左乙拉西坦對(duì)癲癇大鼠海馬組織中μ-calpain及caspase-3表達(dá)的影響①

韓麗萍，王海燕，喬　霜，鄒艷紅，裴艷瑩

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院, 黑龍江 佳木斯 154003；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157009)

?

左乙拉西坦對(duì)癲癇大鼠海馬組織中μ-calpain及caspase-3表達(dá)的影響①

韓麗萍1, 2，王海燕1，喬霜2，鄒艷紅1，裴艷瑩1

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院, 黑龍江 佳木斯 154003；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157009)

摘要：目的：通過(guò)觀(guān)察LEV對(duì)癲癇大鼠認(rèn)知情況及海馬組織中μ-calpain和caspase-3表達(dá)的影響，來(lái)探討LEV的抗癲癇作用及其機(jī)制。方法：取3周齡Wistar大鼠隨機(jī)分為4組：NS組、LEV組、Li-pilo組和Li-pilo+LEV組。采用氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)建立癲癇大鼠模型，建模成功24 h后，LEV組和Li-pilo+LEV組分別給予200 mg/(kgod) LEV。采用Morris水迷宮評(píng)價(jià)大鼠的學(xué)習(xí)與記憶的能力，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠海馬組織中的μ-calpain及caspase-3的表達(dá)水平。結(jié)果：①與NS組相比，LEV組的逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)無(wú)顯著差異 (P>0.05)；而與Li-pllo組相比，Li-pllo+LEV組的逃避潛伏期顯著縮短，而穿越平臺(tái)次數(shù)則顯著增加(P<0.05)，但未恢復(fù)到正常水平。②與NS組相比，LEV組的μ-calpain和caspase-3的蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化(P>0.05)；而與Li-pllo組相比，Li-pllo+LEV組的μ-calpain和caspase-3的蛋白表達(dá)則顯著減少(P<0.05)，但未恢復(fù)到正常水平。結(jié)論：LEV 可以改善癲癇大鼠的學(xué)習(xí)和記憶的能力，該作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)海馬組織中的μ-calpain及caspase-3的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞：左乙拉西坦；癲癇；μ-calpain；caspase-3

癲癇(epilepsy)是神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的疾病之一，全球約有3500萬(wàn)患者，患病率為5%～7%，而我國(guó)也約有650萬(wàn)患者正在遭受該病的困擾。癲癇是一組以腦部功能失常為特征的綜合征，具有突然的發(fā)作性，重復(fù)性，和短暫性為特點(diǎn)?？梢哉f(shuō)是兒童期最為常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。而癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus, SE)是癲癇的嚴(yán)重狀態(tài)，是癲癇反復(fù)發(fā)作或持續(xù)狀態(tài)，可以造成神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和壞死，并引起認(rèn)知功能的損害。左乙拉西坦(Levetiracetam, LEV)作為國(guó)際上公認(rèn)的一種抗癲癇藥物(antiepileptic drugs, AEDs)的新品種，憑借其獨(dú)特的抗癲癇機(jī)制，臨床效果的高效和安全性及良好的藥物動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，目前已經(jīng)在國(guó)內(nèi)和歐美廣泛應(yīng)用于對(duì)癲癇的治療。LEV具有抗癲癇和神經(jīng)保護(hù)雙重作用[1]。王海燕等[2]在研究中發(fā)現(xiàn)左乙拉西坦在治療癲癇的同時(shí),還會(huì)改善癲癇大鼠的認(rèn)知功能。張巖等[3]在左乙拉西坦對(duì)癲癇大鼠認(rèn)知功能的影響研究中也觀(guān)察到，左乙拉西坦可改善癲癇大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。本研究主要采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)LEV對(duì)癲癇大鼠海馬組織中μ-鈣蛋白酶(μ-calcium-activated non-lysosomal protease，μ-calpain)及半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)蛋白表達(dá)的影響，并采用Morris水迷宮法檢測(cè)大鼠空間記憶和學(xué)習(xí)能力，來(lái)探討LEV抗癲癇作用的機(jī)制及其對(duì)認(rèn)知的影響。

1　材料與方法

1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制備

取三周齡健康Wistar大鼠(55±10g)124只(佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，雌雄不限，隨機(jī)的分為4組：正常對(duì)照組(NS)28只，左乙拉西坦對(duì)照組(LEV)28只，癲癇對(duì)照組(Li-pilo)34只，左乙拉西坦治療組(Li-pilo+LEV)34只。

參考文獻(xiàn)[4]制備癲癇大鼠模型：Li-pilo組和Li-pilo+LEV組的大鼠首日腹腔注射1.27%氯化鋰127mg/kg，24h后再給予M膽堿受體阻滯劑丁溴東莨菪堿1mg/kg，30min后腹腔注射1% 匹羅卡品100mg/kg。觀(guān)察大鼠行為變化的情況。根據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[5]，將達(dá)到Ⅲ～Ⅴ級(jí)進(jìn)入癲癇持續(xù)狀態(tài)的大鼠歸于致癇成功組；未達(dá)到Ⅲ～Ⅴ級(jí)的大鼠，繼續(xù)注射匹羅卡品直至注射次數(shù)達(dá)到6次，若注射6次后仍未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，則歸于致癇不成功組，棄之不要。將造模成功大鼠繼續(xù)分為L(zhǎng)i-pilo組和Li-pilo+LEV組。NS組及LEV 對(duì)照組均在相同時(shí)間點(diǎn)給予等體積的生理鹽水。

1.2方法

1.2.1給藥方案

Li-pilo+LEV組和LEV組在成模24h后給予200mg/(kgod) LEV灌胃，Li-pilo組和NS組給予等體積的生理鹽水灌胃，每日在相同時(shí)間點(diǎn)給予一次灌胃。

1.2.2留取標(biāo)本及檢測(cè)指標(biāo)

(1)癲癇模型制備成功24h后，采用Morris水迷宮法每日測(cè)試各組大鼠的行為學(xué)指標(biāo)：①定位航行實(shí)驗(yàn)：每天分為2個(gè)時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段訓(xùn)練大鼠4次，一共需要4d完成，觀(guān)察并記錄大鼠在60s內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期，escapelatency)，反應(yīng)大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力；②空間搜索實(shí)驗(yàn)(spatial probe test)：即在第5d將平臺(tái)撤掉，觀(guān)察和記錄大鼠90s內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)，用于測(cè)量大鼠對(duì)空間位置的記憶能力。

(2)LEV給藥后的第7、14、28天每組隨機(jī)選取8只大鼠，給予10%水合氯醛麻醉之后，斷頭處死，分離出大鼠的海馬組織，在 -70℃給予保存，免疫組化染色法檢測(cè)大鼠海馬組織中μ-calpain及caspase-3的表達(dá)情況。

1.2.3檢測(cè)試劑

LEV購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；μ-calpain及caspase-3抗體及免疫組化試劑盒均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1Morris水迷宮測(cè)試

與NS組相比，LEV組的逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)無(wú)顯著差異 (P>0.05)；而與Li-pllo組相比，Li-pllo+LEV組的逃避潛伏期顯著縮短，而穿越平臺(tái)次數(shù)則顯著增加(P<0.05)，但未恢復(fù)到正常水平。見(jiàn)表1。

表1　各組Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較

組別逃避潛伏期時(shí)間(秒) 第1d 第2d 第3d 第4d穿越目標(biāo)次數(shù)(次)NS40.30±6.1332.54±5.4027.05±4.1620.66±3.215.31±0.84LEV39.89±5.5733.56±4.6229.55±4.0620.09±2.735.16±0.81Li-pllo50.76±5.52ab48.28±4.41ab46.21±4.33ab37.10±3.38ab2.68±0.35abLi-pllo+LEV45.64±5.96abc40.02±4.39abc37.25±4.27abc28.22±3.48abc4.28±0.41abcF值8.59518.91038.05149.96529.128P<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

注：a與NS組比較，P<0.05；b與LEV組比較，P<0.05；c與Li-pllo組比較，P<0.05。

2.2各組大鼠海馬組織中μ-calpain的表達(dá)

與NS組相比，LEV組的μ-calpain的表達(dá)無(wú)顯著變化 (P>0.05)；而與Li-pllo組相比，Li-pllo+LEV組的μ-calpain的表達(dá)則顯著下降(P<0.05)，但未恢復(fù)到正常水平。見(jiàn)表2。

表2　各組大鼠海馬組織中μ-calpain的表達(dá)(個(gè)/高倍視野)

注：a與NS組比較，P<0.05；b與LEV組比較，P<0.05；c與Li-pllo組比較，P<0.05。

2.3各組大鼠海馬組織中caspase-3的表達(dá)

與NS組相比，LEV組的caspase-3的表達(dá)無(wú)顯著變化 (P>0.05)；而與Li-pllo組相比，Li-pllo+LEV組的caspase-3的表達(dá)則顯著下降(P<0.05)，但未恢復(fù)到正常水平。見(jiàn)表3。

表3　各組大鼠海馬組織中caspase-3的表達(dá)(個(gè)/高倍視野)

注：a與NS組比較，P<0.05；b與LEV組比較，P<0.05；c與Li-pllo組比較，P<0.05。

3　討論

長(zhǎng)期頻繁的癲癇發(fā)作不僅可導(dǎo)致患者的智力及認(rèn)知功能?chē)?yán)重受損，更會(huì)對(duì)精神造成嚴(yán)重影響，最后逐漸喪失工作能力甚至生活能力,甚至危及生命。LEV自上市以來(lái)在治療兒童癲癇方面已表現(xiàn)出耐受性好、與其他AEDs藥物相互作用少以及對(duì)認(rèn)知功能影響小等優(yōu)勢(shì)[6，7]。王樹(shù)華等[8]在研究中發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元出現(xiàn)變性、死亡和細(xì)胞結(jié)構(gòu)瓦解現(xiàn)象。而μ-calpain和caspase-3都參與了癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷過(guò)程。Calpain廣泛存在于神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)。而caspases在細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中處于中心地位。有資料顯示，在由癲癇引起海馬神經(jīng)元丟失中，caspase-3發(fā)揮了重要的作用[9，10]。本研究結(jié)果反映了大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶能力和μ-calpain及caspase-3的改變存在密切聯(lián)系。與NS組相比，LEV 對(duì)照組的μ-calpain和caspase-3的表達(dá)量和 Morris 水迷宮測(cè)試結(jié)果全部無(wú)明顯差異；Li-pilo組的μ-calpain和caspase-3的表達(dá)量明顯升高，Morris 水迷宮測(cè)試也顯示其空間學(xué)習(xí)及記憶能力較差；經(jīng) LEV 治療后，Li-pilo+LEV組μ-calpain和caspase-3的表達(dá)量明顯降低，逃避潛伏期短，空間搜索能力強(qiáng)。提示LEV 對(duì)癲癇大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶能力無(wú)損害作用。LEV 可以改善癲癇大鼠的空間學(xué)習(xí)及記憶，記憶貯存及再現(xiàn)能力。它能使癲癇大鼠的逃避潛伏期縮短，而空間搜索能力增強(qiáng)。并且LEV的這種作用可能是通過(guò)減低癲癇大鼠海馬組織中μ-calpain和caspase-3蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。這將為臨床應(yīng)用LEV治療癲癇提供更有效的理論依據(jù)。

[1]Trojnar MK, Maek R, Chrocińska M, et al. Neuroprotective effects of antiepileptic drugs[J].Pol J Pharmacol,2002,54(6):557-566

[2]王海燕,王影,聶磊,等.左乙拉西坦對(duì)癲癇大鼠認(rèn)知功能及海馬組織中NPY和NCAM-mRNA表達(dá)的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2013,36(3):3-5

[3]張巖,王海燕,王影,等.左乙拉西坦對(duì)癲癇大鼠認(rèn)知功能的影響研究 [J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2013,36(2):6-8

[4]陳子怡, 陳樹(shù)達(dá), 周玨倩, 等. 匹羅卡品誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠模型的改良和鑒定[J]. 解剖學(xué)研究, 2011,33(2):131-149

[5]Racine RJ. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure[J]. Electroencephalogr Clin Neurophysiol, 1972,32(3):281-294

[6]Briggs DE1, French JA. Levetiracetam safety profiles and tolerability in epilepsy patients[J]. Expert Opin Drug Saf，2004，3(5):415-424

[7]Grosso S, Franzoni E, Coppola G, et al. Efficacy and safety of levetiracetam: an add-on trial in children with refractoryepilepsy[J].Seizure, 2005,14(4):248-253

[8]王樹(shù)華. 癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬神經(jīng)元程序性死亡與μ-calpain相關(guān)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D]. 山東:山東大學(xué),2008

[9]Henshall DC, Chen J, Simon RP. Involvement of caspase-3-like protease in the mechanism of cell death following focally evokedlimbic seizures[J].J Neurochem,2000,74(3):1215-1223

[10]Kondratyev A, Gale K. Intracerebral injection of caspase-3 inhibitor prevents neuronal apoptosis after kainic acid-evoked status epilepticus[J].Brain Res Mol Brain Res,2000,75(2):216-224

中圖分類(lèi)號(hào)：R742.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0104(2015)06-0061-03

作者簡(jiǎn)介：①韓麗萍(1979~) 女，黑龍江牡丹江人，學(xué)士，主治醫(yī)師。

通訊作者：鄒艷紅(1978~)女，黑龍江佳木斯人，碩士, 主治醫(yī)師。E-mail：25582393@qq.com。

(收稿日期：2015-03-17)