高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測(cè)定黃芪中單糖和雙糖的含量

李　芳，胡容峰，黃麗丹，王　斌

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生部，安徽 合肥　230038； 2.省部共建新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

安徽 合肥　230038；3.安徽省“115”新安醫(yī)藥研究與開發(fā)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，安徽 合肥　230038；4.安徽省

中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥　230012；5.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥　230051)

?

高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測(cè)定黃芪中單糖和雙糖的含量

李芳1，2，胡容峰2，3，4，黃麗丹5，王斌2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生部，安徽 合肥230038； 2.省部共建新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

安徽 合肥230038；3.安徽省“115”新安醫(yī)藥研究與開發(fā)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，安徽 合肥230038；4.安徽省

中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230012；5.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥230051)

[摘要]目的采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法建立黃芪中單糖和雙糖含量的測(cè)定方法。方法色譜柱為Waters X BridgeTM氨基柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水(70∶30)，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器參數(shù)：霧化器溫度為50 ℃，漂移管溫度為90 ℃，氣體流量為1.60 L/min，增益值為1.0。結(jié)果果糖、蔗糖和麥芽糖分別在0.10~0.90 μg(r=0.999 9)、1.00~9.00 μg(r=0.999 6)、0.25~2.25 μg(r=0.999 4)范圍內(nèi)其對(duì)數(shù)值與峰面積的對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系；平均回收率分別為97.97%(RSD=1.56%)、97.82%(RSD=1.53%)、97.36%(RSD=1.59%)。結(jié)論所建立的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于黃芪中單糖和雙糖的含量測(cè)定。

[關(guān)鍵詞]黃芪；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法；果糖；蔗糖；麥芽糖

中藥復(fù)方腦絡(luò)欣通是著名新安醫(yī)家王樂匋先生針對(duì)缺血性中風(fēng)而創(chuàng)立的臨床驗(yàn)方，黃芪是復(fù)方腦絡(luò)欣通中君藥[1]。黃芪是豆科草本植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge. var. mongholicus(Bge.)Hsiao或莢膜黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的根，具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血等功效[2],臨床上應(yīng)用于治療病毒性心肌炎、糖尿病、炎癥和腫瘤[3-6]。

黃芪藥材中含有豐富的糖類成分，測(cè)定糖類成分的含量常用的方法是比色法，此方法穩(wěn)定性和操作精密度都較差，且只能測(cè)定總糖含量，不能分析糖的種類，高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)可改善以上不足[7]。目前針對(duì)黃芪中糖類成分的研究主要集中在多糖方面，而對(duì)于單糖和雙糖的研究報(bào)道卻很少。本實(shí)驗(yàn)中筆者采用HPLC和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(evaporative light scattering detector，ELSD)建立了黃芪中單糖和雙糖含量的測(cè)定方法。

1儀器與試藥

1.1儀器Agilent 1260高效液相色譜儀和Agilent380-ELSD檢測(cè)器：美國(guó)安捷倫公司；Waters X BridgeTM氨基柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)：美國(guó)沃特世公司；ML204型電子天平：瑞典METTLER TOLEDO公司；HH-S2系列恒溫水浴鍋：江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；WB-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；Heraeus Multifuge X1R離心機(jī)：賽默飛世爾科技公司；KQ-2200 型超聲波清洗器：江蘇省昆山市超聲儀器有限公司。

1.2試藥果糖對(duì)照品(批號(hào) 100231-200904，供含量測(cè)定用)、蔗糖對(duì)照品(批號(hào) 111507-201303，供含量測(cè)定用)和麥芽糖對(duì)照品(批號(hào) 100287-201102，供含量測(cè)定用)：均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；黃芪(產(chǎn)地為內(nèi)蒙古，批號(hào) 12091301)：購(gòu)于合肥樂家老鋪中藥飲片有限公司；乙腈：色譜純，瑞典；水為純化水；其他試劑為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱為Waters X BridgeTM氨基柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水(70∶30)，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃。ELSD參數(shù)：霧化器溫度為50 ℃，漂移管溫度為90 ℃，蒸發(fā)器氣流為1.60 L/min，增益值為1.0。此條件下HPLC色譜圖見圖1。

2.2對(duì)照品溶液的配制精密稱取適量果糖、蔗糖、麥芽糖對(duì)照品，分別置于容量瓶中，加入純化水配成濃度分別為0.10 mg/mL的果糖溶液、1.00 mg/mL的蔗糖溶液、0.25 mg/mL的麥芽糖溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，作為對(duì)照品溶液。

圖1果糖對(duì)照品(A)、蔗糖對(duì)照品(B)、麥芽糖對(duì)照品(C)和黃芪樣品(D)的高效液相色譜圖

2.3供試品溶液的制備取黃芪藥材2.0 g，置于圓底燒瓶中，加50 mL水回流提取2次，第1次2 h，第2次1 h，過濾后，合并濾液，將以上濾液濃縮至50 mL后，向其中加入Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)10 mL，劇烈振搖混勻后，在3 000 r/min下離心10 min，收集上層水相溶液同法反復(fù)除蛋白4次后，將上層溶液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻后，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。

2.4線性范圍考察分別進(jìn)樣果糖、蔗糖、麥芽糖對(duì)照品溶液1、3、5、7、9 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積的常用對(duì)數(shù)值(y)為縱坐標(biāo)，以果糖、蔗糖、麥芽糖進(jìn)樣量的常用對(duì)數(shù)值(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得果糖回歸方程為y=0.994 8x+2.018 6(r=0.999 9)，蔗糖回歸方程為y=0.993 2x+2.552 1(r=0.999 6)，麥芽糖回歸方程為y=0.997 2x+2.236 2(r=0.999 4)。結(jié)果表明果糖、蔗糖、麥芽糖進(jìn)樣量分別在0.10~0.90 μg、1.00~9.00 μg、0.25~2.25 μg范圍內(nèi)其對(duì)數(shù)值與峰面積的對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系。

2.5精密度試驗(yàn)分別取同一對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，進(jìn)樣量為5 μL，記錄峰面積，計(jì)算得果糖、蔗糖、麥芽糖峰面積的RSD分別為1.70%、1.32%、1.51%。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品5份，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備5份供試品溶液，分別進(jìn)樣5 μL，記錄峰面積，計(jì)算得果糖、蔗糖、麥芽糖含量的RSD分別為1.13%、1.37%、1.29%。結(jié)果表明，此方法重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一份供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、16、24 h各進(jìn)樣1次，進(jìn)樣量為5 μL，記錄峰面積，計(jì)算得果糖、蔗糖、麥芽糖峰面積的RSD分別為1.63%、1.38%、1.44%。結(jié)果表明，樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn)分別稱取已知果糖、蔗糖、麥芽糖含量的樣品6份，每份0.20 g，分別加入果糖(5 mg/mL)、蔗糖(20 mg/mL)、麥芽糖(5 mg/mL)對(duì)照品溶液1.13、2.85、1.16 mL，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備加樣回收率供試液，分別進(jìn)樣5 μL，記錄峰面積，計(jì)算回收率。得果糖、蔗糖、麥芽糖的平均回收率分別為97.97%(RSD=1.56%)、97.82%(RSD=1.53%)、97.36%(RSD=1.59%)。

2.9樣品含量測(cè)定將已制備的供試品溶液注入高效液相色譜儀中，進(jìn)樣量為5 μL，按照上述色譜條件測(cè)定黃芪樣品中果糖、蔗糖、麥芽糖，計(jì)算得黃芪樣品中果糖含量是2.84%，蔗糖含量是4.25%，麥芽糖含量是2.92%。

3討論

本課題組前期實(shí)驗(yàn)已對(duì)樣品溶液的制備和色譜條件進(jìn)行了優(yōu)選。對(duì)不同提取溶劑制備的樣品溶液進(jìn)行反復(fù)考察，最終選擇水為提取溶劑。水提取后用Sevage試劑除去其中蛋白，防止產(chǎn)生干擾，此方法所制備的樣品溶液中雜質(zhì)較少。流動(dòng)相為乙腈-水時(shí)，樣品中各色譜峰分離較好。對(duì)霧化器和漂移管的溫度進(jìn)行考察，優(yōu)選溫度分別為50 ℃和90 ℃。對(duì)色譜柱的類型進(jìn)行考察，分別使用Waters公司的氨基柱、Global公司的C18色譜柱和Welch公司的C8色譜柱進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，Waters公司的氨基柱分離效果較好。

由于糖類物質(zhì)在紫外區(qū)沒有響應(yīng)，若用紫外檢測(cè)器，需要對(duì)糖類成分進(jìn)行衍生化，衍生化反應(yīng)可能會(huì)衍生不徹底，增加含量測(cè)定的誤差。ELSD可測(cè)定無紫外吸收的物質(zhì)，無需衍生化反應(yīng)，可直接測(cè)定糖類成分的含量。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)以果糖、葡萄糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖對(duì)黃芪樣品進(jìn)行定性分析，結(jié)果顯示，樣品中含有果糖、葡萄糖和蔗糖。故選擇果糖、葡萄糖和蔗糖作為對(duì)照品。

本實(shí)驗(yàn)中筆者采用HPLC-ELSD所建立的黃芪中果糖、蔗糖和麥芽糖含量測(cè)定方法，具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，可為研究黃芪糖類成分提供一種新的方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]王鍵，譚輝，胡建鵬，等.腦絡(luò)欣通對(duì)大腦中動(dòng)脈閉塞缺血再灌注損傷模型大鼠空間認(rèn)知功能和局部腦血流量的影響[J].中醫(yī)雜志，2013，54(8)：687-690.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：283-284.

[3]丘銀冰，李小林，陳秀連，等.黃芪治療病毒性心肌炎51例體會(huì)[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2007，4(3)：80.

[4]Sang Z，Zhou L，F(xiàn)an X，et al. Radix Astragali(Huangqi)as a treatment for defective hypoglycemia counterregulation in diabetes[J].Am J Chin Med，2010，38(6)：1027-1038.

[5]Lee DY，Noh HJ，Choi J. Anti-inflammatory cycloartane-type saponins ofAstragalusmembranaceus[J].Molecules，2013，18(4)：3725-32.

[6]Yang B，Xiao B，Sun T. Antitumor and immunomodulatory activity ofAstragalusmembranaceuspolysaccharides in H22 tumor-bearing mice[J]. Int J Biol Macromol，2013， 62：287-290.

[7]張國(guó)偉，李彩霞，王艷峰，等.高效液相法與硫酸-蒽酮法測(cè)定豬苓多糖含量比較[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2011，23(12)：1099-1102.

Determination of Monosaccharide and Disaccharide inAstragalusmembranaceusby High-performance Liquid Chromatography with Evaporative Light-scattering Detector

LIFang1,2,HURong-feng2,3,4,HUANGLi-dan5,WANGBin2

(1.GraduateDivisionofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China; 2.KeyLaboratoryofXin’anMedicineJointlySupportedbyMinistryofEducationandAnhuiProvince,AnhuiHefei230038,China; 3.Anhui“115”Xin’anTraditionalChineseMedicalResearch&DevelopmentInnovationTeam,AnhuiHefei230038,China; 4.AnhuiProvinceKeyLaboratoryofR&DofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 5.AnhuiInstituteforFoodandDrugControl,AnhuiHefei230051,China)

[Abstract]Objective To establish the method for determining the content of monosaccharide and disaccharide in Astragalus membranaceus by high-performance liquid chromatography with evaporative light-scattering detector (HPLC-ELSD). MethodsHPLC parameters were as follows: Waters X BridgeTMamino column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) as the chromatographic column; acetonitrile-water (70∶30) as the mobile phase; flow rate 1.0 mL/min; column temperature 30 ℃. ELSD parameters were as follows: nebulizer temperature 50 ℃; drift tube temperature 90 ℃;gas flow rate 1.60 L/min; gain 1.0. ResultsFructose,sucrose,and maltose showed a good linear relationship between the logarithmic values of content and peak area within 0.10-0.90 μg (r=0.999 9),1.00-9.00 μg (r=0.999 6),and 0.25-2.25 μg (r=0.999 4),and the average recovery rates were 97.97% (relative standard deviation (RSD)=1.56%), 97.82% (RSD=1.53%), and 97.36% (RSD=1.59%), respectively. ConclusionThe established HPLC-ELSD method is simple, accurate, and repeatable, and can be used for determining the content of monosaccharide and disaccharide in Astragalus membranaceus.

[Key words]Astragalus membranaceus; high-performance liquid chromatography with evaporative light-scattering detector; fructose; sucrose; maltose

收稿日期：(2014-04-11；編輯：曹健)

通信作者：胡容峰，hurongfeng@163.com

作者簡(jiǎn)介：李芳(1988-)，女，碩士研究生

[中圖分類號(hào)]R927.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.02.024

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAI26B03)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81274100)；安徽省學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人及后備人選學(xué)術(shù)科研活動(dòng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目(皖人社秘2011-381號(hào)-26)