大鼠骨骼肌缺血再灌注致肺損傷的實(shí)驗(yàn)研究

張彥榮，朱恬儀，武志峰，畢偉

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大鼠骨骼肌缺血再灌注致肺損傷的實(shí)驗(yàn)研究

張彥榮，朱恬儀，武志峰，畢偉

作者單位： 050000石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血管外科(張彥榮、武志峰、畢偉)； 河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院神經(jīng)

近年來(lái)，下肢缺血性疾病在臨床上很常見，其原因可以是房顫所致的肢體動(dòng)脈栓塞，亦可以為動(dòng)脈硬化基礎(chǔ)上的血栓形成，造成下肢缺血，經(jīng)過(guò)治療后的再灌注損傷是目前臨床尤為重視的病理生理變化過(guò)程。再灌住損傷不僅可以導(dǎo)致局部組織第2次打擊，還能導(dǎo)致遠(yuǎn)離器官(如腎、肺等)的繼發(fā)性損傷[1]，針對(duì)骨骼肌缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制的研究，有助于了解此類疾病的發(fā)生、發(fā)展、治療及預(yù)后。

1材料與方法

1.1材料(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康清潔級(jí)Wistar大鼠24只，雄性, 4月齡，體質(zhì)量200～250 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)室通風(fēng)良好，飼養(yǎng)溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度65%～70%，光照周期12 h開/12 h關(guān)，所有大鼠飼養(yǎng)在干凈的塑料籠具里，飼料及食水均經(jīng)滅菌處理[2]。(2)主要試劑和儀器設(shè)備： 20%烏拉坦(曹楊第二中學(xué)化工廠生產(chǎn))，LDH、MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn))，蘇木素染液及伊紅染液(臺(tái)灣BASO貝索企業(yè)生產(chǎn))。美國(guó)全自動(dòng)生化分析儀CI8200，日本顯微鏡BHS(Olympus)，日本病理切片機(jī)Olympus CH20。

1.2動(dòng)物分組及模型制備20%烏拉坦 (5 ml/kg)大鼠腹腔注射麻醉, 止血帶捆扎大鼠后肢根部,使兩后肢缺血, 依據(jù)缺血時(shí)間去除止血帶實(shí)現(xiàn)再灌注[3]。大鼠后肢腫脹、青紫，但無(wú)發(fā)黑破潰，大鼠呼吸心跳存在視為模型成功。24只大鼠隨機(jī)分為4組，每組6只。I組為對(duì)照組,僅進(jìn)行常規(guī)麻醉，不阻斷后肢血流(14 h后取材); II組阻斷后肢動(dòng)脈2 h，再灌注6 h;III組阻斷后肢動(dòng)脈4 h再灌注6 h; IV組阻斷后肢動(dòng)脈8 h再灌注6 h。

1.3觀測(cè)指標(biāo)

1.3.1乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)檢測(cè)： 各組大鼠實(shí)驗(yàn)畢經(jīng)心臟穿刺取血5 ml，4℃下以3 500 r/min速度離心，取血清1 ml,-20℃保存待測(cè)；同時(shí)各組大鼠取肺組織5 g,生理鹽水沖洗，制成勻漿，在4℃下以3 500 r/min速度離心，取上清液1 ml,-20℃保存待測(cè)；血清LDH含量用比色法檢測(cè)、肺組織MDA含量用硫代巴比妥酸法檢測(cè)，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作。

1.3.2骨骼肌、肺組織損傷情況： 各組大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，分別取左后肢內(nèi)側(cè)肌肉組織及左肺下葉組織，以中性甲醛固定液固定24 h，梯度脫水9.5 h,透明1.5 h,浸蠟4 h，病理切片機(jī)切片,切片厚度4 μm，采用HE染色，顯微鏡下觀察組織學(xué)變化。

2結(jié)果

2.1大鼠一般情況實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，I組大鼠呼吸、心跳正常，后肢無(wú)腫脹，活動(dòng)自如；II、III、IV組大鼠呼吸、心跳增快，其中II組大鼠后肢腫脹，顏色發(fā)紅，后肢活動(dòng)不利； III、IV組大鼠后肢明顯腫脹伴不同程度的青紫，后肢不能直立。

2.2血清LDH、肺組織MDA含量LDH水平：與I組比較，II、III、IV組均升高(P<0.05)，其中IV組升高最為明顯(P<0.05)；肺組織MDA水平：與I組比較，II組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，III、IV組MDA明顯升高,且與前2組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1　血清LDH及肺組織MDA含量比較　

注：與I組比較，aP<0.05；與II組比較，bP<0.05；與III組比較，cP<0.05

2.3骨骼肌及肺組織變化(1)骨骼?。?I組骨骼肌細(xì)胞正常,大小均勻，排列整齊，呈多邊形，粉紅染；結(jié)締組織呈淺粉色，較肌細(xì)胞染色淡；II組骨骼肌細(xì)胞水腫明顯，血管擴(kuò)張充血，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；III組骨骼肌細(xì)胞充血、水腫明顯，少量壞死灶存在，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；IV組肌細(xì)胞大片壞死，結(jié)構(gòu)破壞，染色淺淡，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1見封3)。(2)肺組織： I組肺泡上皮細(xì)胞正常，肺泡及肺泡間隔組織結(jié)構(gòu)正常,呈網(wǎng)狀疏松結(jié)構(gòu)，肺泡間隔無(wú)充血及水腫，肺泡腔內(nèi)無(wú)滲出物及炎細(xì)胞浸潤(rùn)等改變；II組正常肺泡上皮細(xì)胞，僅少量炎細(xì)胞浸潤(rùn),III組肺泡擴(kuò)張融合，間隔增寬，充血，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；IV組肺泡大小不等，間隔明顯增寬變形，結(jié)構(gòu)破壞，間質(zhì)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2見封3)。

3討論

缺血再灌注的概念是McCord于1985年首次提出的，它是指機(jī)體組織在急性缺血一段時(shí)間后，對(duì)組織代謝、結(jié)構(gòu)和功能造成的損傷并沒(méi)有隨著血流的恢復(fù)而恢復(fù)，而是不斷加重，甚至出現(xiàn)了不可逆的損傷乃至壞死的狀態(tài)[4]。當(dāng)組織缺血時(shí)間達(dá)到6～8 h后即可出現(xiàn)組織細(xì)胞壞死，再灌注后不僅可造成缺血組織進(jìn)一步損傷，亦可造成遠(yuǎn)隔臟器損傷，嚴(yán)重者危及生命。正常骨骼肌細(xì)胞內(nèi)含豐富的乳酸脫氫酶(LDH)，由于骨骼肌細(xì)胞受到損傷，其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，通透性增高，使得LDH釋放入血。目前對(duì)于缺血再灌注損傷機(jī)制的研究還不十分清楚，對(duì)于乳酸脫氫酶升高，認(rèn)為主要是由于氧自由基的堆積及鈣超載2大因素引起的[5]，研究顯示肌細(xì)胞缺血，氧供減少，氧自由基清除系統(tǒng)功能障礙，生成系統(tǒng)潛在活性升高，一旦恢復(fù)血供，氧自由基爆發(fā)式產(chǎn)生，從而造成組織細(xì)胞損傷，膜流動(dòng)性和鈣離子通透性升高，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性被破壞；鈣超載可激活細(xì)胞膜磷脂酶和蛋白酶，質(zhì)膜損害，導(dǎo)致LDH大量外流入血[6，7]，組織損傷程度越重，釋放入血的LDH越多。因而血清中乳酸脫氫酶的含量可作為衡量骨骼肌細(xì)胞損傷的敏感指標(biāo)，其含量的高低可反映骨骼肌細(xì)胞損傷的程度。本結(jié)果顯示隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng),LDH逐漸升高,說(shuō)明骨骼肌損傷逐漸加重，這一點(diǎn)在不同組別骨骼肌HE染色中亦可顯示。

骨骼肌缺血再灌注肺損傷時(shí)可產(chǎn)生大量的過(guò)氧化物和超氧自由基。氧自由基是指含有氧而且不成對(duì)電子位于氧原子上的自由基。其特性是極不穩(wěn)定，半衰期短，能奪取電子而使其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)敏感分子氧化，對(duì)機(jī)體造成持續(xù)性的損害[8，9]。氧自由基對(duì)組織的損傷主要通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化作用來(lái)完成[10，11]，細(xì)胞膜磷脂中的多不飽和脂肪酸被氧自由基所氧化，細(xì)胞膜完整性遭到破壞，其通透性明顯增加[12]；而且脂質(zhì)過(guò)氧化一旦被引發(fā)，則可呈連鎖反應(yīng)，呈擴(kuò)散和放大趨勢(shì)[13]；同時(shí)氧自由基還通過(guò)激活核因子-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,造成細(xì)胞因子、黏附分子及炎性反應(yīng)的酶類過(guò)度表達(dá)[14]，這些物質(zhì)直接或間接地參與了缺血再灌注損傷[15]。丙二醛(MDA)是自由基與細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量多少可以反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度并間接反映自由基的多少，MDA越高，說(shuō)明氧自由基對(duì)組織損傷越重。因此MDA是判斷脂質(zhì)過(guò)氧化的可靠指標(biāo)[16，17]，本實(shí)驗(yàn)中，I組、II組MDA無(wú)明顯升高，說(shuō)明該條件下缺血再灌注對(duì)肺損傷不明顯，而III、IV組MDA依次升高,說(shuō)明肺損傷隨缺血時(shí)間的延長(zhǎng)依次加重。這一點(diǎn)從肺組織HE染色中亦可得到證實(shí)。在III組肺組織已出現(xiàn)組織學(xué)改變，而且在IV組，骨骼肌細(xì)胞大片壞死，同時(shí)肺損傷嚴(yán)重，肺泡間隔明顯增寬，結(jié)構(gòu)破壞。因此，在骨骼肌缺血再灌注后組織細(xì)胞損傷依缺血時(shí)間的延長(zhǎng)而加重，一定程度的缺血再灌注可致肺損傷。

隨著生活水平的提高，下肢缺血的疾病日益增多，因此本研究將有助于肢體缺血再灌注損傷機(jī)制的研究，以便更好地服務(wù)于臨床。

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《疑難病雜志》述評(píng)欄目征稿

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論著·基礎(chǔ)

肌肉病科(朱恬儀)

【摘要】目的觀察大鼠骨骼肌不同缺血時(shí)間再灌注造成肺損傷的變化。方法將雄性Wistar大鼠24只隨機(jī)分為4組，I組為對(duì)照組,僅進(jìn)行常規(guī)麻醉，不阻斷后肢血流; II組為阻斷后肢血流2 h再灌注6 h；III組為阻斷后肢血流4 h后再灌注6 h; IV組為缺血8 h后繼續(xù)再灌注6 h; 檢測(cè)大鼠血清乳酸脫氫酶(LDH)、肺組織丙二醛(MDA)含量、肌肉組織及肺組織的病理變化。結(jié)果(1)LDH水平:實(shí)驗(yàn)后，I組變化不明顯,II、III、IV組呈上升趨勢(shì)，與I組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且IV組>III組>II組(P<0.05)。(2)MDA水平:實(shí)驗(yàn)后，I、II組變化不明顯，III、IV組呈上升趨勢(shì)，且IV組>III組>II、I組(P<0.05)。(3)肌肉組織光鏡結(jié)果隨缺血時(shí)間的延長(zhǎng)損傷依次加重，IV組骨骼肌組織細(xì)胞大片壞死。而肺組織損傷僅見在III、IV組，且程度逐漸加重。結(jié)論大鼠骨骼肌缺血再灌注后組織細(xì)胞損傷依缺血時(shí)間的延長(zhǎng)而加重，缺血4 h再灌注6 h時(shí)可繼發(fā)肺損傷。

【關(guān)鍵詞】骨骼肌; 缺血再灌注損傷; 肺損傷；乳酸脫氫酶；丙二醛；大鼠

Experimental study of skeletal muscle ischemia reperfusion induced lung injury in ratsZHANGYanrong*,ZHUTianyi，WUZhifeng,BIWei.*DepartmentofVascularSurgery,theSecondHospitalAffiliatedtoHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the changes of lung injury caused by different ischemia time of skeletal muscle.MethodsTwenty-four male Wistar rats were randomly assigned for four groups, group I as the control group, only general anesthesia, did not block the hind limb blood flow; group II for blocking hind limb blood flow for 2 h and reperfusion for 6 h; group III for blocking hind limb blood flow 4 h and reperfusion 6 h; group IV for ischemia 8h and 6 h of reperfusion; detected rat’s serum lactate dehydrogenase (LDH) and malondialdehyde (MDA) content, muscle tissue and lung tissue pathological changes.Results(1) LDH levels: after the experiment, changes in group I is not obvious, group II, III and IV showed a rising trend, the difference were significant compared with group I(P<0.05), and the group IV > group III >group II (P<0.05). (2) The level of MDA: after the experiment, group I and group II changes were not obvious, and group III and IV showed a rising trend, and group IV > group III > group II and I (P<0.05). (3) The microscopic findings of the muscle tissue were increased with the increase of ischemia time, and the damage of the IV group was severe. But lung tissue injury only found in group III and IV, and gradually increased the level of blocking time.ConclusionRat skeletal muscle ischemia and after reperfusion tissue damage in accordance with the prolongation of ischemia time and aggravating, ischemia for 4 h and reperfusion 6 h can occurred with lung injury.

【Keywords】Skeletal muscle; Ischemia reperfusion injury; Lung injury; Lactate dehydrogenase; Malondialdehyde;Rats

收稿日期：(2015-05-28)

【DOI】10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.12.021

基金項(xiàng)目：河北省科學(xué)技術(shù)支撐項(xiàng)目(No.132777147)