健脾散結(jié)方對(duì)Lewis肺癌小鼠細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白及端粒酶活性的影響

譚國(guó)柱　王秀娟

(萊蕪市人民醫(yī)院腫瘤科，山東　萊蕪　271100)

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健脾散結(jié)方對(duì)Lewis肺癌小鼠細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白及端粒酶活性的影響

譚國(guó)柱王秀娟

(萊蕪市人民醫(yī)院腫瘤科，山東萊蕪271100)

摘要〔〕目的觀察健脾散結(jié)方對(duì)Lewis肺癌小鼠細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白及端粒酶活性的影響。方法選用C57BL/6小鼠接種Lewis肺癌細(xì)胞建立動(dòng)物模型，按實(shí)驗(yàn)分組分別干預(yù)21 d，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，采用SABC免疫組化法檢測(cè)Survivin、c-myc表達(dá)，PCR-ELISA法檢測(cè)端粒酶活性。結(jié)果健脾散結(jié)方組、順鉑組、聯(lián)合組的抑瘤率分別為42.36%、57.38%、69.71%；與模型組比較，各藥組均可降低Survivin 與c-myc 表達(dá)(P<0.05或P<0.01)，且聯(lián)合組最明顯，健脾散結(jié)方與順鉑有協(xié)同作用；各藥組端粒酶活性均低于模型組(P<0.05)，且健脾散結(jié)方組、順鉑組與聯(lián)合組比較均有顯著差異(P<0.05)。結(jié)論健脾散結(jié)方抑制腫瘤作用可能與下調(diào)Survivin、c-myc表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制端粒酶活性有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕健脾散結(jié)方；肺癌；細(xì)胞凋亡；端粒酶

第一作者：譚國(guó)柱(1965-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤研究。

肺癌在臨床惡性腫瘤中最為常見(jiàn)，其發(fā)病率與死亡率逐年上升，防治形勢(shì)十分嚴(yán)峻，中西醫(yī)結(jié)合治療是肺癌多學(xué)科治療的重要手段之一，辨證論治、遣方用藥無(wú)不體現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)〔1〕。健脾散結(jié)方是我科長(zhǎng)期臨床實(shí)踐總結(jié)出的有效方藥，從脾著手，培土生金，治療肺癌取得了較好療效。因此，本研究探討健脾散結(jié)方對(duì)Lewis 肺癌小鼠細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白及端粒酶活性的影響及其相關(guān)機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與瘤株C57BL/6小鼠60只，雄性，體重(200±20)g；Lewis 肺癌細(xì)胞株，均購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

1.2主要藥物試劑與儀器藥物：健脾散結(jié)方由黃芪，黨參，陳皮，半夏，莪術(shù)，全蝎，蜈蚣，白花蛇舌草組成，水煎制成湯劑，濃縮至生藥1 g/ml，4℃保存?zhèn)溆?；注射用順鉑(齊魯制藥有限公司)。試劑：SABC免疫組化試劑盒、Survivin、c-myc一抗、抗原修復(fù)液(均為武漢博士德生物有限公司)，端粒酶PCR-ELISA試劑盒(Roche公司)。儀器：高速冷凍離心機(jī)、微量高速離心機(jī)(上海醫(yī)學(xué)儀器廠)，多功能顯微鏡、石蠟包埋機(jī)、組織切片機(jī)、全封閉自動(dòng)脫水機(jī)(均為德國(guó)Leica 公司)，HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)(武漢同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)。

1.3動(dòng)物模型建立與分組將Lewis肺癌細(xì)胞株分別接種于10只C57BL/6小鼠右側(cè)腋下，待小鼠右腋部皮下瘤體隆起明顯時(shí)于無(wú)菌條件下取出瘤體，研磨，稀釋，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107/L，每只0.2 ml接種于50只C57BL/6小鼠右側(cè)腋窩皮下，復(fù)制Lewis 肺癌小鼠模型，造模成功后選取40只隨機(jī)分為模型組、健脾散結(jié)方組、順鉑組、聯(lián)合組(順鉑+健脾散結(jié)方)四組，每組10只；四組分別給予生理鹽水、健脾散結(jié)方制劑、順鉑稀釋液、健脾散結(jié)方制劑+順鉑稀釋液0.2 ml/次灌胃，2次/d，共干預(yù)21 d，末次用藥后24 h內(nèi)處死取材。

1.4腫瘤生長(zhǎng)情況各組小鼠處死后稱取小鼠體重，完整剝?nèi)∫浦擦鲶w稱取其重量，計(jì)算抑瘤率，抑瘤率計(jì)算公式：抑瘤率=(模型組平均瘤重-各治療組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%。

1.5免疫組化檢測(cè)Survivin、c-myc表達(dá)組織固定，常規(guī)切片、脫蠟至水化，3%H2O2滅活內(nèi)源性酶，熱修復(fù)抗原，5%BSA封閉液，一抗4℃過(guò)夜，二抗室溫20 min，SABC室溫20 min，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片；顯微鏡觀察，胞質(zhì)、胞核或胞膜為棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)分析。

1.6PCR-ELISA檢測(cè)端粒酶活性常規(guī)制備Lewis 肺癌小鼠細(xì)胞懸液，充分裂解，冰上孵育30 min，4℃離心20 min，取上清液；端粒酶擴(kuò)增，ELLSA，酶標(biāo)儀檢測(cè)，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書逐步進(jìn)行。端粒酶活性(RTA)=(AS1-AS0)/AS2/(TS1-TS0)/TS2〔2〕。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1腫瘤生長(zhǎng)情況經(jīng)實(shí)驗(yàn)干預(yù)，各藥組瘤重明顯低于模型組(P均<0.05)，其中聯(lián)合組最低，與健脾散結(jié)方組及順鉑組比較均有顯著差異(P<0.01)。聯(lián)合組抑瘤率最高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

組別瘤重(g)抑制率(%)模型組1.81±075-健脾散結(jié)方組1.16±0.641)3)42.363)順鉑組0.93±0.582)3)57.383)聯(lián)合組0.75±0.502)69.71

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與聯(lián)合組比較:3)P<0.05

圖1　各組Survivin、c-myc表達(dá)(DAB，×200)

2.2免疫組化檢測(cè)Survivin、c-myc表達(dá)各藥組Survivin表達(dá)均低于模型組(P均<0.05)，且健脾散結(jié)方組與順鉑組的表達(dá)均高于聯(lián)合組(P均<0.05)；各藥組c-myc表達(dá)均低于模型組(P<0.05)，聯(lián)合組低于健脾散結(jié)方組與順鉑組(P<0.05)。見(jiàn)表2，圖1。

組別Survivinc-myc模型組66.31±7.2459.73±9.82健脾散結(jié)方組56.34±5.491)4)51.64±7.601)4)順鉑組43.81±6.982)3)43.59±6.421)3)聯(lián)合組32.97±6.702)35.31±5.822)

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與聯(lián)合組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

2.3PCR-ELISA檢測(cè)端粒酶活性模型組、健脾散結(jié)方組、順鉑組及聯(lián)合組的端粒酶活性依次降低，分別為10.12±3.41、7.27±2.64、5.33±2.47、3.98±1.29。

3討論

中醫(yī)藥在肺癌治療中，具有提高生活質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期的特點(diǎn)，其作用機(jī)制主要有抗血管生成、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗多藥耐藥及抑制端粒酶活性等方面〔4〕。細(xì)胞凋亡功能異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔5〕。近年來(lái)，隨著認(rèn)識(shí)的深入發(fā)現(xiàn)與腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因、蛋白并不少，而Survivin、c-myc是其研究的熱點(diǎn)。Survivin屬凋亡抑制蛋白家族成員，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)凋亡抑制因子，不但可直接或間接地抑制凋亡終末效應(yīng)蛋白caspase的活化阻止細(xì)胞凋亡，還可與紡錘體纖維結(jié)合，保護(hù)細(xì)胞有絲分裂的完整性，抑制細(xì)胞的凋亡〔6〕。c-myc基因參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡的調(diào)控，c-myc蛋白表達(dá)升高使細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和凋亡發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子〔7〕。而端粒酶是一種能增加染色體末端5-TTAGGG-3 重復(fù)序列的核糖核蛋白酶復(fù)合物，其活性增高可引起細(xì)胞發(fā)生非正常凋亡，影響細(xì)胞壽命，與腫瘤細(xì)胞增殖平衡失調(diào)、凋亡密切相關(guān)〔8〕。

健脾散結(jié)方中黃芪、黨參具有健脾益氣之功，莪術(shù)、全蝎、蜈蚣具有散結(jié)消積之效，陳皮、半夏、白花蛇舌草可清熱解毒，方以黃芪為君，莪術(shù)為臣，余為佐藥，全方配伍精當(dāng)，共奏健脾散結(jié)之效。且方中八味藥物在現(xiàn)代藥理研究中也表現(xiàn)出不同程度的抗腫瘤作用，例如莪術(shù)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、影響腫瘤細(xì)胞分裂，具有廣譜的抗腫瘤活性〔9〕。結(jié)合肺癌患者臨床多見(jiàn)食欲差、厭食等脾胃癥狀，以及化療過(guò)程中的消化道反應(yīng)等也同樣印證了健脾以培土生金在肺癌治療中的重要作用。研究結(jié)果提示健脾散結(jié)方與順鉑聯(lián)合有協(xié)同作用。說(shuō)明健脾散結(jié)方可抑制凋亡蛋白Survivin、c-myc的表達(dá)，其可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖分化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加，端?？蛇M(jìn)行性縮短，縮短到一定程度則會(huì)失去分裂增殖能力〔10〕，提示端粒酶活性越強(qiáng)，抗凋亡作用越明顯，而健脾散結(jié)方可抑制端粒酶活性，從另一層面說(shuō)明其可通過(guò)影響端粒調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

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〔2014-09-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

通訊作者：王秀娟(1984-)，女，醫(yī)師，碩士，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療腫瘤的臨床與基礎(chǔ)研究。

中圖分類號(hào)〔〕R734〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)23-6660-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.008