應(yīng)用PCR法對(duì)小麥葉疫病菌的檢測(cè)

張　雁, 張祥林, 王　翀, 羅　明, 馬海波, 張　瑜

1新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局，新疆 烏魯木齊 830063；

2新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052

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應(yīng)用PCR法對(duì)小麥葉疫病菌的檢測(cè)

張雁1,2, 張祥林1*, 王翀1, 羅明2, 馬海波1,2, 張瑜1

1新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局，新疆 烏魯木齊 830063；

2新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052

摘要:【背景】小麥葉疫病菌于20世紀(jì)60年代入侵我國(guó)后，迅速傳播擴(kuò)散并在局部區(qū)域造成嚴(yán)重危害，對(duì)我國(guó)小麥的健康發(fā)展構(gòu)成了巨大威脅?！痉椒ā吭O(shè)計(jì)出檢測(cè)小麥葉疫病菌的特異性引物，建立快速檢測(cè)該病菌的PCR方法。用真菌通用引物ITS4/ITS5對(duì)小麥葉疫病菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序，使用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)出檢測(cè)該病菌的特異性引物L(fēng)JY1和LJY2，優(yōu)化PCR反應(yīng)體系。【結(jié)果】建立了該病菌的PCR檢測(cè)方法，PCR反應(yīng)體系：25 mmol·L-1MgCl22.5 μL，10 mmol·L-1dNTP 1.0 μL，10 μmol·L-1引物各0.5 μL，DNA模板8 ng，最佳退火溫度57.6 ℃。【結(jié)論與意義】該方法可以準(zhǔn)確地將小麥葉疫病菌與其他鏈格孢屬的真菌區(qū)分開(kāi)。本研究結(jié)果為小麥葉疫病的快速檢測(cè)提供了依據(jù)，能夠有效防止該病菌在小麥進(jìn)出口貿(mào)易中傳入我國(guó)。

關(guān)鍵詞:小麥葉疫病菌； PCR； 體系優(yōu)化；引物L(fēng)JY1和LJY2

小麥葉疫病AlternariatriticinaPrasada & Prabhu是一種危害小麥的檢疫性真菌病害，此病主要侵染小麥葉片，從而引起葉斑、葉枯癥狀，導(dǎo)致小麥嚴(yán)重減產(chǎn)(商鴻生等，1998)。自2000年以來(lái)，我國(guó)每年從美國(guó)、澳大利亞、加拿大等國(guó)大量引進(jìn)小麥，進(jìn)口的數(shù)量和重量均位居其他進(jìn)口農(nóng)產(chǎn)品之首，各口岸檢驗(yàn)檢疫局每年從進(jìn)口的小麥中檢測(cè)出大量有害生物。新疆自2010年以來(lái)，每年從哈薩克斯坦大量進(jìn)口小麥，各口岸檢驗(yàn)檢疫局從入境的哈薩克斯坦小麥中截獲多種危險(xiǎn)性有害病菌，嚴(yán)重威脅到了新疆小麥的質(zhì)量安全。由于小麥葉疫病病原菌形態(tài)與小麥上常見(jiàn)的其他病菌種類很難區(qū)分，因此，建立小麥葉疫病菌快速檢測(cè)方法，對(duì)防止該病菌隨進(jìn)境小麥傳入我國(guó)具有十分重要的意義。

國(guó)內(nèi)外對(duì)此病的研究較少，主要集中在小麥葉疫病菌的分離鑒定和抗性遺傳等方面，Mercadoetal.(2006)對(duì)該病菌進(jìn)行了致病性檢測(cè)和序列分析；商鴻生等(2000)研究證實(shí)，我國(guó)局部地區(qū)已有小麥葉疫病發(fā)生,并分離得到了11個(gè)小麥鏈格孢A.triticina菌株,研究了其生物學(xué)特性，確定了小麥鏈格孢的鑒定條件和鑒別標(biāo)準(zhǔn)。本研究利用通用引物ITS4/ITS5，對(duì)小麥葉疫病病菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)篩選出該病菌的特異性引物，對(duì)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，并建立該病菌的PCR快速檢測(cè)方法，為我國(guó)各口岸檢驗(yàn)檢疫局在檢測(cè)小麥病害方面提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1　供試菌株

供試的9個(gè)菌株分別由新疆檢驗(yàn)檢疫局、河北檢驗(yàn)檢疫局和新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，詳見(jiàn)表1。

表1　供試菌株的病原名稱、寄主和來(lái)源

*ATCC:美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種典藏中心;XEEIQB:新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局;XAU:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);HEEIQB:河北出入境檢驗(yàn)檢疫局。

*ATCC: American type culture collection; XEEIQB: Xinjiang entry and exit inspection and quarantine bureau; XAU: Xinjiang agricultural university; HEEIQB: Hebei entry and exit inspection and quarantine bureau.

1.2　菌株DNA的提取

DNA的提取方法參照劉少華等(2005)的CTAB法，并稍加改進(jìn)。將小麥葉疫病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC36205接種到PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5 d。挑取1 g菌絲，加入液氮充分研磨，加入1 mL CTAB提取液(pH 7.5的0.1 mol·L-1Tris-HCl、1% CTAB、0.7 mol·L-1NaCl、10 mmol·L-1EDTA、1% β-巰基乙醇)，65 ℃水浴30 min，期間顛倒混勻5～6次，取出后冷卻至室溫，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，混勻后于12000 r·min-1離心10 min，用移液槍將上清液移到一個(gè)新的離心管中，用氯仿∶異戊醇(24∶1)重復(fù)抽提1次，然后加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，12000 r·min-1離心10 min后棄上清，用70%的無(wú)水乙醇洗滌沉淀2次，將無(wú)水乙醇室溫晾干，加入30 μL ddH2O于-20 ℃保存。

1.3　通用引物的PCR反應(yīng)

采用真菌通用引物ITS4/ITS5對(duì)供試材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如下：ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，ITS5:5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。

PCR反應(yīng)體系25 μL：10×Buffer 2.5 μL，25 mmol·L-1MgCl22.0 μL，10 mmol·L-1dNTP 1.0 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，10 μmol·L-1上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，無(wú)菌超純水補(bǔ)充至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸6 min。取PCR產(chǎn)物5 μL用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.4　克隆及PCR鑒定

用試劑盒法(Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver.2.0)從瓊脂糖凝膠上回收PCR擴(kuò)增片段。將回收的目的片段與載體pGM-T進(jìn)行連接，之后轉(zhuǎn)化到Top10感受態(tài)細(xì)胞中。在含有氨芐抗生素(AMP+)的藍(lán)白斑篩選平板上挑取白色菌落，并對(duì)其搖菌過(guò)夜培養(yǎng)。用質(zhì)粒提取試劑盒(Takara MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0)從培養(yǎng)液中提取重組質(zhì)粒DNA,對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒送往北京鼎國(guó)公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5　特異性引物設(shè)計(jì)

將測(cè)序結(jié)果與NCBI上發(fā)布的小麥葉疫病菌序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，以驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，通過(guò)DNAMAN生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)出一對(duì)小麥葉疫病菌的特異性引物，LJY1引物序列為：GTCTTTTGTCTCCAGTTCGC；LJY2引物序列為：GCTGTTTGACTCTCTTTCCA。引物合成后配成100 μmol·L-1母液，-20 ℃保存，稀釋10倍后再使用。該特異性引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段為520 bp。

1.6　PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

1.6.1退火溫度的優(yōu)化使用LJY1/LJY2引物，在25 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度分別設(shè)置為46.5、48.4、49.5、50.8、51.2、52.6、53.4、54.2、55.0、56.8、57.6、58.5 ℃，共12個(gè)梯度，其他反應(yīng)條件不變。

1.6.2MgCl2濃度的優(yōu)化25 mmol·L-1MgCl2用量分別設(shè)置為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 μL，共8個(gè)梯度，其他反應(yīng)條件不變。

1.6.3dNTP濃度的優(yōu)化10 mmol·L-1dNTP用量分別設(shè)置為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 μL，共7個(gè)梯度，其他反應(yīng)條件不變。

1.6.4引物濃度的優(yōu)化10 μmol·L-1上下游引物用量分別設(shè)置為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 μL，共7個(gè)梯度，其他反應(yīng)條件不變。

1.6.5模板濃度的優(yōu)化模板用量分別設(shè)置為1、2、3、4、5、6、7、8 ng，共8個(gè)梯度，其他條件不變。

1.7　引物的特異性檢測(cè)

為了檢驗(yàn)該引物的特異性，本試驗(yàn)使用LJY1/LJY2引物對(duì)供試的9種病原菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.8　特異性引物檢測(cè)進(jìn)口小麥樣品

挑選入境的哈薩克斯坦小麥中截獲的可疑小麥樣品，用小麥葉疫病菌的特異性引物L(fēng)JY1和LJY2對(duì)其進(jìn)行PCR檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1　小麥葉疫病菌引物ITS4/ITS5擴(kuò)增結(jié)果

通用引物ITS4和ITS5對(duì)小麥葉疫病菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到1條約580 bp的電泳條帶，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。

2.2　重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果

經(jīng)藍(lán)白斑篩選、PCR鑒定，篩選出含有正確插入片段的重組質(zhì)粒。試驗(yàn)結(jié)果表明：小麥鏈格孢菌重組質(zhì)粒DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到約580 bp的片段，大小與插入片段相同(圖2)。

圖1 ITS4/ITS5擴(kuò)增小麥葉疫病菌結(jié)果

Fig.1The results of ITS4/ITS5 clonesA.triticina

1：空白 Blank； 2：ATCC36205； M：DNA marker DL2000。

圖2小麥葉疫病菌重組質(zhì)粒PCR結(jié)果

Fig.2The PCR results ofA.triticinarecombinant plasmid

1: ATCC36205； M: DNA marker DL2000。

2.3　PCR反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

2.3.1退火溫度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響從圖3可以看出，退火溫度對(duì)PCR的擴(kuò)增影響較明顯，引物在退火溫度46.5～58.5 ℃均有擴(kuò)增產(chǎn)物，在57.6 ℃時(shí)條帶比較清晰且無(wú)二聚體，因此最佳退火溫度為57.6 ℃。

2.3.2MgCl2濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響從圖4可以看出，泳道1、2中沒(méi)有條帶出現(xiàn)，而泳道3到泳道8均出現(xiàn)特異性條帶，隨著MgCl2用量的增加，條帶的亮度也不斷增強(qiáng)，在泳道6達(dá)到最亮，因此最佳鎂離子濃度是2.5 μL。

圖3不同退火溫度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響

Fig.3Effects of PCR amplificated at different temperatures

1～12泳道不同退火溫度：46.5、48.4、49.5、50.8、51.2、52.6、53.4、54.2、55、56.8、57.6、58.5 ℃；13：CK； M:DNA marker DL2000。

Different temperatures of 1～12: 46.5, 48.4, 49.5, 50.8, 51.2, 52.6, 53.4, 54.2, 55, 56.8, 57.6, 58.5 ℃； 13： CK； M: DNA marker DL2000.

2.3.3dNTP濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響從圖5可以看出，泳道2到泳道8均出現(xiàn)特異性條帶，隨著dNTP用量的增加，條帶亮度和二聚體的量均無(wú)太大變化，所以dNTP用量的大小對(duì)PCR的影響不大，從節(jié)約成本的角度出發(fā)，選取dNTP的最佳用量為1.0 μL。

圖4不同MgCl2用量對(duì)PCR擴(kuò)增的影響

Fig.4Effects of PCR amplificated at different concentrations of MgCl2

1：CK；2～8泳道為MgCl2用量：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 μL；M:DNA marker DL2000。

1： CK； Different concentrations of MgCl2of 2～8： 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 μL； M: DNA marker DL2000.

圖5不同dNTP用量對(duì)PCR擴(kuò)增的影響

Fig.5Effects of PCR amplificated at different amounts of dNTP

1：CK；2～8泳道為dNTP用量：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 μL；M：DNA marker DL2000。

1： CK； Different amounts of dNTP of 2～8： 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 μL； M： DNA marker DL2000.

2.3.4引物濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響如圖6所示，除泳道1沒(méi)有出現(xiàn)條帶以外，泳道2到泳道8均出現(xiàn)特異性條帶，且在泳道5達(dá)到最亮且無(wú)二聚體。因此最佳引物用量是上下游引物共2.0 μL。

2.3.5不同模板濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響從圖7可以看出，隨著模板用量的增加，泳道2～9條帶的亮度也不斷增強(qiáng)，泳道9的條帶最亮且二聚體最少，因此最佳模板濃度是8 ng。

2.4　特異性引物對(duì)不同鏈格孢菌的PCR擴(kuò)增結(jié)果

用LJY1和LJY2特異性引物對(duì)小麥葉疫病菌(ATCC36205)、黃瓜鏈格孢(H1309-1)、辣椒鏈格孢(H1309-2)、棗鏈格孢(H1309-3)、豌豆鏈格孢(DHF-11530)、茄子鏈格孢(H1309-4)、核桃鏈格孢(H1309-5)、蘋(píng)果鏈格孢(ATCC34509)、鴨梨鏈格孢病菌(HYM038)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從圖8可以看出，該對(duì)引物在小麥葉疫病菌種群中可以特異性地?cái)U(kuò)增約520 bp的產(chǎn)物，而其他鏈格孢屬均未擴(kuò)增出特異性條帶。

圖6不同引物用量對(duì)PCR擴(kuò)增的影響

Fig.6Effects of PCR amplificated at different concentrations of primers

1:CK；2～8泳道為引物用量：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 μL；M:DNA marker DL2000。

1: CK； Different concentrations of primers of 2～8： 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 μL； M: DNA marker DL2000.

圖7　不同模板濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響

圖8　引物L(fēng)JY1/LJY2進(jìn)行 PCR擴(kuò)增不同鏈格孢菌的結(jié)果

2.5　特異性引物對(duì)哈薩克斯坦小麥的PCR擴(kuò)增結(jié)果

用LJY1和LJY2這對(duì)特異性引物對(duì)小麥葉疫病菌及入境的哈薩克斯坦小麥進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從圖9可以看出，該對(duì)引物在小麥葉疫病菌種群中可以特異性地?cái)U(kuò)增約520 bp的產(chǎn)物，而待測(cè)入境的哈薩克斯坦小麥均未擴(kuò)增出特異性條帶。

圖9引物L(fēng)JY1/LJY2進(jìn)行PCR擴(kuò)增哈薩克斯坦小麥的結(jié)果

Fig.9Result of PCR amplification using primers LJY1/LJY2 when grown on wheat of Kazakhstan

1：ATCC36205；2：陰性；3：H1；4：H2；5：H3；6：H4；7：H5；8:H6；9：H7;10:CK。

1： ATCC36205； 2： Fnminine； 3： H1； 4： H2； 5： H3； 6： H4； 7： H5；8: H6； 9： H7; 10: CK.

3討論

植物病原菌快速、簡(jiǎn)便、精確的檢測(cè),能有效防止危險(xiǎn)性檢疫病害的傳播蔓延，是邊境口岸檢疫的發(fā)展趨勢(shì),也是阻止有害病菌傳入我國(guó)的有效方法(秦旭升等，2000)。PCR技術(shù)以其靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、快速準(zhǔn)確的特點(diǎn),不僅被廣泛運(yùn)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和人類疾病的早期診斷、畜牧業(yè)動(dòng)物重大疫情的快速診斷,近年來(lái)也已廣泛應(yīng)用于植物檢疫性病害的診斷鑒定(何末軍等，2009)。該技術(shù)在檢疫性有害生物(段維軍和郭立新，2008),如柑橘潰瘍病菌Xanthomonascampestrispv.citri、梨火疫病菌Erwiniaamylovory、小麥印度腥黑病菌TilletiaindicaMitra、煙草環(huán)斑病毒Tobaccoringspotvirus、李壞死環(huán)斑病毒Prunusnecroticringspotilarvirus等的檢測(cè)中,發(fā)揮了重要作用。謝云陸和Zeler(1996)應(yīng)用PCR技術(shù)，準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)出被梨火疫菌潛伏侵染的樣品,檢出樣品中梨火疫菌的最低帶菌量為50個(gè)細(xì)菌,未發(fā)現(xiàn)它與其他植病細(xì)菌有交叉反應(yīng),從PCR擴(kuò)增、電泳分離到獲得最后結(jié)果僅需8 h。黃國(guó)明等(2008)研究分析了黑麥草上冬孢子形態(tài)非常相似的3種腥黑粉菌的DNA序列差異,設(shè)計(jì)了TCK的特異引物,成功建立了TCK菌絲基因組DNA的特異PCR檢測(cè)方法和冬孢子的套式特異PCR檢測(cè)方法。張華等(2008)研究設(shè)計(jì)的水稻細(xì)菌性條斑病菌Xanthomonasoryzaepv.oryzicola(Fang) Swingetal.的PCR引物具有很強(qiáng)的專化性，其建立的PCR檢測(cè)體系可?；詸z測(cè)水稻細(xì)菌條斑病菌,而對(duì)水稻白葉枯病菌Xanthomonascampestrispv.oryzae(Ishiyama) Dye和其他菌株則沒(méi)有擴(kuò)增信號(hào)。

小麥葉疫病菌屬鏈格孢屬真菌，是多種農(nóng)作物的病原菌，在該類病害的病原種類鑒定中，很難用分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定(Perello & Sisterna，2006)，為邊境檢疫工作帶來(lái)了極大的不便。本研究通過(guò)對(duì)小麥葉疫病標(biāo)準(zhǔn)菌株的克隆和測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，找出高度保守序列，然后應(yīng)用DNAMAN設(shè)計(jì)出該病菌的特異性引物L(fēng)JY1和LJY2，能夠?qū)⑿←溔~疫病菌和其他病菌區(qū)分開(kāi)。

特異性引物的設(shè)計(jì)對(duì)PCR檢測(cè)的高效性具有決定性作用。除此之外，PCR方法在應(yīng)用過(guò)程中還需注意一些問(wèn)題，如退火溫度過(guò)低，會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增；模板量過(guò)大，會(huì)使DNA制劑中的污染物影響PCR反應(yīng)效率。因此，在PCR反應(yīng)體系中，退火溫度、模板濃度等都會(huì)影響PCR反應(yīng)的準(zhǔn)確性。本研究在經(jīng)歷退火溫度、Mg2+濃度、模板濃度等一系列體系優(yōu)化后，建立了適用于檢測(cè)小麥葉疫病菌的PCR反應(yīng)體系。并通過(guò)一系列體系優(yōu)化，最終確定最佳反應(yīng)體系：退火溫度57.6 ℃；鎂離子濃度25 mmol·L-1Mg2+2.5 μL；dNTP用量10 mmol·L-1dNTP 1.0 μL；引物用量10 μmol·L-1引物各1.0 μL；模板濃度8 ng。應(yīng)用該方法對(duì)不同種的鏈格孢菌以及對(duì)進(jìn)口的哈薩克斯坦的小麥樣品進(jìn)行抽樣檢測(cè)，驗(yàn)證了該方法具有較好的特異性、穩(wěn)定性和靈敏性，并且可以在較短的時(shí)間(5～6 h)內(nèi)檢測(cè)出該病菌，大大地縮短了檢驗(yàn)小麥葉疫病的周期，為口岸檢驗(yàn)檢疫局對(duì)進(jìn)口小麥中攜帶該病菌的檢測(cè)提供了快速簡(jiǎn)便的方法。

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張華, 姜英華, 胡白石, 劉鳳權(quán), 許志剛. 2008. 利用PCR技術(shù)專化性檢測(cè)水稻細(xì)菌性條斑病菌. 植物病理學(xué)報(bào), 38(1): 1-5.

Perello A E and Sisterna M N. 2006. Leaf blight of wheat caused byAlternariatriticinain Argentina.PlantPathology, 55: 303.

Mercado V D， Renard M E， Duveiller E and Maraite H. 2006. Identification ofAlternariaspp. on wheat by pathogenicity assays and sequencing.PlantPathology, 55: 485-493.

(責(zé)任編輯:郭瑩)

List of reviewers, 2014

We are grateful for the work of the following colleagues, who acted as reviewers for submitted manuscripts during 2014. Names with an asterisk indicates colleagues who reviewed more than one manuscript.

The Editors-in-Chief

Hong-mu AI(艾洪木)*

Dong CHU(褚棟)

Jin-jie CUI(崔金杰)*

Wei-dong FU(付衛(wèi)東)

Xiao-jun GU(顧曉軍)*

Fu-rong GUI(桂富榮)*

An-ping GUO(郭安平)*

Yu-rong HE(何余容)

Xue-nan HU(胡學(xué)難)

Fei LI(李飛)

Xin-hai LI(李新海)*

Jin-tian LIN(林進(jìn)添)

以貴州習(xí)水案為例，此案中人們的普遍感受是，行為人主觀惡性大，造成社會(huì)影響十分惡劣，行為上符合強(qiáng)奸罪構(gòu)成要件，但也許攝于行為人手中掌握的公權(quán)力的強(qiáng)大，他們被定為嫖宿幼女罪，替換了強(qiáng)奸罪，免去了強(qiáng)奸罪的更高刑法處罰，拿到了免死牌。惡劣行徑不能施以應(yīng)有懲處，此罪因此被認(rèn)為是讓人鉆了法律的漏洞。

Tong LIN(林同)

Guang-xu LIU(劉廣緒)

Yong-yue LU(陸永躍)

De-ying MA(馬德英)

Yan MA(馬艷)*

Zheng-qiang PENG(彭正強(qiáng))*

Pei QIN(欽佩)*

Yu-chuan QIN(秦玉川)

Zu-hua SHI(施祖華)

Jin-jun WANG(王進(jìn)軍)

Xu-bo WANG(王旭波)

Qi-yong WENG(翁啟勇)

Mei-xiang WU(吳梅香)

Jin-han XU(徐金漢)*

Jun-xiang WU(仵均祥)*

Gong-yin YE(葉恭銀)

Yi YU(于毅)

Cong-sheng ZENG(曾從盛)*

Dong-qiang ZENG(曾東強(qiáng))

Ai-bin ZHAN(戰(zhàn)愛(ài)斌)

Ai-bing ZHANG(張愛(ài)兵)

Gui-fen ZHANG(張桂芬)

Kai-chun ZHANG(張開(kāi)春)*

Detection ofAlternariatriticinaPrasada & Prabhu using PCR techniques

Yan ZHANG1,2, Xiang-lin ZHANG1*, Chong WANG1, Ming LUO2, Hai-bo MA1,2, Yu ZHANG1

1XinjiangEntryandExitInspectionandQuarantineBureau,Urumqi,Xinjiang830063,China;

2CollegeofAgronomy,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi,Xinjiang830052,China

Abstract:【Background】 After the Alternaria leaf blight infection of wheat in China in the 1960s, which spread rapidly and caused serious harm to the local economy, it become a constant threat for the production of China′s wheat. 【Method】 We designed specific primers in order to establish a rapid PCR detection method for Alternaria triticina Prasada & Prabhu. The fungal universal primers ITS4/ITS5 were used to amplify the A.triticina by PCR. The PCR products were cloned and sequenced .The bacteria specific primers LJY1 and LJY2 were designed by DNAMAN software. And the reaction system was optimized. 【Results】 PCR reaction was set up: 25 mmol·L-1MgCl22.5 μL, 10 mmol·L-1dNTP 1.0 μL, 10 μmol·L-1primers 0.5 μL respectively, the template of DNA was 8 ng, the best annealing temperature was 57.6 ℃. The rapid PCR detection method for the species was established. 【Conclusion and significance】 The testing of the method for detection on the 9 different strains showed that the primer can accurately distinguish wheat leaf blight from other Alternaria fungi. The results for the rapid detection of wheat leaf blight provide an experimental basis, which can effectively used to prevent the bacteria from entering China′s import and export trade of wheat.

Key words:Alternaria triticina; PCR; system optimization; primers LJY1 and LJY2