenting protection on brain cortical cells.

【Key words】Granulocyte colony stimulating factor;Alzheimer disease;Inflammatory reaction

基金項(xiàng)目：四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(14ZA0231)；四川省發(fā)育再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專項(xiàng)基金(No.SYS10-006)

中圖分類號〔〕R392-3〔

文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-7027-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.027