PSGL-1缺失導(dǎo)致MDSCs上調(diào)

周澤啟，李江超，張瀟涵，韓　露，葉宇翔，王麗京

(廣東藥學(xué)院血管生物學(xué)研究所，廣州　510006)

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PSGL-1缺失導(dǎo)致MDSCs上調(diào)

周澤啟，李江超，張瀟涵，韓露，葉宇翔，王麗京

(廣東藥學(xué)院血管生物學(xué)研究所，廣州510006)

【摘要】目的P-選凝素糖蛋白配體1(P-selectin glycoprotein ligand 1, PSGL-1)主要特異性表達(dá)在白細(xì)胞上，我們的研究PSGL-1缺失在小鼠體內(nèi)脾臟、骨髓中MDSCs的變化。方法利用我們實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的PSGL-1-/-小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)鑒定后，PSGL-1-/-后代小鼠；利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)C57和PSGL-1-/-小鼠脾臟、骨髓中Gr-1和CD11b陽(yáng)性細(xì)胞的變化。結(jié)果與對(duì)照組C57小鼠相比，PSGL-1-/-基因工程小鼠MDSCs在脾臟、骨髓中顯著上調(diào)(P<0.001)，結(jié)論P(yáng)SGL-1的缺失導(dǎo)致小鼠脾臟、骨髓中MDSCs升高。

【關(guān)鍵詞】PSGL-1；MDSCs；基因工程小鼠

P-選凝素糖蛋白配體1 (P-selectin glycoprotein ligand 1, PSGL-1)是90年代發(fā)現(xiàn)其為同源二聚體的一種跨膜的糖蛋白，表達(dá)于白細(xì)胞的膜表面[1，2]。在炎癥環(huán)境中，PSGL-1與P-選凝素的相互作用，促進(jìn)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和滾動(dòng)，在粘附的起始階段發(fā)揮著重要作用[3，4]。

在現(xiàn)有的報(bào)道中有人認(rèn)為炎癥是能激發(fā)先天免疫和組織修復(fù)和再生，但是大多數(shù)人認(rèn)為炎癥是促進(jìn)機(jī)體逐步走向衰老、病態(tài)的一個(gè)誘因[5，6]。PSGL-1介導(dǎo)白細(xì)胞粘附的同時(shí)，還作為信號(hào)分子轉(zhuǎn)導(dǎo)胞外信號(hào)，促進(jìn)白細(xì)胞活化，具有重要的生理意義[7，8]。最近在研究表明，PSGL-1在血小板與中性粒細(xì)胞結(jié)合中起到非常重要作用，當(dāng)中性粒細(xì)胞無(wú)法結(jié)合血小板時(shí)，它們不能正常遷移，炎癥會(huì)減少[9，10]。在PSGL-1介導(dǎo)的粘附過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PSGL-1敲除使其粘附血小板的能力降低，且白細(xì)胞向炎癥部位的爬行變慢。

腫瘤免疫作為一個(gè)新型的腫瘤研究方向，其作用方式和免疫應(yīng)答相當(dāng)復(fù)雜，涉及一系列的免疫分子及其之間的相互作用。髓系抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)作為一種免疫細(xì)胞在腫瘤逃逸中越來(lái)越引起關(guān)注，MDSCs主要參與腫瘤免疫逃逸、免疫抑制進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。MDSCs借助外源物質(zhì)和腫瘤自身的特性進(jìn)而幫助腫瘤實(shí)現(xiàn)逃逸功能。MDSCs主要是一群異質(zhì)性細(xì)胞和粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等的前體，在小鼠體內(nèi)MDSCs即為CD11b+/Gr-1+雙陽(yáng)性細(xì)胞，但是目前國(guó)際上對(duì)于人的MDSCs細(xì)胞還沒(méi)有明確的劃分，HLA-DR-CD14-CD33+CD11b被大多數(shù)人認(rèn)可[11]。在本研究中采取的動(dòng)物模型為，PSGL-1缺失的轉(zhuǎn)基因小鼠，其對(duì)照鼠采用其背景鼠C57。首先需要采取基因鑒定的方法鑒定其基因類型，在分別利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其脾臟和骨髓中MDSCs的變化，在我們的實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)其脾臟和骨髓中MDSCs顯著升高。

1材料和方法

1.1材料

PSGL-1-/-小鼠(B6.Cg-Selplgtm1Fur/J)均購(gòu)買自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室，SPF環(huán)境中飼養(yǎng)擴(kuò)群。C57BL/6小鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2008-0002。使用許可證號(hào)，SYXK(粵)2012-0125，PCR引物由Invitrogen公司合成，引物Mix購(gòu)自thermo。Flowjo 進(jìn)行流式分析。

1.2方法

1.2.1小鼠飼養(yǎng)和鑒定：所有小鼠均于SPF級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)，現(xiàn)將購(gòu)買的PSGL-1-/-小鼠與C57進(jìn)行雜交，得到后代中鑒定其基因型，將PSGL-1+/-雄鼠和PSGL-1+/-雌鼠雜交，得到的子代有三種情況PSGL-1+/-、PSGL-1+/+、PSGL-1-/-，經(jīng)鑒定后得到實(shí)驗(yàn)鼠PSGL-1-/-小鼠和對(duì)照鼠PSGL-1+/+。PSGL-1小鼠鑒定引物序列為：P1：5′-AGCTTC CTTGTGCTG CTGAC-3′，P2：5′-TCAAAATCGTCATCCCCAAC-3′，P3：5-′CCTTCTATCGCCTTCTTGACG-3′。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃ /30 s、65℃ /1 min、72℃/1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min。P1和P2是鑒定野生型條帶，擴(kuò)增條帶為140 bp，P2和P3是鑒定突變型條帶，擴(kuò)增條帶為500 bp，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR結(jié)果，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。

1.2.2脾臟MDSCs細(xì)胞檢測(cè)：取8周的PSGL-1-/-、PSGL-1+/+小鼠各6只，眼眶取血，去脾臟用PBS在尼龍篩網(wǎng)上進(jìn)行研磨，取研磨下層的細(xì)胞液，用紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解15 min，離心，進(jìn)行計(jì)數(shù)，取大約1×106個(gè)細(xì)胞數(shù)，350 r/min，5 min;棄上清液，用紙吸干管口液體，1 mL 0.5% BSA重懸細(xì)胞液，離心，350 r/min，5 min，加入工作液,，避光孵育30 min，棄上清液，洗1～2次，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3骨髓MDSCs細(xì)胞檢測(cè)： 對(duì)上述分組小鼠，取完脾臟后將后腿剪下，抽取骨髓，同上述步驟檢測(cè)。

2結(jié)果

2.1 PSGL-1缺失小鼠脾臟中MDSCs上調(diào)

脾臟是人和脊椎動(dòng)物最大的淋巴器官，同時(shí)也是機(jī)體最大的免疫器官。取C57小鼠和PSGL-1-/-小鼠的脾臟進(jìn)行單細(xì)胞懸液的制備，而后用流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)標(biāo)記Gr-1和CD11b兩種抗體，檢測(cè)結(jié)果顯示在PSGL-1缺失小鼠中兩者雙陽(yáng)性細(xì)胞即MDSCs細(xì)胞急劇上升，與正常小鼠對(duì)比，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖1，差異明顯(P<0.001)。

圖1　PSGL-1缺失小鼠脾臟中MDSCs上調(diào)Fig.1　MDSCs are upregulated in the spleen of the PSGL-1-/- mice

2.2 PSGL-1缺失小鼠骨髓中MDSCs上調(diào)

骨髓不但是造血器官，它還是重要的免疫器官。在上述脾臟中我們看到MDSCs急劇上升，但是在白細(xì)胞大量來(lái)源地的骨髓是否也有同樣結(jié)果，我們不得而知，所以接下來(lái)我們進(jìn)行骨髓方面的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同脾臟一樣，MDSCs也是急劇上升，差異明顯(P<0.001)。具體結(jié)果見圖2。

圖2　PSGL-1缺失小鼠骨髓中MDSCs上調(diào)Fig.2　MDSCs are upregulated in the bone marrow of the PSGL-1-/- mice

3討論

在炎癥環(huán)境中，白細(xì)胞的滾動(dòng)粘附起著重要作用，今年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)的PSGL-1與其配體P-selectin在粘附的起始階段發(fā)揮著重要作用[12]。其主要作用是由PSGL-1介導(dǎo)的信號(hào)級(jí)連反應(yīng)來(lái)完成具有重要的生理意義。PSGL-1有三個(gè)與其對(duì)應(yīng)的選凝素，其中造血祖細(xì)胞向骨髓的歸巢以及細(xì)胞的分化是由E-selectin介導(dǎo)完成[13]。研究還發(fā)現(xiàn)PSGL-1能參與趨化因子的趨化反應(yīng)，如PSGL-1與CCL19(chemokine (C-C motif) ligand 19)和CCL21(chemokine (C-C motif) ligand 21)結(jié)合，并支持其趨化反應(yīng)。也有文獻(xiàn)報(bào)道PSGL-1和多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病機(jī)理有關(guān)系[14-15]。提示PSGL-1可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。上述研究表明，PSGL-1在炎癥反應(yīng)中和血液腫瘤中發(fā)揮重要作用。

在不同器官，不同組織中，和不同病理?xiàng)l件下(炎癥，腫瘤等環(huán)境)，MDSCs的表達(dá)會(huì)有所差異。受細(xì)胞因子的作用，這些髓系來(lái)源的前體細(xì)胞成熟受阻，因而停留在各個(gè)分化階段，成為具有免疫抑制功能的MDSCs。當(dāng)在病理?xiàng)l件下，特別是腫瘤情況下，通過(guò)自分泌或旁分泌細(xì)胞因子，進(jìn)而抑制T細(xì)胞正常功能，影響機(jī)體免疫。有研究報(bào)道靶向MDSCs的藥物研究能有效抑制黑色素瘤患者的病理進(jìn)程，且患者兩年生存率良好。所以在此基礎(chǔ)上我們的研究才顯得意義重大。通過(guò)我們的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)在PSGL-1缺失小鼠中Gr-1和CD11b雙陽(yáng)性細(xì)胞急劇上升，且統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.001),提示我們PSGL-1對(duì)機(jī)體免疫防護(hù)有著重要指示作用。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于揭示PSGL-1在免疫中MDSCs升高，且差異顯著。最新研究表明PSGL-1介導(dǎo)中性粒細(xì)胞引起的血小板黏附，阻斷PSGL-1時(shí)炎癥加劇，我們和其他研究者的結(jié)果揭示PSGL-1在人體機(jī)體免疫中發(fā)揮重要作用。

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〔修回日期〕2014-05-04

2015年《中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)》《中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志》組織專題計(jì)劃

2015年《中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)》《中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志》將計(jì)劃由以下編委組織7期高水平專題：(1)顧為望教授：小型豬在生物醫(yī)藥研究中的應(yīng)用(已完成)；(2)范慧敏教授：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肺移植模型的建立及相關(guān)研究(已完成)；(3)范永升教授：中醫(yī)藥研究與“病癥”結(jié)合動(dòng)物模型(雜志截稿日期：2015年2月28日)；(4)高誠(chéng)教授：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)、標(biāo)識(shí)標(biāo)記、模型和評(píng)價(jià)(學(xué)報(bào)截稿日期：2015年5月31日)；(5)王強(qiáng)教授：斑馬魚在發(fā)育生物學(xué)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中的應(yīng)用(學(xué)報(bào)截稿日期：2015年7月31日)；(6)代解杰教授：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新資源標(biāo)準(zhǔn)化研究及疾病動(dòng)物模型的創(chuàng)建(雜志截稿日期：2015年8月31日)；(7)肖杭教授：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在藥理毒理方面的應(yīng)用研究(雜志截稿日期：2015年9月30日)。

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《中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)》《中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志》編輯部

研究報(bào)告

MDSCs are upregulated in PSGL-1-deficient mice

ZHOU Ze-qi，LI Jiang-chao，ZHANG Xiao-han, HAN Lu，YE Yu-xiang，WANG Li-jing

(Vascular Biology Center, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China)

【Abstract】Objective PSGL-1 is specifically expressed in leucocytes. The aim of this study was to explore the changes of myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) in the spleen and bone marrow in PSGL-1-deficient mice. Methods PSGL-1-/-mice were used in the experiment. After identification of the offsprings, flow cytometry was used to test the expression of CD11b and Gr-1 in C57 and PSGL-1-/-mice. ResultsCompared with the C57 mice, the expression of MDSCs was up-regulated in the PSGL-1-deficient mice (P<0.001). Conclusion The expression of MDSCs is upregulated in PSGl-1-deficient mice.

【Key words】P-selectin glycoprotein ligand 1, PSGL-1; Myeloid-derived suppressor cells, MDSCs; Spleen; Bone marrow; Transgenic mice; PSGL-1-deficient mice

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.006.009

【中圖分類號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2015) 06-0042-04

[通訊作者]王麗京，女，教授，E-mail： wanglijing62@163.com。

[作者簡(jiǎn)介]周澤啟，男，碩士，E-mail： zhouzeqi199131@163.com。

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(44164007;81472336)和 廣東省醫(yī)學(xué)科研基金，項(xiàng)目號(hào)： A2013312。