半胱氨酸蛋白酶抑制劑C與缺血性腦卒中的關(guān)系研究

張雪鈺　王俊梅　吳迎春(通訊作者)　王　哲

內(nèi)蒙古鄂爾多斯市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科　鄂爾多斯　017000

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半胱氨酸蛋白酶抑制劑C與缺血性腦卒中的關(guān)系研究

張雪鈺王俊梅吳迎春(通訊作者)王哲

內(nèi)蒙古鄂爾多斯市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科鄂爾多斯017000

【摘要】腎功能不全是缺血性腦卒中重要危險因素之一，而半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(cystatin C，cys C)是目前檢測腎功能的靈敏指標(biāo)。cys C作為最主要的內(nèi)源性組織蛋白酶抑制劑，參與炎癥、動脈粥樣硬化及心腦血管疾病的病理、生理過程；可預(yù)測急性冠狀動脈綜合征的發(fā)生和預(yù)后，預(yù)測冠心病患者冠狀動脈病變的廣度、心力衰竭及全因死亡的風(fēng)險。但在缺血性腦卒中方面cys C是缺血性腦卒中的危險因素還是保護(hù)因素目前仍存在爭議。明確其與缺血性腦卒中的聯(lián)系，可為缺血性腦卒中的早期預(yù)防和治療提供參考。

【關(guān)鍵詞】半胱氨酸蛋白酶抑制劑C；腦卒中；腦缺血；動脈粥樣硬化；基因多態(tài)性

腦卒中已成為我國城鄉(xiāng)居民的第一大死亡原因，同時也是單病種致殘率、致死率最高的疾病。2005年我國約200萬患者因腦卒中而死亡，占總病死率的22.5%[1]。缺血性腦卒中是一種由多種危險因素導(dǎo)致的臨床綜合征，動脈粥樣硬化是缺血性腦卒中發(fā)生和發(fā)展的重要病理生理基礎(chǔ)。最近研究表明[2-4]，半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(cystatin C，cys C)，又稱胱抑素C，作為最主要的內(nèi)源性組織蛋白酶抑制劑，與同型半胱氨酸、半胱氨酸蛋白酶和組織蛋白酶相互作用，參與炎癥反應(yīng)、動脈粥樣硬化以及心腦血管等疾病的病理、生理過程。cys C是目前對腎功能檢測最靈敏的指標(biāo)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于腎臟疾病的診斷和治療監(jiān)測。cys C可以發(fā)現(xiàn)臨床上不能被尿素、血清肌酐檢測到的早期腎功能不全[5]。研究表明[6]，慢性腎病與腦卒中呈明顯相關(guān)，腎功能不全是腦卒中重要的危險因素之一[7-8]。探討cys C與缺血性腦卒中的關(guān)系及其指標(biāo)是否可作為早期診斷缺血性腦卒中的生物學(xué)指標(biāo)，從而進(jìn)一步鑒別腦卒中高風(fēng)險病人，具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義，同時為缺血性腦卒中的防治提供新思路和流行病學(xué)線索。目前，關(guān)于cys C的研究主要集中在腎臟疾病、冠心病、腦淀粉樣變性和阿爾茲海默病(AD)方面。在腦卒中領(lǐng)域，cys C與缺血性腦卒中的研究較少。本文對cys C的生物特性及其基因多態(tài)性在心腦血管病，尤其在缺血性腦卒中中的作用作一綜述。

1cys C的概述

1.1cys C的命名1961年，Clauson等[9]發(fā)現(xiàn)健康人腦脊液中存在一種堿性蛋白質(zhì)，將其命名為γ-CFS。隨后，Macpherson等[10]也證實(shí)了這種蛋白質(zhì)的存在。1981年，Barrett等[11]確定其氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其與哺乳動物胱蛋白A和B有相似結(jié)構(gòu)及活性，并首次將這種蛋白質(zhì)命名為“cystatin”。1983年，Barrett等[12]將這種蛋白質(zhì)正式命名為cystatin C。

1.2cys C的生物特性及編碼基因cys C是半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族2中的成員之一，是一種限制性超家族蛋白質(zhì)，包括5個成員，其中超家族2為典型的分泌蛋白，有信號肽，在細(xì)胞外發(fā)揮作用。cys C是目前發(fā)現(xiàn)的對組織蛋白酶B抑制作用最強(qiáng)的抑制物，是哺乳動物胞外半胱氨酸蛋白酶的主要抑制劑，是一種含120個氨基酸殘基多肽鏈的非糖基堿性蛋白，其基因位于20號染色體短臂上，分子量約13 u，是一種分泌性蛋白質(zhì)[13]。

cys C編碼基因稱為CST3，位于染色體20pll.2，為全長7292 bp的管家基因，包括3個外顯子，2個內(nèi)含子。不含經(jīng)典的CAAT盒，其啟動子在轉(zhuǎn)錄區(qū)域沒有CAAT盒存在的GGGCGG區(qū)帶和富含AT序列，而其所含GATAAA位點(diǎn)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合點(diǎn)2D相似，也是轉(zhuǎn)錄因子AP-2(activator protein-2)、激活蛋白和MEP-1(metal element protein-1)的結(jié)合位點(diǎn)。該基因在體內(nèi)所有有核細(xì)胞中均能轉(zhuǎn)錄、翻譯出含26個氨基酸殘基的N端信號肽的前體蛋白，進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后信號肽被信號肽酶切除降解，而多肽則折疊成功能構(gòu)象分泌到細(xì)胞外液中。體外試表明，CST3能抑制多種類型半胱氨酸蛋白酶，包括組織蛋白酶B、H、K、L和S，并像管家基因一樣無所不在的表達(dá)[14]。

1.3cys C的生理功能cys C的重要功能是抑制內(nèi)源性的半胱氨酸蛋白酶活性，如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶及組織蛋白酶，在細(xì)胞內(nèi)肽類和蛋白質(zhì)代謝中均起重要作用。研究顯示[15]，Cys C有抗病毒和抗原蟲感染的能力，cys C及其片段因能影響中性粒細(xì)胞的吞噬和趨化功能，所以還參與動脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)過程及參與到細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生和降解的動態(tài)平衡。它存在于所有的體液中[16]，以精液中濃度最高，其次為腦脊液，濃度是血液中的5倍，再次是血液、尿液、唾液等。血清中主要來源于有核細(xì)胞的血細(xì)胞。在幾乎所有組織中恒定，性質(zhì)穩(wěn)定，持續(xù)轉(zhuǎn)錄表達(dá)，無組織特異性，24 h晝夜節(jié)律變化波動很小[17]。表達(dá)最多的主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、甲狀腺及胰腺中[18]。另外，cys C可以自由通過腎小球?yàn)V過膜，在近端腎小管完全重吸收并分解，既不會從腎小管分泌，也不會從腎小管重新進(jìn)入血液，且不受年齡、性別、炎癥、感染、腫瘤、肌肉量及肝功能等因素的影響，是目前對腎功能檢測最靈敏的指標(biāo)，臨床上可以在尿素、血清肌酐檢測腎功能不全之前就出現(xiàn)異常[5]。2004年美國FDA批準(zhǔn)將它作為檢測腎功能的指標(biāo)之一。

1.4cys C的基因多態(tài)性CST3多態(tài)性已成為近年來的研究熱點(diǎn)，到目前為止，在CST3基因中已有超過100種的單核苷酸多態(tài)性 (single nucleotide polymorphism，SNPs)被確定，但大多數(shù)研究集中在阿爾茲海默病及心血管病，CST3在5’上游有3個ksp I限制性多態(tài)位點(diǎn)(CCGCGG)，其中2個位于5’側(cè)翼啟動子區(qū)，另外1個位于外顯子1的信號肽區(qū)，由于連鎖的不平衡性，3個CST3的多態(tài)位點(diǎn)只產(chǎn)生了2個通常所見的單倍型：CST3 A(-157、-72、+73位點(diǎn)核苷酸分別為G、A、G)和CST3 B(C、C、A)。

在阿爾茲海默病(AD)方面，多數(shù)國外學(xué)者認(rèn)為單倍型純合子CST3 B是AD獨(dú)立且強(qiáng)有力的危險因素[19-20]。 Bertram等[21]將基于2005-12-01 AlzGene的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行Meta分析，其中13個基因的24個多態(tài)性與散發(fā)性AD易感基因相關(guān)，這其中包括CST3。Finckh等[12]指出CST3的單倍型純合子CST3 B基因型優(yōu)勢比從2.6(<75歲組)上升到8.8(>75歲組)，成為遲發(fā)性AD特別是>75歲患者的1個易患基因；并指出CST3 B是AD的第1個常染色體隱形遺傳的風(fēng)險等位基因。

在冠心病方面，已研究出7種基因型會影響血清水平：-5G/A、-78T/G、+87C/T、+213G/A、+148G/A、+4A/C、-82G/C。Eriksson等[23]通過對237例冠心病患者和868例健康人群CST3基因及cys C血清水平的研究發(fā)現(xiàn)，cys C的濃度在攜帶基因突單倍體(+148G/A，P<0.001)的患者明顯低于其他基因型的健康人群，同時還發(fā)現(xiàn)2個突變單倍體(-82G/C和-78T/G)人群冠狀動脈狹窄數(shù)目明顯增高，表明CST3基因多態(tài)性對冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有重要影響。然而，Loew等[24]在對1 013個冠心病患者進(jìn)行3 a隨訪的前瞻性隊(duì)列研究中發(fā)現(xiàn)，CST3基因-82G/-5G/+4A單倍體與血清cys C濃度高度相關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)血清cys C基因多態(tài)性與心血管事件的相關(guān)性。cys C基因多態(tài)性+148G/A(rs1064039)，位于編碼區(qū)，基因突變可導(dǎo)致其-2位信號肽由蘇氨酸突變?yōu)楸彼醄23]，并能引起cys C的變化和分泌[25]，由此推測這種基因多態(tài)性可能會引起血清cys C水平的變化，可能參與動脈粥樣硬化的發(fā)生。

2cys C與動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化是導(dǎo)致心腦血管疾病一個非常復(fù)雜的過程，是當(dāng)今文明社會的主要死亡原因。主要發(fā)生在大中型動脈，以內(nèi)皮功能障礙、血管炎癥、脂質(zhì)和膽固醇、鈣在血管壁內(nèi)膜的沉積為特征，這些因素導(dǎo)致斑塊形成、血管重建，最終致急性和慢性的血管管腔阻塞。目前大量研究發(fā)現(xiàn)[15，26-27]，cys C及其降解產(chǎn)物也對中性粒細(xì)胞的吞噬和趨化產(chǎn)生一定的影響，參與炎癥反應(yīng)的過程及細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生和降解的動態(tài)平衡，而動脈硬化的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞外基質(zhì)降解以及血管壁重構(gòu)密切相關(guān)[4，28-30]。另一項(xiàng)研究[29]顯示，CST3水平減少與彈性蛋白和膠原蛋白的大量破壞有關(guān)，而過度的組織蛋白酶K和S表達(dá)也與動脈壁的損傷有關(guān)，從而也說明cys C與動脈粥樣硬化有密切關(guān)系。

大量研究發(fā)現(xiàn)[4，28-29]，cys C與動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)；與冠狀動脈[30]、外周動脈[31]病變有良好的相關(guān)性；可以預(yù)測急性冠狀動脈綜合征的發(fā)生和預(yù)后，預(yù)測冠心病患者冠狀動脈病變的廣度、心力衰竭及全因死亡的風(fēng)險[3，32-35]。另有研究發(fā)現(xiàn)[36]，cys C與無癥狀性頸動脈粥樣硬化患者再發(fā)血管事件明顯相關(guān)。Watanabe等[37]對60例原發(fā)性高血壓患者研究顯示，頸動脈內(nèi)-中膜厚度(intima-media thickness，IMT)與血漿cys C水平存在顯著相關(guān)性。cys C表達(dá)失衡是動脈粥樣硬化發(fā)生與發(fā)展的重要因素之一，它可能參與了心腦血管疾病的病理過程，與神經(jīng)細(xì)胞失調(diào)和神經(jīng)元損傷有關(guān)[23]。因此，推測cys C可能參與炎癥反應(yīng)，而導(dǎo)致腦卒中的發(fā)生。

但也有研究有不同的意見，李輝等[38]對226例急性缺血性腦卒中患者(172例存在頸動脈斑塊，54例無斑塊；存在頸動脈斑塊的患者中，94例為穩(wěn)定性斑塊，78例為易損斑塊)進(jìn)行回顧性分析顯示，雖然頸動脈斑塊組血漿cys C水平較無斑塊組顯著性增高，但在校正其他混雜因素后，血漿cys C濃度與頸動脈斑塊無顯著獨(dú)立相關(guān)性(P=0.217)；也為發(fā)現(xiàn)其與斑塊穩(wěn)定性及頸動脈IMT之間存在相關(guān)性。另外，多種族動脈粥樣硬化研究(Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis，MESA)[39]，采用交叉設(shè)計方案探討血漿cys C水平與頸動脈IMT的關(guān)系，共納入6 557例無心血管臨床癥狀的患者，結(jié)果顯示，血漿cys C水平與IMT并不存在獨(dú)立性。

3cys C與缺血性腦卒中

目前cys C水平對缺血性腦卒中的影響尚有爭議。Seliger等[7]在對cys C與亞臨床型腦梗死(無臨床癥狀但影像學(xué)可以看到梗死灶)的關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)，血清cys C濃度與亞臨床型腦梗死發(fā)病相關(guān)，cys C表達(dá)水平增高是亞臨床型腦梗死的一個危險因素。Ni等[4，40]關(guān)于cys C與缺血性腦卒中的相關(guān)性研究認(rèn)為，血清cys C水平與缺血性腦卒中明顯相關(guān)，與對照組相比，缺血性腦卒中后血清cys C水平都有不同程度的升高，且癥狀越重，梗死面積越大，血清cys C水平升高越明顯[41-43]。

然而，另有部分研究認(rèn)為[44-45]，腦梗死患者空腹血清cys C水平低于正常對照組，提示cys C可能是腦梗死發(fā)病的保護(hù)因素。

在基礎(chǔ)研究方面，彭靜華等[46]應(yīng)用線栓法建立大鼠大腦中動脈閉塞及再通模型。研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)腦室給予抑制劑，應(yīng)用HE、免疫組化、原位末端標(biāo)記(TUNEL)染色及電鏡觀察大鼠大腦中動脈栓塞1 h后再灌注6 h、12 h、24 h、48 h、72 h半胱氨酸蛋白酶-3和上皮性鈣黏附蛋白的表達(dá)及神經(jīng)元凋亡程度的變化，結(jié)論認(rèn)為半胱氨酸蛋白酶-3后繼上皮性鈣黏附蛋白的激活參與了鼠腦再灌注神經(jīng)元的凋亡，半胱氨酸蛋白酶-3抑制劑能一定程度降低缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡，起到神經(jīng)保護(hù)作用，此結(jié)論得到一致認(rèn)可[47-48]。

王曉勤等[49]通過對76例健康對照者及84例腦梗死住院患者清晨空腹全血血清cys C含量的測定發(fā)現(xiàn)，腦梗死患者空腹血清cys C濃度低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，cys C血清水平與腦梗死發(fā)病呈負(fù)相關(guān)(r=-0.238，P=O.002)，所以認(rèn)為cys C可能是腦梗死發(fā)病的一種保護(hù)因素。cys C是在缺血性腦卒中發(fā)病機(jī)制的保護(hù)性因素還是危險因素目前不太明確，有待進(jìn)一步研究。

4結(jié)語與展望

血清cys C雖是腎臟功能的一項(xiàng)重要的檢測指標(biāo)，不僅在腎臟疾病中顯示其特異性，而且越來越多的研究發(fā)現(xiàn)其與心血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等發(fā)生發(fā)展有關(guān)。缺血性腦卒中的高發(fā)病率、高病死率、高致殘率及高復(fù)發(fā)率給社會、家庭和患者帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和巨大的精神壓力，開展血清胱抑素C與缺血性腦卒中發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究對其防治具有重大的經(jīng)濟(jì)和社會意義。

人類基因多態(tài)性的研究在闡明人體對疾病的易感性、耐受性和臨床表現(xiàn)的多樣性上發(fā)揮了重要的作用，在疾病基因多態(tài)性研究能推斷不同個體在同樣的致病條件下出現(xiàn)的不同病理反應(yīng)和臨床表現(xiàn)，并對其并發(fā)癥的防治提供更加合理的基因水平的理論依據(jù)。cys C及基因多態(tài)性與缺血性腦卒中相關(guān)性研究的開展，對其發(fā)病機(jī)制、不同病因分型以及及早發(fā)現(xiàn)腦卒中高風(fēng)險病人具有重要臨床和現(xiàn)實(shí)意義。

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(收稿2014-12-10)

【中圖分類號】R743.3

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1673-5110(2016)03-0098-03