單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的研究與應(yīng)用進(jìn)展

韓悅河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的研究與應(yīng)用進(jìn)展

韓悅
河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

傳統(tǒng)的測(cè)序方法是對(duì)細(xì)胞群體的總平均反應(yīng)進(jìn)行分析，而細(xì)胞間存在異質(zhì)性。單細(xì)胞測(cè)序是在單個(gè)細(xì)胞水平上進(jìn)行的高通量測(cè)序技術(shù)，可準(zhǔn)確測(cè)出單個(gè)細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)狀態(tài)，分析同一表型細(xì)胞間的遺傳異質(zhì)性，在癌癥、微生物學(xué)等領(lǐng)域有舉足輕重的地位。本文對(duì)單細(xì)胞測(cè)序主要流程及該技術(shù)在不同領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行闡述，為這一技術(shù)的研究與發(fā)展提供參考。

單細(xì)胞分離；基因組擴(kuò)增；應(yīng)用

隨著科技水平的發(fā)展，DNA測(cè)序技術(shù)經(jīng)歷了巨大的革命。從20世紀(jì)70年代中期以Sanger為代表發(fā)明的第一代測(cè)序技術(shù)--雙脫氧鏈終止法，到2005年后涌現(xiàn)出以454、Solexa、SOLiD為第二代標(biāo)志的高通量測(cè)序技術(shù)，再到第三代的單分子測(cè)序技術(shù)，DNA測(cè)序技術(shù)在成本、讀長(zhǎng)和通量三方面都發(fā)生很大的變化。其中應(yīng)用最廣泛的當(dāng)屬高通量測(cè)序技術(shù)，但這種測(cè)序手段也存在一些問(wèn)題：傳統(tǒng)的測(cè)序方法是對(duì)細(xì)胞群體的總平均反應(yīng)進(jìn)行分析，而細(xì)胞間存在異質(zhì)性，由此單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

單細(xì)胞測(cè)序是在單個(gè)細(xì)胞水平上進(jìn)行的高通量測(cè)序技術(shù)，可準(zhǔn)確測(cè)出單個(gè)細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)狀態(tài)，分析同一表型細(xì)胞間的遺傳異質(zhì)性，在癌癥、微生物學(xué)等領(lǐng)域有舉足輕重的地位[1]。單細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)操作步驟主要包括四步：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞的分離、細(xì)胞溶解與基因組的提取、基因組或轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增，基因組測(cè)序。其中單細(xì)胞的分離與基因組或轉(zhuǎn)錄組的擴(kuò)增技術(shù)還有待提高，這對(duì)單細(xì)胞測(cè)序的發(fā)展既是機(jī)遇也是挑戰(zhàn)。本文對(duì)單細(xì)胞測(cè)序主要流程及該技術(shù)在不同領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行闡述，為這一技術(shù)的研究與發(fā)展提供參考。

1.單細(xì)胞的分離

獲取分離的單個(gè)細(xì)胞是進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序研究的第一步，也是單細(xì)胞測(cè)序與傳統(tǒng)高通量測(cè)序技術(shù)的最大區(qū)別。目前可采用的分離方法有有限稀釋法、顯微操作法、熒光激活細(xì)胞分選法（FACS）、和微流控技術(shù)等。

有限稀釋法是將獲取的細(xì)胞系按比例稀釋配制成不同濃度的細(xì)胞懸液，然后將其接種于多孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)，以獲得單個(gè)細(xì)胞。該方法操作簡(jiǎn)便，成本低，適用于研究可培養(yǎng)的樣本；但操作費(fèi)時(shí)，不能進(jìn)行大規(guī)模的細(xì)胞分離，分離過(guò)程常出現(xiàn)細(xì)胞丟失或分離錯(cuò)誤等現(xiàn)象。顯微操作法需要在倒置顯微鏡下借助機(jī)械顯微操作儀進(jìn)行精細(xì)操作，優(yōu)點(diǎn)在于成本低廉，分離過(guò)程可視化且容易操作；缺點(diǎn)在于細(xì)胞機(jī)械性損傷，適于低通量的細(xì)胞操作。

熒光激活細(xì)胞分選法是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞分離方法。該方法通量高，靈敏度高，但需制備大量樣品。隨著技術(shù)的發(fā)展，又興起了一種名為微流控裝置的新技術(shù)。是通過(guò)人工調(diào)控流體流動(dòng)將樣品流經(jīng)微通道，該通道直徑可在數(shù)十到數(shù)百微米范圍調(diào)節(jié)，當(dāng)設(shè)置大小僅可通過(guò)一個(gè)細(xì)胞[2]，以這種方式達(dá)到細(xì)胞分離的目的。優(yōu)點(diǎn)在于該方法通量高，操作靈活，樣品需求量小，極大程度上避免了樣品的污染；但價(jià)格昂貴。

2.單細(xì)胞基因組或轉(zhuǎn)錄組的擴(kuò)增

高通量測(cè)序所需樣品量至少為數(shù)十納克，而單細(xì)胞中僅含有數(shù)匹克的DNA或mRNA，因此對(duì)基因組或轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了擴(kuò)增是必要的。

2.1細(xì)胞溶解與基因組的獲取

獲得的單個(gè)細(xì)胞需要將其細(xì)胞膜溶解以獲取基因組DNA （gDNA)或mRNA。一般常采用的細(xì)胞溶解方法包括物理法、化學(xué)法和酶解法，方法的選擇要根據(jù)細(xì)胞特性、gDNA或mRNA純化的難易程度等方面綜合考慮，有時(shí)需使用多種方法結(jié)合以達(dá)到理想效果。為了防止gDNA在純化時(shí)發(fā)生基因丟失現(xiàn)象，故常忽略此操作，因此要對(duì)細(xì)胞溶解這一步驟進(jìn)行嚴(yán)格操作。此外，還要避免采用的溶解試劑與gDNA或mRNA擴(kuò)增試劑相互作用而影響擴(kuò)增效果。

2.2單細(xì)胞基因組的擴(kuò)增

2.2.1單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增

全基因組擴(kuò)增（WGA）是將從單細(xì)胞中提取出的DNA進(jìn)行擴(kuò)增以獲取大量DNA樣品的技術(shù)。Roger Lasken團(tuán)隊(duì)通過(guò)研發(fā)多重置換擴(kuò)增技術(shù)，成為世界上首個(gè)成功對(duì)單細(xì)胞DNA擴(kuò)增及測(cè)序的團(tuán)隊(duì)。這項(xiàng)技術(shù)利用Phi29等聚合酶可以將通過(guò)變性、退火、結(jié)合到模板DNA上的任意隨機(jī)引物進(jìn)行不斷延伸。在聚合酶的作用下，將在其附近的延伸鏈置換下來(lái)，且每一種聚合酶都能完成鄰近延伸鏈的置換，從而獲得可覆蓋全基因組的大量小片段及大片段產(chǎn)物用來(lái)進(jìn)行基因測(cè)序。

為克服基因組的擴(kuò)增偏倚現(xiàn)象，謝曉亮教授等在2012年研發(fā)一種新技術(shù)--多重退火環(huán)狀擴(kuò)增循環(huán)技術(shù)[3]，該技術(shù)將MDA與PCR的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合，同時(shí)利用環(huán)狀DNA分子不能擴(kuò)增這一原理，將基因組先采用MDA進(jìn)行5輪預(yù)擴(kuò)增，新擴(kuò)增出的大量產(chǎn)物可閉合的形成環(huán)狀分子，使擴(kuò)增過(guò)程變?yōu)榫€性擴(kuò)增。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終獲得擴(kuò)增較均一的單細(xì)胞全基因組。

2.2.2單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的擴(kuò)增

轉(zhuǎn)錄組的擴(kuò)增需要將單細(xì)胞內(nèi)的mRNA提取后，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。一般常采用PCR指數(shù)擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄線性擴(kuò)增和Phi29聚合酶擴(kuò)增三種方法。PCR擴(kuò)增法是通過(guò)在cDNA兩端加上錨定引物后進(jìn)行PCR擴(kuò)增[4]。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中通常在轉(zhuǎn)錄本（成熟mRNA）的3’端引入引物oligo(dT)，5’端可采用STRT-seq和Smart-seq方法引入錨定引物。體外轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增法中，反轉(zhuǎn)錄是用T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子序列和oligo(dT)分別作為5’和3’端的引物合成第一鏈cDNA,并隨后合成第二鏈，然后T7 RNA聚合酶以第二鏈cDNA為的模板在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。

3.單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用

3.1腫瘤研究

3.1.1乳腺癌的演變

通過(guò)制備兩個(gè)腫瘤樣品，一種是有不同類型的腫瘤細(xì)胞組成的多基因組型，另一種是單一遺傳型細(xì)胞組成的單基因組型，然后利用流式分選儀分離出一百個(gè)上述的兩種細(xì)胞類型并進(jìn)行全基因組測(cè)序。研究結(jié)果表明，第一種多基因組型腫瘤細(xì)胞有三種克隆表達(dá)，而第二種單基因組腫瘤細(xì)胞是由單個(gè)腫瘤細(xì)胞以單克隆形式組成，這揭示腫瘤細(xì)胞的演變是間斷性而非逐步發(fā)生的。這一研究結(jié)果為癌癥的研究與臨床治療提供了重要依據(jù)。

3.1.2基因診斷與癌癥無(wú)創(chuàng)治療[5]

通過(guò)對(duì)單個(gè)腫瘤細(xì)胞的全基因組進(jìn)行測(cè)序，并與人類正?；驁D譜進(jìn)行比對(duì)，可找出引起癌癥的突變基因。利用這種方法進(jìn)行基因檢測(cè)，可以檢查出潛在的癌基因，了解腫瘤的起源和生長(zhǎng)規(guī)律，以便進(jìn)行及時(shí)預(yù)防、治療。

大多數(shù)癌癥患者由于腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移而治療無(wú)效死亡，這一過(guò)程往往是腫瘤細(xì)胞通過(guò)外周血循環(huán)來(lái)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。對(duì)外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行全基因組測(cè)序與外顯子測(cè)序，可以了解腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程的機(jī)制，使癌癥的無(wú)創(chuàng)治療成為可能，同時(shí)對(duì)癌癥的治療、預(yù)后以及復(fù)發(fā)均有很好的指導(dǎo)作用。

3.2微生物研究

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)為研究自然界難以培養(yǎng)的微生物提供可能。通過(guò)對(duì)單個(gè)微生物進(jìn)行全基因組測(cè)序，可以逐步構(gòu)建更加完備的微生物基因庫(kù)，利于對(duì)存在于海洋等蘊(yùn)含豐富資源的環(huán)境中微生物種類及功能的檢定，促進(jìn)科學(xué)家對(duì)微生物進(jìn)化、生長(zhǎng)等生命活動(dòng)的研究。

4.前景展望

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)研究細(xì)胞異質(zhì)性問(wèn)題上提供了極大的幫助，在腫瘤的研究與臨床治療、微生物學(xué)研究等領(lǐng)域已取得一定成果。但在技術(shù)操作上還存在一些問(wèn)題，如單細(xì)胞分離對(duì)細(xì)胞的損傷，細(xì)胞溶解過(guò)程中遺傳物質(zhì)的丟失，擴(kuò)增過(guò)程中出現(xiàn)的基因偏倚性等問(wèn)題。因此，技術(shù)方法的革新可推動(dòng)單細(xì)胞測(cè)序的發(fā)展與應(yīng)用。此外，應(yīng)注意單細(xì)胞基因的表達(dá)受所處環(huán)境的影響，對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序時(shí)，應(yīng)注意單細(xì)胞的情況不一定能揭示細(xì)胞群體的基因表達(dá)規(guī)律。此外，單細(xì)胞基因的表達(dá)受所處環(huán)境的影響，對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序時(shí)，應(yīng)注意單細(xì)胞的情況不一定能揭示細(xì)胞群體的基因表達(dá)規(guī)律。

總的來(lái)說(shuō)，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)具有廣闊的前景，尤其是在探究癌癥的發(fā)生、轉(zhuǎn)移機(jī)制、耐藥性機(jī)制以及預(yù)后檢測(cè)等方面。相信隨著單細(xì)胞分離及基因組擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律、耐藥機(jī)制研究的不斷深入，癌癥無(wú)創(chuàng)治療將會(huì)成為現(xiàn)實(shí)。

[1]朱忠旭，陳新.單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)及應(yīng)用進(jìn)展[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2015,34（5）：902-908.

[2]Yin H,Marshall D.Microfluidics for single cell analysis[J].Cur?rent Opinion in Biotechnology,2012,23(1):110-119.

[3]Zong C,Lu S.and Xie X.S.,2012,Genome-wide detection of sin?gle-nucleotide and copy-number variations of a single human cell,Sci?ence 338(6114):1622-1626.

[4]文路，湯富酬.單細(xì)胞測(cè)序分析研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)，2014,26(3）：228-233.

[5]Ni X，et al.Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients[J].Proc Natl Acad Sci USA,2013,110(52):21083-21088.

韓悅（1995-），女，漢族，河南新鄉(xiāng)人，河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2013級(jí)生物技術(shù)專業(yè)在讀本科生。