基質γ-羧基谷氨酸蛋白與腎結石形成

高兵

(沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院細胞生物與遺傳學教研室，遼寧沈陽110034)

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基質γ-羧基谷氨酸蛋白與腎結石形成

高兵

(沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院細胞生物與遺傳學教研室，遼寧沈陽110034)

摘要腎結石形成以腎小管或腎間質的結晶異常沉積為特征，是一個多蛋白相互作用和多信號通路參與的復雜的生物學過程。與血管鈣化機制類似，腎臟通過表達和分泌一些大分子蛋白參與和影響腎臟鈣化。本文簡介基質γ-羧基谷氨酸蛋白與腎結石形成的關系。

關鍵詞腎結石；腎臟鈣化；基質γ-羧基谷氨酸蛋白；蛋白質相互作用；信號通路

腎結石疾病是一種由環(huán)境因素、飲食因素和遺傳因素引起的復雜疾病，以腎小管或腎間質的結晶異常沉積為特征，臨床常表現(xiàn)為腎臟功能損害和尿路梗阻，發(fā)病率6%～12%，5年再發(fā)率達50%，并可終生多次再發(fā)[1]。腎結石的形成機制復雜，至今對其分子形成機制仍不清楚，導致目前臨床缺乏有效的治療和預防措施，而多以碎石、手術等方式暫時緩解癥狀，不能在腎臟鈣化的發(fā)病機制上對結石形成進行有效的藥物抑制和再發(fā)的預防。因此，闡明結石形成的分子機制對腎結石疾病的早期預防、防治再發(fā)等方面具有重要的意義。本文簡要介紹基質γ-羧基谷氨酸蛋白(matrix Gla protein，MGP)與腎結石形成機制的研究進展。

1腎結石形成

腎結石形成是腎臟及其內外環(huán)境與基因之間復雜的相互作用的過程。泌尿系結石絕大部分都起源于腎臟，腎臟在保持和調節(jié)人體水、鹽平衡，排除代謝廢物的同時，易在腎小管形成鹽的過飽和狀態(tài)，在常見的代謝異常如高草酸尿、高鈣尿的風險環(huán)境下，結晶沉積在腎小管或腎間質，導致腎臟鈣化，結晶不斷成核，聚集和生長，最終形成腎結石。在這個過程中，腎臟通過主動或被動的生物學行為表達和分泌一些大分子蛋白參與和影響結石形成。如我之前所在的研究小組首次在腎結石基質中發(fā)現(xiàn)的骨橋蛋白(osteopontin，OPN)，在腎小管上皮細胞表達，參與腎小管細胞和結晶的相互作用，調節(jié)結晶與腎小管上皮細胞的黏著，抑制結晶生長，其基因單體型變異也被發(fā)現(xiàn)與腎結石的發(fā)病風險密切相關[2-5]。近年來，尿中的其他大分子蛋白，如Tamm-Horsfall protein(THP)、bikunin和human urinary trefoil factor 1等也相繼被發(fā)現(xiàn)與腎結石形成相關[6-7]。最近，Wright研究小組通過蛋白質組學研究在人尿中識別了1 063個蛋白，其中775個蛋白可能與腎結石形成相關[8]。盡管該研究沒有深入探討這些蛋白質之間確切的相互關系和對腎結石形成的影響，又存在較難展現(xiàn)腎小管上皮細胞內部生物學過程和分子功能的局限性，但是這些蛋白的發(fā)現(xiàn)暗示腎結石形成過程是一個復雜的相互作用的過程，包括蛋白質間的相互作用和蛋白質與無機物之間的相互作用。

2腎臟鈣化

腎臟鈣化表現(xiàn)為腎小管和腎間質的結晶異常沉積，是與腎結石形成密切相關的病理過程。腎臟鈣化與血管鈣化可能存在類似的形成機制，具有相似的特點：(1)鈣化斑塊樣形態(tài)和成分上相似，研究發(fā)現(xiàn)血管鈣化中鈣磷沉積比率近似草酸鈣腎結石成分[9]。(2)鈣化過程中一些骨相關蛋白表達增高，可通過直接螯合鈣離子或者調解化學誘導物質抑制鈣化[10-11]。(3)鈣化在風險因素持續(xù)存在或抑制物缺乏的條件下有生長的趨勢并可導致一系列的生化反應，如炎癥、損傷等，是主動的調節(jié)過程[11-13]。這些相似性提示2種鈣化可能存在類似的機制，而某些大分子蛋白可能在2種鈣化中發(fā)揮類似的作用。例如，上述OPN蛋白不僅在血管鈣化中具有重要的鈣化抑制作用[14-15]，而且其與腎臟鈣化密切相關的事實也得到了公認[2-3]。我們推測，除已經(jīng)公認的OPN蛋白外，某些證明在血管鈣化中存在確定作用的蛋白可能在腎臟鈣化中也發(fā)揮相似的作用。MGP蛋白是調節(jié)細胞外基質鈣化的決定物質，已發(fā)現(xiàn)對血管鈣化具有重要的抑制作用。MGP蛋白在骨、心、血管、腎臟、肺中均有表達，是一種維他命K依賴的分泌蛋白。MGP蛋白有5個γ-羧基谷氨酸殘基，經(jīng)過內質網(wǎng)γ-谷氨酰羧化酶羧基化修飾后與鈣、磷離子和結晶具有高度的親和性[16]。血管鈣化研究中發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化斑塊中MGP蛋白表達增加[17]；血管平滑肌細胞凋亡可引起MGP mRNA表達增加，其細胞凋亡小體可成為結晶核并有MGP蛋白表達[18]。MGP基因敲除小鼠出生6～8周后因全身動脈鈣化崩潰而死亡，而恢復MGP蛋白在Mgp(-/-)小鼠血管的表達后可以阻止動脈鈣化[9,19]。上述已經(jīng)確定在2種鈣化中均存在鈣化抑制作用的OPN蛋白在Mgp(-/-)小鼠鈣化動脈表達增加并聚合成大的蛋白復合物，誘導巨噬細胞參與鈣化過程[20]，暗示OPN蛋白與MGP蛋白間存在著相互作用。在另一項研究中，研究人員用華法令(一種維他命K環(huán)氧化物還原酶化學抑制劑)通過阻斷大鼠維他命K環(huán)氧化物還原酶系統(tǒng)抑制MGP的轉錄后修飾，結果發(fā)現(xiàn)這一處理降低了MGP的活性，并可觀察到大鼠的血管廣泛鈣化[21]。這些結果揭示了MGP蛋白是調節(jié)細胞外基質鈣化的決定物質，它通過表達和活性改變，并與其它鈣化相關蛋白的相互作用共同發(fā)揮影響血管鈣化的作用。但遺憾的是，這些研究都將研究重點放在了研究MGP在血管鈣化方面的影響，而并未觀察和研究其對腎臟鈣化的影響和發(fā)揮的作用。

3MGP蛋白與腎臟鈣化

我們課題組在國家自然科學基金的資助下，對MGP蛋白在腎臟鈣化的作用進行了初步探索。在腎小管細胞研究中，我們發(fā)現(xiàn)MGP蛋白在草酸和草酸鈣結晶刺激下表現(xiàn)為依時間梯度的上調表達[22]。研究發(fā)現(xiàn)MGP蛋白在正常大鼠腎小管亨利氏袢升支和遠曲小管中表達，而在結石形成大鼠中則主要在乳頭部集合管中表達，這與鈣化抑制蛋白OPN和THP在正常鼠和結石鼠的表達定位一致和類似[3,23]；有研究發(fā)現(xiàn)結晶多沉積在MGP蛋白表達缺失的腎小管中，而正常表達MGP蛋白的腎小管中未見結晶形成，并觀察到MGP蛋白存在于結晶的有機層結構中[24]。此外，我們還在中日兩國人群的研究中發(fā)現(xiàn)MGP基因第4外顯子的SNPrs4236(A/G)多態(tài)變異與腎結石發(fā)病風險相關[25-26]。這一發(fā)現(xiàn)與之前法國和愛爾蘭的一項聯(lián)合研究結果頗為相似，該研究發(fā)現(xiàn)SNPrs4236與冠狀動脈硬化發(fā)病風險相關[27]，這也在一定程度上提示了MGP蛋白在腎臟鈣化可能發(fā)揮重要的作用。另外，其他一些研究也發(fā)現(xiàn)MGP基因與腎結石形成相關，如日本的研究小組通過全基因組分析發(fā)現(xiàn)MGP基因在結石形成小鼠的腎臟表達增加[28]。這些研究提示MGP蛋白不僅是血管鈣化的決定物質，還與腎臟鈣化密切相關。但目前對MGP蛋白在腎臟鈣化中的系統(tǒng)研究還很少。

3.1MGP蛋白與內質網(wǎng)應激MGP蛋白表達和活性是它發(fā)揮生物學功能的前提條件，其活性需要依賴內質網(wǎng)γ-谷氨酰羧化酶在維生素K提供能量驅動下完成，因此我們推測腎小管上皮細胞內質網(wǎng)功能的紊亂可能影響MGP蛋白的活性。內質網(wǎng)是蛋白質合成、折疊、運輸以及細胞內鈣離子儲存的主要場所。鈣平衡紊亂、糖基化抑制、氧化還原環(huán)境改變等均可使內質網(wǎng)內的微環(huán)境遭到破壞，而蛋白質折疊異常，蓄積在內質網(wǎng)內而誘發(fā)內質網(wǎng)應激。內質網(wǎng)應激直接影響應激細胞的轉歸，如修復、損傷或凋亡。低強度內質網(wǎng)應激下的細胞會產生持續(xù)性的細胞機能障礙，而過度的應激則會導致細胞死亡[29-30]。內質網(wǎng)膜上存在3種被稱作內質網(wǎng)應激敏感器的膜蛋白分別是PERK(PRKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)、IRE1(Inositol Requirement 1)、ATF6(activating transcription factor 6)。這些蛋白在沒有負荷的情況下在內質網(wǎng)膜內腔與分子伴侶蛋白Bip(Binding Protein)/GRP78(Glucose-Regulated Protein 78)結合處于非活性化狀態(tài)。內質網(wǎng)應激發(fā)生時Bip/GRP78解離，PERK、IRE1及ATF6分別被釋放而活性化[29,31]。PERK使eIF2a磷酸化可以抑制大多數(shù)的蛋白翻譯。IRE1通過活性化轉錄因子XBP-1促進分子伴侶蛋白Bip/GRP78的表達。ATF6被釋放后轉移至高爾基體，接受膜內切斷從而活化，作為轉錄因子促進分子伴侶的表達[29,31]。研究發(fā)現(xiàn)，血管平滑肌細胞MGP的活性和分泌與內質網(wǎng)γ-谷氨酰羧基化修飾密切相關[16,32]。研究發(fā)現(xiàn)腎結石患者的γ-谷氨酰羧化酶活性比正常人顯著降低[33]。這些研究結果也為我們對內質網(wǎng)應激可能影響MGP蛋白活性和功能的推測提供了證據(jù)支持。

3.2MGP相互作用蛋白蛋白質-蛋白質相互作用決定著從轉錄調節(jié)到酶級連反應的幾乎所有的生物功能，這方面的研究具有重要的科學價值和應用前景。新近發(fā)展出了很多在基因組水平上和蛋白水平上用理論方法和已知的蛋白互作網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫預測某蛋白及其相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡的技術，對功能基因組研究具有十分重要的意義，有助于蛋白質功能的分析、疾病致病機理的闡明和治療新藥的開發(fā)等眾多難題的解決，是目前生命科學的前沿領域之一。我們最近在一個包含多物種蛋白質互作信息的數(shù)據(jù)庫中調查了MGP的可能相互作用蛋白，發(fā)現(xiàn)它與骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein 2，BMP2)存在相互作用。BMP2在血管鈣化中通過激活NADPH氧化酶從而增加血管平滑肌細胞的內質網(wǎng)應激，介導細胞凋亡，促進血管鈣化形成，而MGP蛋白通過結合BMP2而發(fā)揮抑制血管鈣化的作用[34-35]。MGP和BMP2在腎臟鈣化中的相互作用機制還不清楚。我們進一步在該數(shù)據(jù)庫中的網(wǎng)絡基礎上分析MGP和BMP2的第一相關蛋白，得到BMP2的8個相互作用蛋白(ENG、SOSTDC1、ACTR2、BMPR1A、MGP、BMPR1B、BMPR2和COL2A1)。富集分析發(fā)現(xiàn)，其中主要有4個蛋白(BMP2、BMPR1B、BMPR1A和BMPR2)參與轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號傳導通路和細胞因子與細胞因子受體相互作用信號傳導通路。這些調查和分析為我們理解MGP相互作用蛋白提供了一些有益的重要線索。不足的是，數(shù)據(jù)庫提供的MGP與BMP2的相互作用是用親和層析法得到，可信度很高，但信息量有限。

3.3腎結石形成信號通路腎結石形成過程中，結晶、草酸等的毒性作用可誘導腎小管上皮細胞炎癥、氧化應激和細胞損傷與凋亡等。這些生物學行為彼此關聯(lián)，其發(fā)生發(fā)展與基因的表達模式變化密切相關。例如，研究發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細胞氧化應激ROS(reactive oxygen species)通過p38 MAPK/JNK信號通路激活轉錄因子(如NF-κB、AP-1)和TGF-β，進一步誘導OPN、Bikunin、MCP-1、MGP、BMP等的表達增加[37]；草酸鈣結晶刺激下巨噬細胞可能通過TGF-β1信號通路誘導腎小管上皮細胞轉分化[38]。這些研究主要聚焦少數(shù)基因/蛋白，缺乏從整體角度認識腎臟鈣化的信號通路和分子機制，導致有關腎臟鈣化的關鍵信號通路尚不明確。最近，我們利用上述Wright研究小組的蛋白質組學研究數(shù)據(jù)[36]得到839個腎結石相關候選蛋白，將這些蛋白組入人類生物學反應及信號通路數(shù)據(jù)庫構建并分析相互作用網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)了7個關鍵蛋白，包括上述MGP的相互作用蛋白BMP2，這些蛋白都至少參與5個以上信號通路。近年來，轉錄組學研究成為在整體細胞和動物水平揭示疾病相關基因及其分子機制的重要方法?；虮磉_芯片已多次被用于發(fā)現(xiàn)腎結石差異表達基因，例如，Chen等[39]用0.75%乙二醇誘導結石形成鼠并執(zhí)行腎臟Microarray分析，報告了345個表達差異基因。但這些芯片研究很少在整體網(wǎng)絡水平對腎結石形成中基因之間的關系進行深入分析。

4展望

相較芯片技術，下一代測序技術可進行全轉錄組水平的表達差異基因研究，具有定量準確、可重復性高、更可靠的特點，還具有發(fā)現(xiàn)新的轉錄本、剪接變體等的優(yōu)點。使用該技術分析結晶或草酸刺激下腎小管上皮細胞轉錄組表達差異基因，將能夠進一步闡明MGP蛋白及其相互作用蛋白在腎小管上皮細胞整體轉錄水平的分子機制。

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Matrix Gla Protein and Kidney Stone Formation

GAO Bing

(Department of Cell Biology and Genetics,Shenyang Medical College,Shenyang 110034,China)

AbstractKidney stone formation is characteristic of aberrant crystal deposition in renal tubule and renal interstitial.It is a complex biological process including protein-protein interaction and many signaling pathways.Similar to vascular calcification, kidney expresses and secretes some macromolecular proteins to influence stone formation.Here, we introduced briefly the relation of matrix Gla protein and kidney stone formation.

Key wordskidney stone;renal calcification;matrix Gla protein;protein-protein interaction;signaling pathway

收稿日期2015-10-08

doi:10.3969/j.issn.1008-2344.2015.04.001

中圖分類號R691.4

文獻標識碼A

文章編號1008-2344(2015)04-0193-04

作者簡介高兵(1972—)，男(漢).教授.研究方向：腎臟鈣化研究.E-mail：gaobingdr@hotmail.com

基金項目國家自然科學基金項目(No.81570632)